Summary
For å opprettholde neuronal prosesser for ultra analyse, beskriver vi en protokoll for plettering av primære nerveceller for elektronmikroskopi gittere etterfulgt av flash-frysing, hvilket ga prøvene suspendert i et lag av glasslegemet is. Disse prøvene kan undersøkes med en Cryo-elektronmikroskop for å visualisere strukturer på nanometer skala.
Abstract
Neurites, både dendritter og aksoner, er nevronale cellulære prosesser som muliggjør gjennomføring av elektriske impulser mellom nerveceller. Definere strukturen av neurites er avgjørende for å forstå hvordan disse prosessene flytte materialer og signaler som støtter synaptisk kommunikasjon. Elektronmikroskopi (EM) har tradisjonelt blitt brukt til å vurdere de ultra funksjoner innen neurites, men kan eksponering for organiske løsemidler i løpet av dehydrering og harpiks embedding forvrenge strukturer. Et viktig udekket mål er utformingen av prosedyrer som gir mulighet for strukturelle evalueringer ikke påvirket av slike gjenstander. Her har vi etablert en detaljert og reproduserbar protokoll for dyrking og flash-frysing hele neurites av ulike primære nevroner på elektronmikros nett etterfulgt av sin undersøkelse med cryo-electron tomography (cryo-ET). Denne teknikken gjør det mulig for 3-D visualisering av frosne, hydrerte neurites på nanometer-oppløsning, tilrettelegging assevurdering av sine morfologiske forskjeller. Vår protokollen gir en enestående utsikt over dorsal root ganglion (DRG) neurites, og en visualisering av hippocampus neurites i sin tilnærmet opprinnelig tilstand. Som sådan, disse metodene skape et grunnlag for fremtidige studier på neurites av både normale nerveceller og de påvirket av nevrologiske lidelser.
Introduction
Nerveceller etablere komplekse kretsene viktig for funksjonen av det sentrale og perifere nervesystem ved å utarbeide dendritter å motta informasjon og aksoner, ofte ganske lang, for å kommunisere med nedstrøms nevroner. Neurite utvekst spiller en fundamental rolle under embryonal utvikling og neuronal differensiering og vedlikehold av neurites støtter kritisk funksjon i nervesystemet. Neuritic prosesser også kritisk i nevronale skader og regenerering, samt nervesystemet lidelser. Studiet av neuronal arkitekturen er viktig å forstå både normalt og sykt hjernen. Heldigvis, fysiologisk relevante nevronale cellekultursystemer finnes som kan rekapitulere komplekse og heterogene cellulære strukturer. Basert på klarlegging av faste eksperimentelle plattformer, effektive visualiseringsstrategier som gjør at kvalitative og kvantitative analyser av neuronal morfologi er nødvendig. Spesielt nyttig villevære en detaljert metodikk som gir en konsistent plattform for å visualisere neurites, både axoner og dendritter på nanometer skala.
Tradisjonelle elektronmikros krever bruk av organisk oppløsningsmiddel under dehydrering og harpiks innebygging, som kan fremkalle forstyrrelser i prøvene fra sin sanne tilstand. Til dags dato, er de fleste strukturelle karakteristikker på nanometer skala basert på større celler eller vev som er utsatt for slike sterke kjemikalier - og dermed begrense tolkningen av funnene 4,9,25. Videre, for elektronstrålegjennomtrengning, er snitte kreves for organismer eller cellulære fremspring som oppviser en tykkelse som er større enn 1 mikrometer 12.. Til slutt, seksjonert eller oppmalt vev resulterer i samling av diskrete stykkespesifikke datasett, slik tungvint definisjonen av den langstrakte trekk ved neurites. Selv for cryo-EM, der seksjonering en frossen hydrert prøven er mulig, introduserer metoden komprimering Artifopptrer en.
I de senere årene har forskere lært å vokse hippocampus nevroner direkte på EM nett og flash-fryse dem i flytende etan til senere å visualisere neurites hjelp cryo-ET 8,10,18,23. Men slike studier enten bruke en skreddersydd enhet 10,23, eller mangel detaljer om blotting skritt for å generere tynn nok glasslegemet isen for rutine visualisering 8,18. For eksempel anbefaler en studie på bruk av 30-40 sek for blotting EM grid 10, men er denne verdien optimalisert ikke for generell bruk, men er spesifikk for at skreddersydde stupe-frysing enhet. Ved hjelp av en skreddersydd enhet snarere enn et kommersielt tilgjengelig en 17 for å opprettholde fuktighet før stupe-frysing prøven kunne utgjøre et hinder for utbredt reproduserbarhet.
Mens disse studiene har vært banebrytende i å visualisere neurites av Cryo-ET, har vi tatt et skritt videre for å utforske applicability av cryo-ET til en rekke nevrale prøver (hippocampus og dorsal root ganglion nevroner). I tillegg diskuterer vi både optimale og suboptimale resultater, samt de potensielle gjenstander som man kunne støte på ved bruk cryo-ET for slike prøver.
Definere en detaljert teknikk for å bevare og visualisere hele neurites på nanometer skala i en tilnærmet opprinnelig tilstand ville styrke muligheten for flere forskere å utføre ultra studier. For å oppnå dette, beskriver vi en effektiv og detaljert protokollen med kommersielt tilgjengelig utstyr for å forberede ufestede, ufargede nevroner å visualisere neurites. Dette er et viktig første skritt mot detaljering ultrastructure av sunne neurites og å legge grunnlaget for å forstå hva slags strukturelle forskjellene er til stede i nervesystemet sykdom modeller. Siden Cryo-ET kan løse ufestede, ufargede neurite funksjoner i 3-D på nanometer skala, vil metoden gjør det mulig som aldri værederfor å definere neuritic arkitektur 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbereder Retter med EM Nett for plating Primær Neuroner
- Undersøk integriteten holey karbon på gull EM nett ved hjelp av et lysmikroskop ved en forstørrelse på minst 25X. Sørg for at karbon hullene er> 98% intakt.
