Summary
Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.
Abstract
Nöritler, hem dendrit ve aksonlar, nöronlar arasındaki elektriksel uyarıların iletimini sağlayacak nöronal hücresel süreçleri vardır. Neurites yapısının tanımlanması, bu işlemler, sinaptik iletişim destek malzemeleri ve sinyalleri nasıl hareket anlamak için çok önemlidir. Elektron mikroskopisi (EM) geleneksel nevritlerin içindeki ultrastrüktürel özellikleri değerlendirmek için kullanılmıştır, ancak dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücüye maruz kalma yapıları bozabilmektedir. Önemli bir karşılanmamış hedefi böyle eserler etkilenmez yapısal değerlendirmeler için izin prosedürlerin oluşturulmasıdır. Burada, biz büyüyen ve kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ile muayene ile takip elektron mikroskobu ızgaraları farklı primer nöronlar flaş dondurma bütün nevrotiler için detaylı ve tekrarlanabilir bir protokol kurduk. Bu teknik asse kolaylaştıran, nanometre çözünürlükte donmuş, hidratlı neurites 3-D görselleştirme sağlarmorfolojik farklılıklar ssment. Bizim protokol dorsal kök ganglion (DRG) nevritler ve onların yakın yerli devlet hipokampal neurites bir görselleştirme görülmemiş bir görünüm verir. Gibi, bu yöntemlerin normal nöronlar ve nörolojik bozukluklar etkilenenlerin hem neurites gelecek çalışmalar için bir temel oluşturabilir.
Introduction
Nöronlar alt nöronlar ile iletişim kurmak için bilgi ve aksonlar, genellikle oldukça uzun, almak için dendrit detaylandırılması, merkezi ve periferal sinir sistemlerinin işlev için karmaşık devre esasını kurmak. Nörit gelişimi, sinir sisteminin eleştirel işlevini destekleyen embriyonik gelişim ve nöronal farklılaşma ve neurites bakımı sırasında temel bir rol oynamaktadır. Nöritik işlemleri de nöronal hasar ve rejenerasyon, hem de sinir sistemi bozukluklarında kritik bulunmaktadır. Nöronal mimari çalışma hem normal ve hastalıklı beyin anlamak için çok önemlidir. Neyse ki, fizyolojik olarak ilgili nöronal hücre kültürü sistemleri karmaşık ve heterojen hücre yapıları özetlemek için mevcuttur. Katı deneysel platformlarda, nöronal morfoloji kalitatif ve kantitatif analizleri sağlayacak etkili görselleştirme stratejileri aydınlatılması dayanarak ihtiyaç vardır. Özellikle yararlı olurnanometre ölçeğinde nevritlerle, hem akson ve dendrit görselleştirmek için tutarlı bir platform sağlar ayrıntılı bir metodoloji.
Geleneksel elektron mikroskobu gerçek durumundan örneklerinde bozulmalara neden olabilir ki, dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücünün kullanılmasını gerektirir. Böylece bulgular 4,9,25 yorumlanmasını sınırlayıcı - Bugüne kadar, nanometre ölçeğinde en fazla yapısal karakterizasyon gibi sert kimyasallara maruz kalan daha büyük hücrelere veya dokulara dayanmaktadır. Ayrıca, elektron ışını penetrasyon için, 1 mikron kesit 12 daha büyük olan bir kalınlık arzeden organizma veya hücre uzantılar için gereklidir. Nihayet, neurites uzatılmış özelliği hantal tanımı yaparak, ayrık dilim özgü veri setleri toplama doku sonuçları kesitli veya öğütülmüş. Hatta cryo-EM için, bir dondurulmuş, hidratlanmış numune kesit mümkün olduğu, yöntem, sıkıştırma artif getirmektedir1, hareket eder.
Son yıllarda, araştırmacılar EM ızgaraları ve flaş dondurma sonradan cryo-ET 8,10,18,23 kullanarak nevritlerle görselleştirmek için sıvı etan onları doğrudan hipokampal nöronlar büyümeye nasıl öğrendim. Ancak, bu tür çalışmalar, bir ısmarlama cihaz 10,23, ya da rutin görselleştirme 8,18 için yeterince ince vitreus buz üretmek için kurutma adım eksikliği bilgilerini kullanın ya. Örneğin, bir çalışma EM ızgara 10 lekeleme için 30-40 sn kullanılmasını önerir, ancak bu değer genel kullanım için optimize edilmiş değil ama bu ölçüye dalma-dondurma cihaz için özeldir. Dalma-dondurma örnek öncesinde nem korumak için özel yapılmış bir cihaz yerine piyasada mevcut bir 17 Kullanımı yaygın tekrarlanabilirlik için bir engel teşkil edebilir.
Bu çalışmalar Cryo-ET tarafından nevritlerle görselleştirme çığır olsa da, biz ap keşfetmek için bir adım daha almışnöronal numuneler (hipokampal ve dorsal kök ganglion nöronlarının) çeşitli cryo-ET plicability. Ayrıca, optimal ve optimal sonuçları yanı sıra, böyle bir numune için kriyo-ET kullanarak karşılaşabileceği potansiyel eserler hem de tartışmak.
Yakın bir yerli devlet korunması ve nanometre ölçeğinde bütün nevritlerle görselleştirmek için detaylı bir teknik tanımlama ultrastrüktürel çalışmalar yürütmek için daha fazla araştırmacılar için yeteneğini geliştirmek olacaktır. Bu amaçla, nevritler görselleştirmek için sabitlenmemiş, boyanmamış nöronlar hazırlamak için ticari olarak temin edilebilen ekipman kullanılarak etkili ve detaylı bir protokol açıklar. Bu sağlıklı neurites ultrastrüktürünü detaylandırma ve yapısal farklılıkları sinir sistemi hastalık modellerinde mevcut ne anlamak için zemin hazırlamaya yönelik önemli bir ilk adımdır. Cryo-ET nanometre ölçeğinde 3-D sabitlenmemiş, boyanmamış nörit özelliklerini çözebilirsiniz yana, yöntem mümkün asla gibi olacaktır yapacaknevritik mimarisini 12 tanımlamak için fore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kaplama İlköğretim Nöronlar EM Izgaralara Yemekleri Hazırlama
- En az 25X büyütmede ışık mikroskobu kullanarak altın EM ızgaraları holey karbon bütünlüğünü inceleyin. Emin karbon delikleri>% 98 sağlam olduğundan emin olun.