- For plating primære nevroner, bruker en gassbrenner til å flamme-sterilisere EM nett og samtidig gjøre dem hydrofil. Bruk pinsett til å plukke opp EM rutenett i kanten, ikke den sentrale gridded området. FORSIKTIG: Forlat aldri et tent bunsenbrenner uten tilsyn, og ikke bruke hansker eller pinsett med plastkomponenter mens du utfører disse trinnene:
- Før du tenner gassbrenneren, sette luft-og gassjusteringen til en minimal åpen stilling.
- Tenn bunsenbrenner ved hjelp av en spiss flint eller butan lighter.
- Modifiser luft-og gass-justeringer for å oppnå en liten blå flamme indre i løpet av en høyere, lysere blå / fiolett flamme. Spissen av den indre flamme er den varmeste delen av flammen. Knotten etterneath brenneren justerer mengden av gass inn i brennerrøret, mens sylinderen av brenneren kan dreies for å justere mengden av luft som kommer inn i brenneren. Slå luftjusterings urviseren senker luft (som resulterer i en mørklilla flamme) og mot urviseren øker luft (resulterende i en gul flamme).
- Ved hjelp av metall pinsett (ingen plast deler) for å holde EM rutenett, passerer det raskt gjennom flammen to ganger, overfor karbon-siden opp. Karbon side vil vises mer matt (mindre skinnende) og med mer av en gråaktig farge enn den andre siden.
- Umiddelbart overføre risten (karbon-siden opp) inn i midten av glass-bunn fatet plasseres innenfor 10 cm fra gassbrenneren. Bruk en EM rutenett per parabolen (Figur 1). Bruk kun glass-bunn retter som er sterilisert, dvs. via gammastråling.
- Bruk en lys mikroskop for å se rutenettet integritet (karbon hull intakt), mens du fremdeles holder EM grid inne i glass bottOM fatet (for å unngå forurensning). Ved påføring av et stoff på nettet eller noe som vil komme i kontakt med nervecellene, bruk steril prosedyre og sterile pipetter.
- I en vevskultur hetten med steril prosedyre, anvende 250 pl av den aktuelle beleggstoffet langsomt og omhyggelig til den sentrale flate på petriskålen. Sørg for riktig belegg stoffet dekker hele EM rutenett.
- For hippokampale neuroner, bruker poly-L-lysin (PLL, 1 mg / ml) som beleggstoffet, fremstilt som tidligere beskrevet 19. Merk at 250 mL er nødvendig per EM rutenett, per tallerken, så skalere batch tilsvarende. For dorsal root ganglion (DRG) nevroner, bruke en geléaktig protein blanding utskilt av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkom celler (se tabell av materialer og reagenser) som belegg stoff, forberede som følger. Merk at 250 mL er nødvendig per EM rutenett, per tallerken, så skalere batch tilsvarende.
- Tine en aksje flaskeav den geléaktige protein blanding utskilt av Engelbreth-Holm-Swarm (HMS) muse sarkom celler over natten ved 4 ° C.
- Hold kaldt den geléaktige protein blanding utskilt av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkom celler, og alle komponenter som brukes for å gjøre løsningen, dvs. ved å holde dem på is.
- Mens på is, fortynnes denne geléaktige proteinblandingen i Neurobasal medium for å gi en 1:20 fortynning (dvs fortynn 500 pl av den geléaktige proteinblandingen inn i 10 ml av Neurobasal).
- Skille fortynnet gelatinøs proteinblandingen i 1 ml aliquoter og umiddelbart lagre noen ekstra alikvoter ved -20 ° C.
- Påfør 250 mL per EM rutenett, per fatet, som beskrevet i punkt 1.4.
- For hippokampale neuroner, bruker poly-L-lysin (PLL, 1 mg / ml) som beleggstoffet, fremstilt som tidligere beskrevet 19. Merk at 250 mL er nødvendig per EM rutenett, per tallerken, så skalere batch tilsvarende. For dorsal root ganglion (DRG) nevroner, bruke en geléaktig protein blanding utskilt av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkom celler (se tabell av materialer og reagenser) som belegg stoff, forberede som følger. Merk at 250 mL er nødvendig per EM rutenett, per tallerken, så skalere batch tilsvarende.
- Dekk petriskål med sin topp og inkuber (enten med PLL for hippocampus prøver, eller med gelatin proteinblandingen i DRG prøver) i 1 time ved romtemperatur i hetten vevskultur.
- Aspirangere alle PLL (for hippocampus eksemplarer) eller den geléaktige proteinblanding (for DRG prøver) fra rettene. For å gjøre dette, bruker vakuumsystemet i panseret vev kultur. Bruk av en steril pipette festet til vakuumslangen. Unngå direkte kontakt med EM-rutenettet.
- Bruk en regulerbar luft-fortrengning pipette for å nøye anvende 250 mikroliter sterilt PBS (fosfat-bufret saltløsning) til den EM-gitteret i den sentrale flate på hver Petri-skål, slik at EM gitteret er fullstendig dekket av PBS. Deretter aspirer PBS fra hver tallerken. Gjenta 3x.