- Birincil nöronları kaplama için, EM ızgaraları alev sterilize ve aynı anda onları hidrofilik işlemek için bir Bunsen beki kullanın. Kenarıyla değil, merkezi ızgarah alanı ile EM ızgara almak için cımbız kullanın. DİKKAT: gözetimsiz yanan bir Bunsen beki bırakmayın ve bu adımları gerçekleştirirken plastik bileşenleri ile eldiven veya cımbız kullanmayın:
- Bunsen Ocağı yakmadan önce, bir minimal açık pozisyona hava ve gaz ayarı ayarlayın.
- Bir forvet çakmaktaşı ya da bütan çakmak kullanarak Bunsen beki yakin.
- Uzun boylu, açık mavi / mor alev içinde küçük, mavi bir iç alev elde etmek için hava ve gaz ayarı değiştirin. Iç alev ucu alevin sıcak parçasıdır. Altında topuzubrülör namlu hava brülör girme miktarını ayarlamak için açılabilir iken neath brülör, gaz brülör tüpü girme miktarını ayarlar. Hava ayarı saat yönünde çevirerek (mor alev sonuçlanan) havayı azaltır ve saat yönünün tersine (sarı bir alev sonuçlanan) havayı artırır.
- Karbon tarafı yukarı bakacak şekilde, iki kez alev aracılığıyla hızlı bir şekilde geçmek, EM ızgara tutun metal cımbız (hiç plastik parça) kullanma. Karbon tarafı daha mat (daha az parlak) görünür ve diğer tarafında daha grimsi tonu daha fazla olacaktır.
- Hemen Bunsen beki 10 cm mesafede yerleştirilmiş cam alt çanak merkezi haline ızgara (karbon-tarafı yukarı) aktarın. Çanak başına bir EM ızgara (Şekil 1) kullanın. Sadece presterilized olan cam alt yemekler, yani yoluyla gama radyasyon kullanın.
- Hala cam Bott içindeki EM ızgara korurken ızgara bütünlüğünü (karbon delikler sağlam) kontrol etmek için bir ışık mikroskobu kullanınom çanak (kirlenmesini önlemek için). Nöronlar ile temas edecek ızgara ya da bir şey üzerinde herhangi bir maddeyi uygularken, steril prosedür ve steril pipet uçları kullanın.
- Steril bir prosedür kullanılarak, bir doku kültürü kaputu, Petri kabı, merkezi cam bölgeye yavaş ve dikkatli bir şekilde, uygun olan kaplama maddesinin 250 ul geçerlidir. Uygun kaplama maddesi tamamı EM ızgara kapsar emin olun.
- Hipokampal nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi hazırlanmıştır 19, kaplama maddesinin, poli-L-lisin (PLL, 1 mg / ml) kullanın. 250 ul tabak başına, EM ızgara başına gerekli olduğunu unutmayın, bu yüzden buna göre toplu ölçek. Dorsal kök ganglion (DRG) nöronlar için, aşağıdaki gibi hazırlamak, kaplama madde olarak (Malzeme ve reaktiflerin tabloya bakınız) Engelbreth-Holm-Swarm (ÇSG) fare sarkoma hücreleri tarafından salgılanan bir protein jelatinli karışımı kullanın. 250 ul tabak başına, EM ızgara başına gerekli olduğunu unutmayın, bu yüzden buna göre toplu ölçek.
- Bir stok şişe Çözülme4 ° C de bir gece Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan jelatinimsi protein karışımının
- Soğuk Ol Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), fare sarkoma hücreleri, buz üzerinde tutarak, yani çözelti yapılması için kullanılan bütün bileşenleri, salgılanan protein jelatinimsi karışım.
- Buz üzerinde, bir 1:20 seyreltme vermek üzere, Neuro temelli ortam içinde bu, jelatinimsi protein karışımı seyreltik da (örneğin, Neuro temelli 10 ml jelatinimsi protein karışımının 500 ul seyreltik).
- Bölme 1 ml alikotlar halinde, jelatinimsi protein karışımı seyreltildi ve hemen -20 ° C'de fazladan alikotları depolamak
- Bölüm 1.4 'de tarif edildiği gibi, çanak başına EM grid başına 250 mikrolitre uygulayın.
- Hipokampal nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi hazırlanmıştır 19, kaplama maddesinin, poli-L-lisin (PLL, 1 mg / ml) kullanın. 250 ul tabak başına, EM ızgara başına gerekli olduğunu unutmayın, bu yüzden buna göre toplu ölçek. Dorsal kök ganglion (DRG) nöronlar için, aşağıdaki gibi hazırlamak, kaplama madde olarak (Malzeme ve reaktiflerin tabloya bakınız) Engelbreth-Holm-Swarm (ÇSG) fare sarkoma hücreleri tarafından salgılanan bir protein jelatinli karışımı kullanın. 250 ul tabak başına, EM ızgara başına gerekli olduğunu unutmayın, bu yüzden buna göre toplu ölçek.
- Onun üst Petri kabı kapağı ve (hipokampal numuneler için iki PLL ile, OR DRG örnekler için, jelatinimsi protein karışımı ile) inkübe doku kültürü kaputu oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
- Aspi(hipokampal numuneler için) tüm PLL veya yemekler (DRG numuneler için) jelatinli protein karışımı değerlendirirsiniz. Bunu yapmak için, doku kültürü kaputu vakum sistemini kullanır. Vakum tüpüne bağlanmış bir steril pipet kullanın. EM ızgara ile doğrudan temastan kaçının.