- La det med EM-gittere for å tørke under vevskultur hette i 15 minutter. Sørg for at de er helt tørre ved å sjekke under lysmikroskop i vevet kultur rommet. Pass på at det ikke er noen bobler av fukt i nettet. I så nøye aspirat ved siden av EM rutenettet for å eliminere denne ekstra fuktighet. Den belagte gitteret skal brukes umiddelbart for plettering av neuroner.
2. Forberede og Plgen Primær Neuroner på EM Rister
- Til plate primære nevroner, første dissekere, trypsinize (med 2,5% trypsin) og triturate å distansere hippocampi (eller dorsal root ganglion av 18-dagers gamle rotte embryoer) i individuelle celler, som tidligere beskrevet 19.
- Triturate er et vanlig begrep som brukes av nevrobiologer å beskrive dissociating klumper av celler i individuelle celler, særlig ved bruk av et glass pipette med en brann-polert tips. Resultatet oppnås ved forsiktig og sakte å trekke og slippe i cellene, opp og ned, flere ganger (~ 30) via pipette.
- Følg fremgangsmåter som tidligere er beskrevet for DRG disseksjon og celleisolasjon 24, idet noten å bruke 0,25% trypsin (i HBSS) for å isolere de rotte DRG-neuroner, heller enn å bruke enzymer foreslått (papain, kollagenase / dispase) som er mer egnet for mus DRG nevroner.
- Beregne antall isolerte nerveceller (dvs. ved hjelp av en hemocytometer)og bruker denne verdi å beregne passende volum av celler til anvendelse til hver skål for å oppnå en konsentrasjon på 50 000 celler / ml pr fatet. Den maksimale volumet til å søke er 250 mL. Merk at dette bare fyller sentrale glass området, ikke hele fatet.
- Inkuber retter til 30 minutter i en CO-2-inkubator ved 37 ° C. Tillate celler til å komme seg og følge.
- Sakte legger 1,5 ml varmet media til hver rett, tar seg ikke å forstyrre EM rutenett. Den type media er avhengig av celletype (hippocampus eller DRG).
- Klargjør passende medier for enten hippocampus-neuroner 19 eller dorsal root ganglion neuroner 24, som er til å bli varmet i et 37 ° C vannbad før bruk. Inkuber rettene over natten i CO 2 inkubator.
- For hippocampus nevroner, endre media neste dag. Endring halvparten av mediet annenhver dag og fremover i 14 dager. Varm media på en 37 ° C vannbad før bruk. For DRG-neuroner, en dag etter disseksjon / plating, forberede en ny lager av mediet med et anti-mitotisk middel (Uridine og 5'-fluor-2'-deoksyuridin) utgjør en 10 mM stamløsning av hver, hver for seg, men det brukes en endelig konsentrasjon på 10 mM for hver. Fjern halvparten av DRG mediet (875 mL) og tilsett 875 ul av frisk media med anti-mitotisk middel.
- For DRG nevroner, hver to dager for den første uken, alternative skiftende medie mellom anti-mitotiske medier og standard DRG media. For andre uke, endre standard DRG media annenhver dag.
Tre. Vitrifying Nerveceller på EM Rister
- Forbered utstyr og alle materialer for frysing og lagring av gull EM rutenett på Cryogenic temperatur: en forglassing enhet med en luftfuktighet kammer 17, fin-point spesialiserte pinsett for forglassingsprosessen maskin, lange flate punkt pinsett, dewar (r) av flytende nitrogen (LN 2), coolant container, EM grid oppbevaringsboks, kalsium fritt filterpapir.
- Begynn forglassingsprosessen enheten. Sett fuktighet til 100% og temperaturen til 32 ° C. I "Console", angi blot tid til null sekunder. Dette gir mulighet for manuell blotting gjennom side-vinduet til forglassing maskinens fuktighetskammeret.
- Håndter kalsium fritt filterpapir med hansker, lagdeling dem slik at tre avisene er stablet. Skjær bunken inn 0,5 cm brede strimler som er ~ 2 cm lang. Bøye dem i en 90 ° vinkel, slik at den ene side av papiret har en 0,5 cm x 0,5 cm flate (fig. 2). Ved hjelp av pinsett, fjerner midten papir og plassere den på et annet kalsium fritt filterpapir før bruk.
- Sett risten lagring på knappeholderen innen forglassingsprosessen kammeret. Fylle det indre kammer av kjølebeholderen med flytende nitrogen og vente inntil fullstendig fordamping. Fyll ytre kammer av the kjølebeholder med flytende nitrogen inntil den oppnår stabil temperatur for å gå videre til neste trinn. Fylle det indre kammer med høy renhet gassformig etan som vil kondensere til flytende tilstand i det avkjølte kammeret.
- Flytt fatet (es) fra inkubatoren til en stor 100 mm polystyren parabolen for transport til forglassingsprosessen rommet, hvis ikke i umiddelbar nærhet. Bruk spesialiserte forglassing pinsett til forsiktig plukke EM rutenett fra fatet. Merk hvilken side nervecellene vokser på EM grid; stillingen vil saken for neste trinn. Bruk den svarte glidelåsen på pinsett for å sikkert låse pinsett på EM rutenett.
- Sett pinsetten inn i forglassing maskinen, slik at siden av EM rutenett på hvilke nervecellene blir fulgt flater mot venstre, bort fra side-åpningen hullet til forglassing maskinen. Trekk inn spesialiserte pinsett inn forglassingsprosessen maskinen.
- Plasser kjølebeholderen i den respektive holderav forglassing maskinen. Det bør bli fylt med tilstrekkelig LN 2 og flytende etan. Ved hjelp av den aktuelle skjermen kommando av forglassingsprosessen maskin, heve vannkammer oppover inntil den er spylt med bunnen av fuktighet kammer.
- Med de flate punkt pinsett, ta tak i den ene kanten av filterpapiret slik at kortsiden (de 0,5 cm x 0,5 cm ansiktet) er vinkelrett på pinsett. Denne ansikt vil komme i direkte kontakt med EM rutenett for blotting (fig. 2B). Sette inn filterpapiret forsiktig inn i side-hullet av forglassing maskinens fuktighetskammeret (figur 2A). Stabilt holde papiret mot EM grid (den siden som vender bort fra prøven) for 10 sek. Kast papiret etterpå og umiddelbart stupe-fryse prøven i flytende etan ved hjelp forglassingsprosessen maskinens automatisering.
- Overføre frossen hydrert EM grid nøye til et av sporene i en av degrid lagring knapper. Gjenta prosessen for flere EM-nett i rettene. EM grid lagring knapper som brukes i disse forsøkene kan lagre flere frosne hydrert EM nett.
4. Bildesamlingen, Processing, og annotering
- Fortsett å samle 2-D elektron mikrografer og / eller 3-D-vippe-serien 5 av de neurites ved hjelp av et cryo-elektronmikroskop under en lav-dose tilstand. De 2-D bilder ble beregnet for å vurdere kvaliteten av nettet i forhold til istykkelsen og de mulige områdene for å være nyttig for 3-D-vippe-serien.
- I dette tilfelle ble alle bildene innhentet ved hjelp av en 4K x 4k CCD-kamera festet til en 200 kV elektronmikroskop utstyrt med et enkelt vippe flytende nitrogen cryo overførings holder, ved 20k mikroskop forstørrelse på et mål underfocus av 7 mikrometer og sampling på 4,4 Å / pixel.
- For å skaffe en 3D-tomogram av prøven, kan en serie av projeksjonsbilder mens trinnvis vipping av prøve along en akse av transmisjonselektronmikroskop (TEM). Gitt de vinkler og andre eksperimentelle innstillinger, er det flere forskjellige programvare tilgjengelig for å automatisk samle tilt serien fem. Den 3-D tilt serien vist her ble samlet på samme mikroskop bruker semi-automatisert tilt serie oppkjøp programvare 26 over et område på -60 ° til 60 ° at 5 ° intervaller med en kumulativ dose av ~ 60 e / Å 2.
- Rekonstruere vippeserien av neurites ved hjelp av bildebehandling 21 som tidligere er beskrevet for andre prøver 5,29.
- Farge kommentere de 3-D funksjoner av neurites ved første segmentere tomogram og skape en overflate modell ved hjelp av en 3-D bildebehandling som tidligere beskrevet fem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før frysing og bildebehandling via Cryo-ET, bør lysmikroskop bilder tas av EM rutenett på hvilke nervecellene vokser. Neurites skal være godt synlig uten betydelig overlapping med hverandre. En farget boksen i figur 3A representerer et område som zoomes inn for å vise en større forstørrelse i figur 3B, hvor neurites strekker seg på tvers av flettverket av nettet. Hver grid-plassen er sammensatt av en holey carbon film som støtter nervecellene og deres neurites. Disse hull er synlige i en lav dose cryo-EM bilde tatt med 4k forstørrelse, som viser neuron kroppen som en relativt stor, mørk, elektron-tette objekt (figur 3C), hvorfra neurites prosjekt utover.
En del av neurite hviler over et hull i karbon er valgt på en farget ramme i figur 3C, og zoomet inn på et høyere forstørrelse (20k) på figur 3D. På denne forstørrelsen, bør klare interne cellulære strukturer inkludert mikrotubuli, blemmer, og mitokondrier tydelig fremgå (Figur 3D), spesielt i den optimalt tynn is som genereres ved å følge denne protokollen. De mørke sorte strukturer i midten av bildet (figur 3D) er sekskantet ispartikler som anses som forurensninger og bør vanligvis unngås, men siden de er meget tynt og utsiden av neurites selv, at de ikke forstyrrer gjenoppbygging og farge-annotering av de indre strukturer for analyse og tolkning (figur 4). En annen lav-dose, lav forstørrelse er vist i figur 5, hvor en neurite kan plasseres, hvoretter flere 2-D-bilder kan tas og digitalt sydd sammen ved hjelp av bildebehandling for å generere en montasje (figur 6).
Den innledendelav plating konsentrasjon (50 000 celler / ml per plate) av nerveceller på EM rutenett gjør det mulig for nerveceller som sitter langt nok fra hverandre for å sikre klar visualisering av sine neurites (Figur 3C); konsentrasjoner høyere enn anbefalt (> 50000 celler / ml per plate ) kan resultere i suboptimale bilder av overfylte neurites som er vanskelig å spore eller attributt cellulære komponenter (Tall 7B og 7C).