- Dikkatlice EM ızgara tamamen PBS ile kaplanmıştır, öyle ki her bir Petri kabı içinde merkezi cam alanında, EM şebekeye steril PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) içinde 250 ul uygulamak için ayarlanabilir bir hava-yer değiştirme pipet kullanın. Daha sonra, her bir tabaktan PBS aspire. 3x tekrarlayın.
- EM ızgaraları ile yemekleri 15 dakika süreyle doku kültürü kaputu altında kurumaya bırakın. Onlar doku kültürü odasında ışık mikroskobu altında kontrol ederek tamamen kuru olduğundan emin olun. Emin kılavuzunda nem hava kabarcığı olmadığından emin olun. Eğer öyleyse, dikkatle aspire yanındaki EM ızgara için bu ekstra nem ortadan kaldırmak için. Kaplanmış ızgara nöronları kaplama için hemen kullanılmalıdır.
2. Hazırlanması ve PlEM Izgaralar üzerinde ating İlköğretim Nöronlar
- Daha önce 19 açıklandığı gibi, tek tek hücrelere hippocampi (veya 18 gün eski sıçan embriyoların dorsal kök ganglion) ayırmak için birincil nöronları, ilk teşrih, trypsinize (% 2.5 tripsin kullanarak) ve çiğnemek plaka.
- Öğütün özellikle ateş cilalı ucu ile bir cam pipet kullanılarak, tek tek hücreler içine hücre ayrıştırma kümeleri tanımlamak için neurobiologists tarafından kullanılan bir terimdir. Sonuç dikkatlice ve yavaşça pipet aracılığıyla (~ 30), yukarı ve aşağı, birden çok kez hücreleri çekme ve bırakılmasıyla elde edilir.
- Fare için daha uygundur önerilen enzimler (papain, kolajenaz / dispaz) kullanmak yerine, sıçan DRG nöronlarını izole edilmesi için (HBSS)% 0.25 tripsin kullanımı dikkate alarak, daha önce DRG diseksiyon ve hücre 24 izolasyonu için açıklanan prosedürleri takip DRG nöronları.
- (Örneğin bir hemasitometre kullanılarak) izole nöronların sayısını hesaplayınve tabak başına 50,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon elde etmek için her bir çanak uygulamak için hücrelerin uygun hacmi hesaplamak için bu değerini kullanın. Uygulamak için maksimum hacmi 250 ul. Bu sadece merkezi cam alanını değil, tüm yemeğin doldurur unutmayın.
- 37 ° C 'de, bir CO2 kuluçka makinesi içinde 30 dakika için inkübe yemekler Hücreleri kurtarmak ve uymak için izin verin.
- Yavaşça EM ızgara bozmamaya özen, her yemeğin ısıtılmış medya 1.5 ml ekleyin. Ortamının tipi, hücre tipi (hipokamp veya DRG) bağlıdır.
- Kullanımdan önce, 37 ° C su banyosu içinde ısıtıldı olmaktır hipokampal nöronlar 19 ya da dorsal kök ganglion nöronlarının 24, her iki için uygun ortam hazırlar. CO2 inkübatör içinde bir gece boyunca inkübe yemekler.
- Hipokampalinden için, ertesi gün ortamı değiştirmek. 14 gün boyunca her iki günde bir ileriye ortamın yarısı değiştirin. Kullanımdan önce, 37 ° C su banyosu içinde ortam ısıtın. DRG nöronları için, diseksiyon / kaplama takip eden gün, bir anti-mitotik ajan (Üridin ve 5'-floro-2'-deoksiüridin) ayrı olarak, her bir 10 mM stok çözelti yapmak ortam ile yeni bir stok hazırlamak, nihai kullanımı Her biri için 10 uM konsantrasyonu. DRG medya (875 ul) yarısı çıkarın ve anti-mitotik madde ile taze medya 875 ul ekleyin.
- DRG nöronlar için, ilk hafta için her iki gün, alternatif anti-mitotik medya ve standart DRG medya arasındaki ortam değişiyor. Ikinci hafta için, her iki gün standart DRG ortamı değiştirmek.
3. EM Izgaralar üzerinde Nöronlar camlaştıncı
- Kriyojenik sıcaklıkta altın EM ızgaraları dondurulması ve depolanması için ekipman ve tüm malzemeleri hazırlayın: bir nem odası 17 ile vitrifikasyon cihazı, sıvı azot vitrifikasyon makine, uzun düz uçlu cımbız, termosun (ler) için ince nokta uzman cımbız (LN 2), coolant konteyner, EM ızgara saklama kutusu, kalsiyum-ücretsiz filtre kağıdı.
- Vitrifikasyon cihazı başlatın. 32 ° C'ye kadar% 100 ve sıcaklık nem ayarlayın "Konsol" bölümünde, sıfır saniye leke saati ayarlayın. Bu, vitrifikasyon makinenin nem odası yan pencereden lekeleme kılavuzu sağlar.
- Üç kağıtlar yığılmış şekilde onları katman, eldiven ile kalsiyum ücretsiz filtre kağıdı tutun. Yaklaşık 2 cm uzunluğunda 0.5 cm genişliğinde şeritler halinde yığını kesin. Kağıdın bir tarafı x 0.5 cm yüz (Şekil 2) 0.5 cm olan böyle bir 90 ° açıyla bükün. Cımbız kullanarak, orta kağıdı çıkarın ve kullanıma kadar başka bir kalsiyum ücretsiz filtre kağıdı üzerine yerleştirin.
- Vitrifikasyon odası içinde düğme tutucu ızgara depolama düğmesine koyun. Sıvı azot ile soğutma kabın iç bölmeyi doldurmak ve tam buharlaştırma kadar bekleyin. Th dış bölmeyi doldurmaksıvı nitrojen ile e soğutucu kap bir sonraki adıma geçilir için kararlı bir sıcaklık elde edene kadar. Soğutulan odası içinde bir sıvı duruma yoğuşur yüksek saflıkta gaz etan ile iç bölmesini doldurun.