Figur 1. Ordningen for voksende nevroner på EM gittere i glassbunn retter. (A) med glassbunn retter vises, delvis fylt med cellemedier (rosa). (B) Hver rett inneholder ett gull EM rutenett, som en nærmere oversikt avslører. (C) Belegg av EM rutenett med poly-lysin er vist som en tegneserie side-cutaway. Den glassbunn fatet er sammensatt av en firkantet glass dekkglass som er festet til bunnen av et plastdyrkningsskål, som dekker en sirkulær åpning som opprinnelig ble kuttet ut av bunnen. Disse glassbunn retter er gamma sterilisert og kommersielt kjøpt som forhåndslagde. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Skjematisk for manuell blotting av EM rutenett med nevroner levd. (A) nærbilde forglassingsprosessen maskinens skyve oppføring slot (svart pil) til fuktighet / blotting kammer, der pinsett vil bli satt inn for å utslette prøven manuelt. (B)Cartoon ordningen som viser hvordan kalsium fritt filterpapir (0,5 cm x 0,5 cm ansikt) bør håndteres ved hjelp av flat-punkts pinsett og inn gjennom inngangssporet inn fuktigheten kammeret forglassingsprosessen maskin for blotting EM rutenett på hvilke nevroner følges (dråpe med rosa celle media vist). EM grid er holdt av fin-punkts spesialiserte pinsett inne fuktigheten kammeret. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Visualisering av frosne, hydrerte nevroner på gull elektronmikroskopi (EM) nett. (A) Light mikroskop bilde på 10X forstørrelse av det sentrale området av en EM rutenett på som rotte primære nevroner har vært grofløyen for to uker. (B) zoomet inn visning av aqua boksen vist i (A), hvor nerveceller og deres neurite anslag er synlige (rosa piler). (C) elektronmikroskop ved 4K forstørrelse av en neurite projisere utover fra nervecellen kroppen (rød pil). Skjematisk tilsvarer et område (dvs. det røde boks) innenfor en av gitter kvadrater som er vist i (B). Blå boks er sett nærbilde i (D), hvor neurite interne funksjoner er godt synlig på 20k forstørrelse (grønn pil mitokondrier, oransje pil mikrotubuli, vesikkel blå pil). Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. 3-D rekonstruksjon og annotering av en rotte DRG axon tomogram. (A) CT-skive fra et rekonstruert bunke med bilder som er tatt på forskjellige vinkler av en DRG axon. (B) Tilsvarende 3-D annotering av samme axon. Klikk her for å se større bilde .
Figur 5. 2-D cryo-EM bilde av en rotte DRG nevron (sentrum-venstre) med aksonale anslag (rød boks) ved 4k forstørrelse. Klikk her for å se større bilde .
Figur 6. Montasje av fire 2-D cryo-EM bilder av en enkelt rotte DRG axon. Hvert bilde ble tatt på 20k forstørrelse. Klikk her for å se større bilde .
Figur 7. 2-D cryo-EM bilder av neurites. (A) En rotte DRG axon fotografert nærmere i nærhet til cellen soma. (B, C) Eksempler på over-trenging av neurites på grunn av høye plette konsentrasjon av neuroner på EM-nett. Alle neurites var flash-frossen to uker etter plating på gull EM nett. Alle bildene ble tatt på 20k;. Forstørrelse Klikk her for å se større bilde .
Figur 8. 3-D rekonstruksjon og annotering av en rotte hippocampus neurite tomogram. (A) CT-skive fra et rekonstruert bunke med bilder som er tatt på forskjellige vinkler av en hippocampus neurite. (B) Tilsvarende 3-D annotering av samme neurite. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viser at rotte embryonale nevroner (dorsal root ganglion og hippocampus) kan dyrkes på gull elektronmikroskopi (EM) rutenett og frosset i glasslegemet isen tynn nok for deres neurites å bli fotografert ved hjelp av 2-D cryo-EM og 3-D cryo- ET. Mens hippocampus neurites har tidligere blitt fotografert ved hjelp av cryo-ET 8,10,18,23, en protokoll detaljert nok for vellykket replikering ved hjelp av kommersielt tilgjengelige enheter har vært mangelfull. Videre, mens deres forskning har pioner bruk av kryo-ET for visualisering hippocampus neurites, våre studier utforske anvendelsen av cryo-ET til mer enn en type av neuronal prøven.
Her beskriver vi en detaljert protokoll forbereder EM rutenett med enten hippocampus og dorsal root ganglion (DRG) nevroner, blotting dem å oppnå optimalt tynn is, og stupe-fryse dem for avbildning av cryo-ET. Optimal blotting er en som ikke resulterer i is for tykk for elektronstrålen til å trenge inn i,og heller ikke for tynn for at glasslegemet is vises med merkbart forskjellig gradient fra kanten av holey karbon til det innerste av de holey karbon. Videre kan oppnå optimalt tynn is gjennom å bruke en forglassing maskin 17 være litt forskjellig for hvert prosjekt, og robust frysing hjelp forglassingsprosessen maskinen krever en læringskurve.
Mens tidligere forskning har fokusert på hippocampus nevroner, også utforsket her i våre studier, har vi gått videre for å vise bilder på nanometer skala av intakte, frosne hydrert hele axons av dorsal root ganglion (DRG), aldri fotografert før du bruker cryo- EM eller cryo-ET. DRG-celler ble valgt fordi de (i motsetning til hippocampus-neuroner) utelukkende gi opphav til 34 aksoner. En protokoll for imaging dem ved cryo-EM/cryo-ET kunne være nyttig for de som er interessert til å utlede axonal ultrastructure dvs. i sensoriske nerveceller. Vi stede også, og diskutere både optimale og suboptimale resultater, så velsom de potensielle gjenstander som man kunne støte på ved bruk cryo-ET for slike prøver.
Ved riktig celle-konsentrasjon (50 000 celler / ml pr rett), er avstanden mellom nerveceller slik at neurites tillate god tilgang ved hjelp av lys-og elektronmikroskopi (figurene 3A og 3B) med en eller to neuroner vises per grid-kvadrat (fig. 3B) . Slik at nok skille mellom nervecellene er nødvendig for klar visualisering av neurites via cryo-EM (Tall 3C og 3D). Nervecellene og deres neurites støttes på en holey karbon film av gullet nettet, som ses tydelig i Cryo-EM bilder (Tall 3C og 3D). De Nevron organer, som kan variere fra ~ 15-50 mikrometer for hippocampus nevroner og dorsal root ganglion (DRG) nevroner 30,33 er for tykk for bildebehandling ved hjelp av cryo-EM og synes helt svart, som er typisk for veri elektron-tette gjenstander og tykke prøver, sammenlignet med de forholdsvis tynne projeksjoner av neurites (som ikke overskrider en mikrometer i diameter) som stråler ut fra dem (figurene 3C og 5).
Harpiks-forankret 3-D hjernevev ikke avslører neurites som er helt sirkulært i tverrsnitt 14, faktisk, er variabel deres morfologi. Det er dermed ikke kjent om den ikke-sirkulær form av neurites er naturlig eller et eksemplar forberedelse gjenstand. Den målte tykkelse av DRG axon (figur 4) dyrket på TEM gitteret, blottet og avbildes som vist i denne studien, var 0.32 mikrometer i z-retningen (i dybden av glasslegemet is), og en gjennomsnittlig bredde på 0,53 mikrometer i xy-planet. Den målte tykkelse av neurite hippocampus (Figur 8) dyrket på TEM gitteret, blottet og avbildes som vist i denne studien, var 0.50 mikrometer i z-retningen (i dybden av glasslegemet is) og engjennomsnitt på 0,72 mikrometer i xy-planet. Den blotting prosessen som beskrevet her kunne flate neurites selv om de holdt seg hydrert i sin opprinnelige buffer under hele prosessen med blotting og stupe-frysing.
Den liten utflating av neurites på rutenettet som observert av cryoET synes ikke å påvirke strukturen i sine interne bestanddeler som vesikler som vist her, som er nesten helt sirkulær og viser ingen tegn på dehydrering. I motsetning til dette, de kjemiske prosesser som vanligvis brukes i "tradisjonelle" EM-preparater, spesielt kjemisk fiksering med glutaraldehyd og paraformaldehyd fulgt av dehydrering i etanol, resultere i ukontrollert vev krymping. Potensialet for å påtreffe en slik ødeleggende cellular effekt er eliminert i metoden vi presentere for cryoET i vår manuskript.
Videre våre neurites prøvene ble umiddelbart plunge-frosset i flytende etan, noe som resulterer i instant 'embedding "i glasslegemet is. Vev som er frosset i en glasstilstand vises mye mer likt den fysiologiske tilstand enn andre teknikker. Nivået av ultrastructural detaljer er ikke den eneste del som gjør den teknikk som er beskrevet i vårt protokollen for å være verdifulle for nevro forskere. Teknikken med å vokse nevroner på EM nett, umiddelbart blotting / stupe-fryse dem til å bevare i en glass tilstand for screening / avbildning av cryoET er en attraktiv teknikken fordi det åpner opp muligheten for å undersøke ultrastructure av nevroner under forskjellige genetiske, kjemiske eller miljømessige streker uten bekymring for potensielle dehydrering gjenstander.
De blotting forholdene før frysing, som beskrevet i denne protokollen, er viktig for å generere isen tynn nok for visualisering av cryo-ET av de ultra funksjoner, inkludert interne komponenter som mitokondrier, blemmer og mikrotubuli (figur 4, 6, 7A). Mitokondrier, for eksempel, kan bli identifisert i våre forberedelser siden de synes strukturelt ligner på det som har blitt sett i cellene (kantene av mus embryonale fibroblaster) via cryo-electron tomography 20. De viser også cristae, som kan sees i 3D-fargekommenterte bilder stede i dette manuskriptet. Suboptimale bilder kan resultere fra tykk is der cryo-EM bildet vises vanligvis ugjennomsiktig, hindrer vellykket identifisering av slike funksjoner som mitokondrier og mikrotubuli innenfor neurite. Mangel på tilstrekkelige opplysninger for fremstilling av slike prøver, særlig når det gjelder hvordan man skal produsere optimalt tynn is, nesten helt sikkert bidro til begrenset suksess i å definere ultrastructure av neurites 8,10,17,23.
Suboptimale bilder kan også skyldes plating for mange nevroner på rutenettet (> 50000 celler / ml per parabol), noe som resulterer i overbefolkning av neurites (Tall0, 7B og 7C). Uskarpe bilder kan være et resultat av feil defokus og må justeres, den defokus i bildene som vises her ble tatt med en målrettet underfocus av 7 mikrometer. Bilder ble oppsamlet ved at defokuseringen å sikre høyere kontrast og synlighet av ultrastrukturelle egenskaper, men hadde en lavere defokuseringen (dvs. 2-3 mm) også anvendes for å oppnå høyere oppløsning detaljer om slike egenskaper.
Andre faktorer kan bidra til suboptimale bilder. For eksempel, selv om det kan være fristende å bruke andre trekk ved forglassing maskin, særlig semi-automatisert blotting-funksjonen, i stedet for manuell blotting som her er beskrevet, dette ga uønskede resultater. Tosidige blotting ble først forsøkt å bruke denne semi-automatisert funksjon, der forglassingsprosessen maskin (i stedet for brukeren) utsletter prøven direkte ved hjelp av slike parametre som blotting og antall blotter som angitt av brukeren. Men after avbildnings slike prøver, ble det funnet at alle neuroner hadde lyseres åpne, søle ut innholdet (multivesikulære organer, etc.). Derfor er forglassing maskinen best brukt i dette tilfellet for sin temperaturstyrt fuktighetskammer hvori prøven er strøket før plunge-frysing. Vedlike prøven i en slik tilstand (med fuktighet satt nær 100%) reduserer vanntapet under forberedelse og bidrar til å sikre optimal glasslegemet isen etter frysing 3,7.