- Hemen yakınında vitrifikasyon odasına ulaşım için büyük bir 100 mm polistiren çanak inkübatör çanağı (es) hareket, eğer değil. Dikkatli çanak EM ızgara almak için özel vitrifikasyon cımbız kullanın. Nöronlar EM ızgara üzerinde büyüyor hangi tarafa unutmayın; pozisyon bir sonraki adım için önemli olacaktır. Güvenli EM ızgara üzerinde cımbız kilitlemek için cımbız üzerinde siyah sürgülü kilidini kullanın.
- Vitrifikasyon makine nöronlar uzakta vitrifikasyon makinenin yan açıklık deliğinden, sola yüzleri yapıştırılır üzerinde EM ızgaranın şekilde yan içine cımbız yerleştirin. Vitrifikasyon makinenin içine özel cımbız çekin.
- Uygun tutucuya soğutucu kap yerleştirinvitrifikasyon Makinenin. Yeterli LN 2 ve sıvı etan ile dolu olmalıdır. Bu nem odası alt ile yıkandı olana kadar vitrifikasyon makinenin uygun ekran komutunu kullanarak, yukarı doğru, soğutucu bölmeyi yükseltmek.
- Düz nokta cımbız ile, daha kısa yan (0.5 cm x 0.5 cm yüz) cımbız dik olduğu şekilde, filtre kağıdının bir kenarından kavramak. Bu yüz (Şekil 2B) kaydedilmek üzere EM ızgara ile doğrudan temas edecek. Dikkatlice vitrifikasyon makinenin nem odası yan delik (Şekil 2A) içine filtre kağıdı yerleştirin. Kararlı şekilde 10 saniye için (yan uzak örnekten bakan) EM ızgara karşı kağıdı tutun. Sonra kağıt atmak ve hemen vitrifikasyon makinenin otomasyon kullanılarak sıvı etan örnek dalma-dondurma.
- Dikkatli birinde yuvalardan birine dondurulmuş-sulu EM ızgara transferiızgara depolama düğmeleri. Yemekleri ek EM ızgaraları için işlemi tekrarlayın. Bu deneylerde kullanılan EM ızgara depolama düğmeleri çok dondurulmuş hidratlanmış EM ızgaraları depolayabilir.
4. Görüntü Toplama, İşleme ve Annotation
- 2-D elektron mikrograflannı ve / veya düşük doz koşul altında bir kriyo-elektron mikroskobu kullanarak neurites 3-D tilt serisi 5 toplamaya devam. 2-D görüntüler 3-D tilt serisi için yararlı olması için buz kalınlığı ve olası alanlar açısından ızgara kalitesini değerlendirmek amaçlanmıştır.
- Bu durumda, her görüntü / 7 um ve 4.4 arasında örnekleme underfocus bir hedefe 20k büyütmede mikroskop, tek bir eğim sıvı azot cryo buraya tutucu ile donatılmış bir 200 kV elektron mikroskobu bağlanmış bir 4k x 4k CCD kamera kullanılarak toplandı piksel.
- Aşamalı örnek al eğerken örnek bir 3D tomogram edinmek için, projeksiyon görüntüleri bir dizi çekmektransmisyon elektron mikroskobu (TEM) ong bir eksen. Eğim açıları ve diğer deneysel ayarları göz önüne alındığında, otomatik eğim serisini 5 toplamak için mevcut birkaç farklı yazılımlar vardır. Burada gösterilen 3-D tilt serisi ~ 60 e / Å 2 kümülatif dozu ile 5 ° artışlarla 60 ° -60 ° aralığında yarı-otomatik tilt serisi toplama yazılımı kullanarak 26 aynı mikroskop üzerinde toplanmıştır.
- Daha önce diğer numuneler 5,29 için açıklanan görüntü işleme yazılımı kullanarak 21 neurites eğim dizi yeniden yapılandırma.
- İlk tomogram segmentlere ve daha önce 5 açıklandığı gibi 3 boyutlu görüntü işleme yazılımı kullanarak bir yüzey modeli oluşturarak neurites 3-D özellikleri Renk açıklama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki cryo-ET ile dondurma ve görüntüleme için, ışık mikroskobu ve görüntüler nöronlar üzerinde büyüdüğü EM ızgaranın alınmalıdır. Nöritler birbirleri ile önemli örtüşme olmaksızın açıkça görünür olmalıdır. Şekil 3A'da renkli bir kutu büyütüldüğünde nevrotiler ızgara kafes boyunca uzandığı Şekil 3B, daha yüksek büyütme göstermek için bir alanı temsil eder. Her ızgara-kare nöronlar ve onların nevritlerle destekleyen bir holey karbon film oluşur. Bu delikler, dışarı doğru çıkıntı nörit başka bir göreceli olarak büyük, koyu, elektron-yoğun bir nesne (Şekil 3C), gibi nöron gövdesini göstermektedir 4k büyütme, alınan düşük doz cryo-EM görüntüsünde görülür.
Karbon bir delik üzerinde nörit dinlenme bir kısmı Şekil 3C'de renkli bir kutu içinde seçilmiş ve yakınlaştırılmış Şekil 3D de daha yüksek bir büyütmede (20k) de olduğu. Bu protokol izlenerek tarafından oluşturulan bu büyütmede, mikrotübüller, veziküller ve mitokondri gibi açık hücre içi yapılar, özellikle en iyi şekilde, ince buz içinde (Şekil 3D) açık bir şekilde anlaşılması gerekir. Görüntünün merkezine (Şekil 3D) koyu siyah yapılar kontaminasyon olarak kabul edilir ve genellikle kaçınılmalıdır altıgen buz parçacıkları olmakla birlikte, çok seyrek ve neurites kendileri dışında olduğunu verilmiş, onlar karışmaz yeniden yapılanma ve analizi ve yorumlanması (Şekil 4) iç yapılarının renk açıklama. Bir çok nörit 2-B görsel alınır ve dijital bir montaj (Şekil 6) oluşturmak üzere görüntü işleme yazılımı kullanılarak birbirine dikilebilen sonra, yer edilebileceği başka bir düşük doz, düşük büyütme görüntü, Şekil 5'te gösterilmiştir.