Ideelt sett, for å minimalisere eksponering av neuroner overfor eksterne forstyrrelser, bør de bli dyrket i en CO2-inkubator (temperaturen innstilt til 37 ° C) i nær tilknytning til rommet med forglassing maskinen, og temperaturen for denne anordning skal settes til 37 ° C forut for flash-frysing av neuroner på EM-nett. Man bør unngå å utsette nevroner til store svingninger i temperatur før blotting. I denne rapporten, ble temperaturen satt til 32 ° Cfor blotting formål; nevronene ble dyrket i en annen bygning og en time lapse av ~ 10 min skjedde mellom frakte platene av nerveceller fra ett rom til et annet. Man var omhyggelig med å beskytte prøvene i et vann-resistent, semi-isolert beholder under transportprosessen. En tilsvarende endring i temperatur og CO2-konsentrasjon (som oppleves av nervecellene før blotting / plunge-frysing) forekommer i nervecellene hvert ~ 2 dager da de neuroner er tatt ut av inkuberingen kammeret for deres medier som skal endres under biosikkerhet hette, som gjøres typisk for neuronale kulturer. Dette er ikke sees å resultere i toksiske effekter til cellen.
Når det gjelder tilstedeværelsen av det som synes å være elektrontette granula innenfor neurites 'mitokondrier, en rekke motstridende rapporter finnes. Slike granuler er funnet i en rekke forskjellige vev, som ikke er spesielt neuronale celler. De oppfattes som en vask av kationer som regulerer den indre ionisk nomiljø av mitokondrie. De synes også å opprette kontaktsider mellom indre og ytre mitokondrielle membranene i hvilke enzymer kan fungere effektivt 16.
Eksperimentelle studier indikerer at kalsium og andre divalente kationer akkumuleres i mitokondrier når disse ioner er tilstede i fluidet bade enten isolerte mitokondrier eller intakte celler. Det ligger an til at ionene er organisk bundet til de pre-eksisterende intra-mitokondrie granulat. Det foreslås derfor at disse granulene er knyttet til reguleringen av det indre ionisk miljø av mitokondrie 31..
Videre nevroner i vår forberedelse ble dyrket på EM nett i 14 dager, er timingen som typisk for det formål å neurite utvekst 15,36, før avbildning av cryoEM / ET. Det har blitt rapportert at det er en dramatisk økning i intracellulær kalsiumkonsentrasjon i alderen neuroner sammenlignet med Youn g nevroner 32. Derfor er det sannsynlig at mitokondriene i neurites av disse alderen neuroner ville vise mitokondrielle granuler ikke nødvendigvis som et tegn på stress, men snarere fordi de har en høyere forekomst av intracellulær kalsium.
Elektron-tett mitokondrielle granulater har også blitt rapportert i mus embryonale fibroblaster dyrket i-kultur og fotografert av den samme teknologien (cryo-electron tomography) som brukes i vår manuskript 20. Disse cellene viste ikke typiske mønstre av ultrastructural endring assosiert med mobilnettet skader, for eksempel cytoskeletal avbrudd og vacuolization av cytoplasma. På samme måte, innenfor våre neurites som visualiseres ved cryoET, vi gjorde ikke observere en forstyrret cytoskjelettet som ellers ville bli assosiert med mobilnettet toksisitet. Gitt de ovennevnte betraktninger, konkluderer vi med at neuronene i vårt preparat ikke vise mitokondrielle granuler som et resultat av stress eller toksisitet.
innhold "> For å sterilisere EM gitteroverflaten for å forhindre forurensning i neuronene, og også for å skape et gunstig, hydrofil overflate på EM rutenett som poly-L-lysin kan følge, flammende EM rutenett før plette neuroner ble funnet å være en fordel. UV sterilisering ble ikke valgt fordi det krever bestråling av nettet for en lengre tid (f.eks 20-30 min) i biosikkerhet hette. Deretter nett ville trenge å re-eksponeres på nytt for miljøet når blir glød -utladet i forbindelse med hydrophilizing nettets overflate. Glow-utlading rutenettet sikrer at den etterfølgende poly-lysin belegg ville effektivt "pinne" til rutenettet. Teknikken med flammende på nett er en fordel siden den kombinerer både hydrophilizing trinn og sterilisering trinn i en. Primære neuroner er kjent for å være mer følsom enn tumorbasert cellelinjer, og det er viktig å holde deres miljø (grid, Petriskål) så sterilt som mulig.(Tall 3C og 5), som dekker mer av nettområdet med sikte på å velge hvilken neurite til bilde . Deretter kan 2-D cryo-em-bilder tas ved intervaller, og digitalt sydd sammen til en montasje (figur 6). Denne teknikk kan være nyttig for ultrastrukturelle egenskaper, slik som microtubuli organisasjon, over et større område enn den til en enkelt cryo-EM bilde.
Tar lavdose, lav forstørrelse bilder (figurene 3C og 5) er også nyttig for å identifisere områder av neurite som er i overensstemmelse med diameter på tvers av holey karbon film (begge i hullene og på tvers av karbon) og dermed mer ideell for avbildning og påfølgende analyser. Forstørring av neurites over hull i karbon film er vanligvis sett i større neuritter (figur 5) med klart mer intern materiale enn tynnere neurites (Figur 3C). Dette fenomenet antas å oppstå på grunn av mangel på fysisk støtte i hullene i den karbonfilm. Når EM gitteret fjernes fra formen, der nervecellene ble vokser, og deretter strøket fra baksiden, neurites med flere indre masse (figur 5) enn andre (figur 3C) har en tendens til å ekspandere og / eller sag inn i hullene. Selv om dette synes å være en gjenstand, er det en fordel å vise tydeligere de indre bestanddeler av neurite. Ved hjelp av en kontinuerlig karbon film kledde på denne holey karbon film kan bidra til å omgå dette problemet i fremtidige studier. Dette oppsettet ble først forsøkt, men resulterte i glasslegemet isen for tykk for bildebehandling. Påfølgende forsøk med forskjellige tykkelser av kontinuerlig karbon kledde på EM rutenett kan trenge ytterligere undersøkelser.
En viktigtig fordel med den aktuelle fremgangsmåten, er at den romlige organiseringen av cellekomponenter innenfor neurite kan visualiseres ved nanometerskala ved å foreta flere 2-D-bilder av en enkelt neurite ved forskjellige vinkler, og rekonstruere denne stabelen av bilder til et tomogram. Enkelte strukturelle trekk kan deretter manuelt annotert for hver 2-D bit av 3-D stabelen i forskjellige farger ved hjelp av den aktuelle programvaren (se tabell av materialer og reagenser) som vist for et akson av en rotte E18 dorsal root ganglion (DRG) nevron (figur 4) og en neurite av en rotte E18 hippocampus nevron (Figur 8).
Ved å velge å ta et bilde hvert 5 grader om vippeserien, i stedet for 1 eller 2 °, er færre bilder innsamlet, men en høyere elektron dose kan brukes per bilde. Dette resulterer i høyere kontrast og mindre støy i RAW-bildene. Dette er bedre med tanke på rekonstruksjon (justering av kryss-korrelasjon som en st ep) og påfølgende tomogram merknader, noe som gjøres ved hånd for hvert bilde omfatter tomogram bunken i z-retningen. Valg av en trinnstørrelse er også avhengig av størrelsen av prøven; mellom forskjellige helningsvinkler, vil større prøver ikke variere så mye. I dette tilfelle ble det ved hjelp av et større inkrement størrelse (5 °) antatt å være mer egnet på grunn av den forholdsvis store prøvestørrelse av neurite.
Videre legger fiducial markører gull til EM rutenett ville hjelpe for fine bildejusteringen hvis ønskelig. Fiducial markører ble ikke benyttet fordi prøven var relativt stor sammenlignet med andre cryo-em prøver (virus eller proteiner isolert) og viste høy kontrast med en rekke strukturelle trekk som kan benyttes for riktig justering av hver av de 2-D bilder (bestående av 3-D-stakk) ved krysskorrelasjon. Den resulterende bildestakk var godt justert ved hjelp av denne tilnærmingen, og brukbar for påfølgende 3-D farge merknad.
ent "> For fremtidige studier, ved hjelp av et mikroskop med en energi filter kunne redusere støy forårsaket av inelastically spredte elektroner, men kan en slik funksjon ikke være lett tilgjengelig på de fleste elektronmikros fasiliteter. Vår prosedyre avslører hva bildene kan resultere fra en standard 200 kV mikroskop med ingen energi filter, kan som være mer allment tilgjengelig for nevrovitenskap samfunnet for øvrig.Protokollen er beskrevet her er optimalisert for å forberede og visualisere både rotter embryonale DRG axoner og hippocampus neurites bruker kommersielt tilgjengelig utstyr for cryo-EM og cryo-ET. En av de viktigste fordelene med denne teknikken er at den gir strukturell informasjon fra hele neurites, ikke seksjonert, valset eller behandlet av ulike kjemiske reagenser for å vise sine ultrastructure. Vi har vist hvordan Cryo-ET er en spesielt god metode for bruk i fremtidige ultrastructural analyser av nevroner i en nær-til-opprinnelige tilstand for å undersøke effektenav nevrologisk sykdom på neurite struktur.
De Elektronmikros Data Bank tiltredelses tall for 3-D tomografi som rapportert i dette notatet er som følger: For rotte hippocampus neurite som vist i Figur 8 og i hoved video (fra 8:45 til 9:01), den EMDB sjonsnummer er EMD-5887. For rotte dorsal root ganglion neurite som vist i Figur 4 og i hoved video (fra 09:02-09:15), er EMDB sjonsnummer EMD-5885.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen har vært støttet av NIH tilskudd (PN2EY016525 og P41GM103832). SHS ble støttet av et fellesskap fra Biology Tverrfaglig Graduate Training Program av WM Keck Center for Tverrfaglig Biovitenskap Opplæring av Gulf Coast konsortier (NIH Grant No T32EB009379).
SHS dissekert, vokste og forglassede DRG og hippocampus celler; samlet cryo-EM og cryo-ET data av DRG og hippocampus axoner, rekonstruert og farge-annotert tilt serien. MRG dissekert og ga hippocampus celler i MNR laboratorium. SC bistått i tilt serien merknad. SHS ble trent av CW på hvordan å dissekere og vokse nevroner. SHS, WCM og WC unnfanget forsøkene. SHS utarbeidet manuskriptet med innspill fra andre forfattere.
Denne videoen ble filmet ved Center for Cellular Imaging og NanoAnalytics (C-CINA) av Biozentrum av tHan Universitetet Basel. C-CINA er integrert i Avdeling for Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) av ETH Zürich, som ligger i Basel, Sveits.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