BaşlangıçtakiEM taşıyıcılar üzerine nöronların düşük kaplama konsantrasyonu (plaka başına 50,000 hücre / ml) en nevritlerin (Şekil 3C) açıkça görüntülenmesini sağlamak için yeterince birbirinden aralıklı olan nöronlar için sağlar, plaka başına (> 50,000 hücre / ml 'den daha yüksek konsantrasyonları önerilir ) hücresel komponentleri (Şekil 7B ve 7C) iz veya nitelik zor olan kalabalık nöritlerin suboptimal görüntüleri neden olabilir.
Şekil 1. Cam alt yemekler içinde EM ızgaraları nöronlar büyüyen için Şema. (A) Cam-bottom yemekler kısmen hücre medya (pembe) ile dolu, gösterilir. Yakın bir görünüm ortaya koymaktadır (B) Her yemeğin, bir altın EM ızgara içerir. E (C) KaplamaPoli-lisin ile M ızgara bir çizgi yan kesilmiş olarak gösterilir. Cam alt çanak ilk alt kesilmiş bir dairesel açıklığı kaplayan bir plastik kültür çanağı, dibine bağlı bir kare cam lamel oluşmaktadır. Bu cam alt yemekleri gama sterilizasyonu ve ticari premade olarak satın vardır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. EM manuel blot için şematik yapışık nöronlar ile ağlar. Cımbız elle numune leke eklenecektir hangi nem / kurutma odasına için vitrifikasyon makinenin sürgülü giriş yuvasına (siyah ok) (A) Close-up. (B)Kalsiyum içermeyen filtre kağıdı (0.5 cm x 0.5 cm yüz) EM ızgara kurutma için vitrifikasyon makinenin nem odası içine düz nokta cımbız kullanılarak işlenebilir ve giriş yuvası aracılığıyla eklenir gerektiğini gösteren Çizgi düzeni üzerinde nöronlar (pembe hücre medya damlacık gösterilen) yapıştırılır. EM ızgara nem odasının içine ince nokta uzman cımbız tarafından düzenlenmektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Sıçan primer nöronlar Gro olmuştur hangi bir EM ızgara merkezi alanı 10X büyütmede altın elektron mikroskobu (EM) ızgaralar üzerine dondurulmuş, hidrate nöronlar görselleştirme. (A) Işık mikroskop görüntü2 hafta boyunca kanat. (B) Zoomed-in (A) 'da gösterilen su kutusunun görünümünde, burada nöronlar ve akson uzantısı (pembe oklar) görebilir. Nöron gövde (kırmızı ok) dışarı doğru çıkıntı yapan bir akson 4K büyütmede (C) elektron mikrografı. Şematik olarak (B) 'de gösterilen ızgara, karelerden oluşan bir mesafede olan bir alan (yani kırmızı kutu) karşılık gelir. Nörit iç özellikleri açıkça 20k büyütme görülebilir nerede mavi kutu, (D) yakın-up bakıldı (yeşil ok mitokondri; Turuncu ok mikrotübülüsleri; kesecik mavi ok). resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Bir sıçan DRG akson tomografisinde 3-D yeniden yapılanma ve açıklama. (A), bir DRG akson farklı eğim açılarında çekilen görüntülerin bir yeniden yığından Tomografik dilim. (B) aynı akson 3-D notuna karşılık gelir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. 4k büyütme aksonal projeksiyonlar (kırmızı kutu) ile bir sıçan DRG nöron (merkez-sol) 2-D cryo-EM görüntü. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 6,. Tek bir fare DRG akson dört 2-D cryo-EM görüntülerin montaj. Her görüntü 20k büyütmede alınmıştır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 7. Neurites 2-D cryo-EM görüntüler. (A) sıçan DRG akson yakın yakınlık hücre soma görüntülenmiş. (B, C) aşırı kalabalık nöritlerin nedeniyle EM taşıyıcılar üzerine nöronların yüksek kaplama konsantrasyonuna örnekler. Tüm nevrotiler altın EM ızgaraları sonra kaplama flaş dondurulmuş iki hafta vardı. Tüm görüntüler 20k alındı;. Büyütme büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .
Şekil 8,. Bir hipokampal akson farklı eğim açılarında çekilen görüntülerin bir yeniden yığından bir sıçan hipokampal nörit tomografisinde 3-D yeniden yapılanma ve açıklama. (A) Tomografi dilim. (B) aynı akson 3-D notuna karşılık gelir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz sıçan embriyonik nöronlar (dorsal kök ganglion ve hipokampus) altın, elektron mikroskobu (EM) ızgaralar üzerinde büyümüş ve 2-D cryo-EM ve 3-D kriyo-kullanarak görüntülü onların neurites için yeterince ince vitreus buz donmuş olabileceğini göstermektedir ET. Hipokampal nevrotiler önceden kriyo-ET 8,10,18,23 kullanarak görüntülü olsa da, bir protokol eksik olmuştur piyasada mevcut cihazlar kullanılarak başarılı çoğaltma için yeterince ayrıntılı. Araştırma hipokampal nevritlerle görselleştirmek için kriyo-ET kullanımına öncülük ederken Dahası, bizim çalışmalarda nöronal numunenin birden fazla tip kriyo-ET uygulanabilirliğini araştırmak.
Burada, biz EM optimal ince buz elde etmek için onlara kurutma, hipokampus ve dorsal kök ganglion (DRG) nöronlar ile ya ızgaralar hazırlanıyor ayrıntılı bir protokol tanımlamak ve dalma-donma cryo-ET tarafından görüntüleme için onları. Optimal blot zaman, nüfuz elektron ışını için çok kalın buz ile sonuçlanmaz biridirne vitreus buz holey karbon içteki için holey karbon kenarından özellikle farklı gradyan ile çok ince görünür. Ayrıca, vitrifikasyon makineyi 17 kullanılarak optimal ince buz ulaşmada her bir proje için biraz farklı olabilir ve vitrifikasyon makineyi kullanarak güçlü donma bir öğrenme eğrisi gerektirir olabilir.
Önceki araştırmalar da bizim çalışmalarda burada keşfedilmeyi hipokampalinden, odaklanmış olsa da, biz dorsal kök ganglion (DRG) bozulmamış, dondurulmuş sulu tüm akson nanometre ölçeğinde görüntüleri göstermek için daha ileri gitti, kullanmadan önce görüntülü asla kriyo- EM veya kriyo-ET. Onlar (hipokampal nöronlar aksine) sadece akson 34 yol beri DRG hücreler seçildi. Cryo-EM/cryo-ET bunları görüntüleme için bir protokol duyusal nöronlar yani aksonal ultrastrüktürünü anlamak için ilgilenenler için yararlı olabilir. Biz de mevcut ve optimal ve optimal hem de sonuçlarını tartışmak, hem deböyle örnekler için kriyo-ET kullanarak karşılaşabileceği potansiyel eserler gibi.
Uygun hücre konsantrasyonunda (tabak başına 50,000 hücre / ml), nöronların nöritler aralık bir veya iki nöron ızgara-kare (Şekil 3B) başına görünen ile (Şekil 3A ve 3B), bir ışık ve elektron mikroskopi kullanılarak çok iyi erişim sağlar şekildedir . Nöronlar arasında yeterli ayırma izin Krio-EM ile neurites açık görselleştirme (Şekil 3C ve 3D) için gereklidir. Cryo-EM görüntüleri (Şekil 3C ve 3D) açıkça görüldüğü gibi nöronlar ve bunların nevritler altın ızgara bir holey karbon film desteklenir. V için tipik olarak, hipokampal nöronlar ve dorsal kök ganglion (DRG) nöronları 30,33 cryo-EM ile görüntüleme için çok kalın ve tamamen siyah görünür için 15-50 um ~ değişebilir nöron organları,ery elektron-yoğun ve kalın nesnelerin örnekleri, bunlardan yayılan (değil çapı 1 mikron aşan) neurites nispeten daha ince çıkıntılar ile karşılaştırıldığında (Şekil 3C ve 5).
Reçine gömülü 3-D beyin dokusu kesitinin 14 tamamen dairesel nevritler açıklamaz, aslında, morfoloji değişkendir. Neurites dairesel olmayan şekli doğal ya da numune hazırlama dışlayıcı olması durumunda bu nedenle bilinmemektedir. TEM ızgara üzerinde yetiştirilen DRG akson (Şekil 4) arasında ölçülen kalınlığının, 0.32 z-doğrultusunda um (camsı buz derinliğinde) ve 0.53 mikron arasında bir ortalama genişliği olduğu, boşaltıldı ve bu çalışmada gösterildiği gibi, görüntülü xy düzlemi. Hipokampal akson ölçülen kalınlık TEM ızgara üzerinde büyümüş (Şekil 8), boşaltıldı ve bu çalışmada gösterildiği gibi, görüntülü (camsı buz derinliğinde) z-yönünde 0.50 mikron idi ve birxy düzleminde 0.72 um'lik ortalama. Bu lekeleme ve dalma dondurma işleminin tüm süreç boyunca, orijinal tampon maddesi içinde, hidratlı kalmasına rağmen, burada tarif edildiği gibi lekeleme işlemi nevritler düzleştirmek olabilir.
Burada gösterildiği gibi cryoET tarafından gözlenen ızgara üzerinde neurites hafif düzleşme neredeyse mükemmel dairesel ve dehidratasyon belirtileri gösteriyor ki, bu tür kesecikler gibi kendi iç bileşenlerinin yapısını etkileyen görünmüyor. Buna karşılık, genellikle geleneksel 'EM preparatlar, etanol, ardından dehidrasyon glutaraldehid ve paraformaldehit ile, özellikle kimyasal sabitleme, kullanılan kimyasal işlemler kontrolsüz doku büzülmesine neden olur. Böyle bir zararlı etkisi hücresel karşılaşma potansiyeli bizim el yazması cryoET için mevcut yöntemle elimine edilir.
Ayrıca, neurites numuneleri hemen i sonuçlanan sıvı etan dalma-donduruldunstant vitreus buz 'katıştırma'. Bir camsı halde dondurulur Dokular, çok daha ucuz fizyolojik durumuna, diğer yöntemlere göre daha görünür. Ultrastrüktürel ayrıntı düzeyi bizim protokol açıklanan teknik nörobilim araştırmacılar için değerli kılan tek yönü değildir. Farklı altında nöronların ultrastrüktürünü incelenmesi olanağı açılır çünkü EM ızgaraları nöronlar büyüyen tekniği, hemen kurutma / dalma-dondurma cryoET ile tarama / görüntüleme için camsı halde korumak için onları çekici bir tekniktir, genetik, kimyasal veya çevresel Potansiyel dehidratasyon eserler endişe olmadan vurguluyor.
Dondurulmadan önce lekeleme koşulları, bu protokolde ayrıntılı olarak, bu tür mitokondri, keseler ve mikrotübüllere (Şekil 4, 6 gibi iç bileşenler dahil ultrastrüktürel özellikleri, kriyo-ET tarafından görselleştirme için yeterince ince buz üretmek için önemlidir 7A). Bu kriyo-elektron tomografisi 20 ile (fare embriyonik fibroblastlar kenarları) hücrelerinde görülmüştür ne yapısal olarak benzer görünür tarihi mitokondri, örneğin bizim preparatlarda tespit edilebilir. Onlar da bu yazıda mevcut 3-D renk açıklamalı görüntülerde görülebilen, kristalarında gösterilecek. Optimumun altında görsel cryo-EM görüntü akson içinde mitokondri ve mikrotübüller gibi özelliklerin başarılı kimlik önlenmesi, genellikle opak görünen kalın buz neden olabilir. Özellikle neredeyse kesinlikle neurites 8,10,17,23 ultra yapısını tanımlarken sınırlı başarısına katkıda optimal ince buz üretmek için nasıl ilgili, bu tür örneklerin hazırlanması için yeterli ayrıntı eksikliği.
Optimumun altında görüntüler, nörit (Şekiller içinde kalabalık ile sonuçlanır, (> tabağı başına 50,000 hücre / ml) ızgara üzerinde çok fazla nöronlar kaplama kaynaklanabilir0, 7B ve 7C). Bulanık görüntü yanlış flulaştırmayla bir sonucu olabilir ve ayarlanabilir olmalıdır, burada gösterilen görüntülerde odaksızlık 7 mikron hedeflenen underfocus ile alınmıştır. Görüntüler yüksek kontrast ve ultrastrüktürel özellikleri görünürlüğünü sağlamak için bu defokusta toplandı, ancak daha düşük bir odaksızlık (yani 2-3 mikron) de bu özellikleri daha yüksek çözünürlük bilgilerini elde etmek için kullanılabilir.
Diğer faktörler optimal görüntüleri katkıda bulunabilir. Bu vitrifikasyon makinesi, özellikle yarı otomatik kurutma özelliği, yerine burada tarif edilen el ile lekeleme diğer özelliklerini kullanmak için cazip olabilir, ancak örneğin, bu istenmeyen sonuçlar vermiştir. Çift taraflı lekeleme başlangıçta (yerine kullanıcı daha) vitrifikasyon Makine, doğrudan kullanıcı tarafından belirlenen zaman ve lekelerinin sayısı lekeleme gibi parametreler kullanılarak örnek ışınlarını bloke edildiği, bu yarı-otomatik özelliği kullanılarak denendi. Bununla birlikte, after görüntüleme gibi örnekler, bütün nöronlar kendi içeriklerini (multiveziküler cisim, vb) dışarı dökülüp, açık lize olduğu tespit edilmiştir. Bu nedenle, vitrifikasyon makine en Numune donma dalma öncesinde lekelendi edildiği sıcaklığı kontrollü nem odası için bu durumda kullanılır. (% 100'e yakın ayarlanmış nem ile) böyle bir durumda örnek bakımı hazırlanması sırasında su kaybını en aza indirir ve sağlamak için yardımcı olur optimum vitreus buz sonrası dondurma 3,7.
İdeal olarak, dış pertürbasyonlar için, nöronların maruz kalmasını en aza indirmek için, bu vitrifikasyon makine ile oda yakın bir CO2 inkübatör (37 ° C sıcaklığa ayarlı) ve bu cihaz için sıcaklık yetiştirilmelidir ayarlanmalıdır 37 ° C önce yanıp-dondurma EM ızgaraları nöronlar. Bir önceki Blot için büyük sıcaklık dalgalanmaları nöronların maruz kaçınmalısınız. Bu raporda, sıcaklığı 32 ° C kurulduamaçlı kurutma için, nöronlar farklı bir binada yetişen ve 10 dakika ~ bir zaman atlamalı bir odadan diğerine nöronların plakaları taşıyan arasında meydana geldi. Bakım taşıma işlemi sırasında suya dayanıklı, yarı-yalıtımlı kapta örnekleri korumak için alındı. Kendi medya biyogüvenlik altında değiştirilmesi için nöronlar kuluçka odasının dışına alındığında sıcaklık ve CO 2 konsantrasyonunda benzer bir değişiklik (önceki lekeleme / dalma-dondurulmadan nöronlar tarafından deneyimli olarak) her ~ 2 gün nöronların meydana davlumbaz, genellikle nöronal kültürler için yapıldığı gibi. Bu durum, hücre için toksik etkilere neden görülmemektedir.
Elektron-yoğun olması neurites 'mitokondri içinde granüller görünen şeyin varlığı ile ilgili olarak, birçok çelişkili raporlar var. Bu granüller çeşitli dokularda çeşitli değil, özellikle nöronal hücreler bulunur. Bunlar iç iyonik düzenleyen katyonların bir lavabo olarak algılanmaktadır trmitokondri vironment. Onlar da enzimler verimli 16 işlev hangi iç ve dış mitokondriyal membranlar arasındaki temas siteleri oluşturmak için görünür.
Deneysel çalışmalar bu iyonlar sıvı banyo izole mitokondri ya da sağlam hücreler ya da içinde mevcut olduğunda, kalsiyum ve diğer iki değerli katyonlar, mitokondri birikir olduğunu göstermektedir. Bu iyonların organik olarak önceden var olan içi mitokondriyal granüllere bağlı olacağıdır. Bu granüller, mitokondri 31 iç iyonik çevrenin düzenleme ile bağlantılı olduğunu, bu nedenle tavsiye edilir.
Ayrıca, hazırlık olarak nöronlar 14 gün EM ızgaraları kültürlenmiştir, zamanlama önceki cryoEM / ET ile görüntüleme için nörit gelişimi 15,36 amaçları için tipiktir. Bu youn kıyasla yaşlı nöronlarda hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda bir artış olduğu bildirilmiştir g 32 nöronlar. Bu nedenle, hücre içi kalsiyum daha yüksek bir varlığı sahip, çünkü bu yaşlı nöronların nevritlerin içinde mitokondri ille stresin bir işareti olarak değil, mitokondriyal granülleri gösterecek olması akla yakındır.
Elektron-yoğun mitokondriyal granüller aynı zamanda kültür yetiştirilir ve el yazması 20 içinde kullanılan ile aynı teknolojisi (kriyo-elektron tomografisi) tarafından görüntüsü fare embriyonik fibroblastlar bildirilmiştir. Bu hücreler, sitoplazma içi iskelet bozulması ve dejenerasyon gibi hücre hasarı ile ilişkili ultrastrüktürel değişim, tipik şekilleri, göstermemiştir. CryoET tarafından görüntülendi Aynı şekilde, bizim neurites içinde, biz aksi hücresel toksisite ile ilişkili olacak bir kesintiye iskeletinin gözlemlemek vermedi. Yukarıdaki hususlar göz önüne alındığında, bizim hazırlanmasında nöronlar stres veya toksisite sonucu mitokondriyal granüller göstermemiştir sonucuna vardık.
içeriği "> nöronlara kirlenmesini önlemek için EM ızgara yüzeyine sterilize etmek için ve aynı zamanda önceki nöronlar kaplama için EM ızgaraları alev, poli-L-lisin bağlı olabilir için EM ızgara üzerinde olumlu bir, hidrofilik bir yüzey elde etmek için bulunmuştur kızdırma olmak zaman avantajlı olduğu. bu biyo-güvenlik başlığı içinde daha uzun bir süre (örn. 20-30 dakika) için ızgaranın ışınlama gerektirdiğinden UV sterilizasyon seçilmedi. sonra ızgaralar çevreye tekrar tekrar maruz olması gerekir -deşarj. ızgara Glow-boşaltma ızgaranın yüzeyini hidrofilikleştirmedir amaçları için hidrofilleme adımı ve sterilizasyon adımı hem de birleştirir beri takip eden poli-lisin kaplama şebekeye olur etkili bir 'sopa'. ızgaralarını yanan tekniği avantajlı olmasını sağlar birinde. İlköğretim nöronların tümör-tabanlı hücre hatları daha duyarlı olduğu bilinen ve mümkün olduğunca steril olarak çevre (ızgara, Petri) tutmak için çok önemlidir vardır.(Şekil 3C ve 5), bir düşük büyütme görüntü almak için tercih edilir bir görüntü için hangi nörit . Ardından, 2-D cryo-EM görüntüleri aralıklarla alınabilir ve dijital (Şekil 6) Montajda içine dikilir. Bu teknik, tek cryo-EM resmin daha büyük bir alan üzerinde, örneğin mikrotübül organizasyon olarak ince yapı özellikleri için yararlı olabilir.
, Düşük doz, düşük büyütme görüntü (Şekil 3C ve 5) alınması (deliklere ve karbon üzerinde her ikisi de) ve görüntüleme için bu nedenle daha ideal holey karbon film arasında çapı tutarlıdır akson alanların belirlenmesi da yararlıdır ve daha sonraki analizler. Karbon film deliklerinin üzerine neurites genişletmektir genellikle büyük Neur görülürbelirecektir ince nevritlerin (Şekil 3C) daha açık bir şekilde daha fazla dahili bir malzeme ile (Şekil 5). Bu olgu nedeniyle karbon filmin delikleri fiziksel desteğinin olmaması nedeniyle meydana geldiği düşünülmektedir. EM ızgara nöronlar artan edildiği tabak çıkarılır ve daha sonra, arka ikinci boşaltıldı edildiğinde, diğerlerine göre daha fazla dahili kütle (Şekil 5) (Şekil 3C) ile neurites deliklere genişletmek ve / veya sarkma eğilimindedir. Bu bir obje olarak görünse de, daha açık bir şekilde akson dahili bileşenleri göstermek için bir yararı vardır. Bu holey karbon film üzerine bindirilmiş sürekli bir karbon filmi kullanılarak gelecekteki çalışmalarda bu sorunu aşmak için yardımcı olabilir. Bu kurulum başlangıçta denedi ama görüntüleme için çok kalın vitreus buz sonuçlanmıştır. EM ızgara üzerine bindirilmiş sürekli karbon farklı kalınlıklarda sonraki çalışmalarda ileri araştırmalar gerekebilir.
Bir impormevcut yöntemin tant yararı akson içindeki hücre bileşenlerinin mekansal organizasyon farklı eğim açılarında bir tek akson birkaç 2-D görüntü alarak, ve bir tomografisinde resimlerin içine bu destesini yeniden tarafından nanometre ölçeğinde görsel olmasıdır. Bir sıçan E18 dorsal kök ganglion bir akson (DRG) gösterildiği gibi tek yapısal özellikler daha sonra elle (Malzeme ve reaktiflerin tabloya bakınız) uygun yazılım kullanarak farklı renklerde 3-D yığınının her 2-D dilim için açıklamalı olabilir nöron (Şekil 4) ve bir sıçan E18 hipokampal nöron bir akson (Şekil 8).
Yerine 1 ya da 2 ° 'den, eğim, bir görüntü serisi sırasında her 5 derece almak için seçerek, daha az görsel toplanır ancak daha yüksek bir elektron dozu imajlar kullanılabilir. Bu, daha yüksek kontrast ve ham görüntülerde daha az gürültü ile sonuçlanır. Bu bir st gibi çapraz korelasyon ile rekonstrüksiyon (uyum amaçları için iyidir ep) ve z-doğrultusunda tomogram yığını ihtiva eden her bir görüntü için el ile yapılan bir sonraki tomogram açıklama. Bir artış boyutu seçimi de numunenin büyüklüğüne bağlıdır, farklı eğim açıları arasında, daha büyük numune kadar değişiklik olmaz. Bu durumda, daha büyük bir artışı büyüklüğü (5 °) kullanılarak nedeniyle akson nispeten büyük numune ebatları daha uygun olduğu düşünülüyordu.
Ayrıca istenirse, EM şebekeye fiducial altın belirteçleri ekleyerek ince görüntü uyum için yardımcı olacaktır. Diğer örnek cryo-EM örnekleri (tek başına ya da virüs proteinleri) göre daha büyük ve 2-D görüntülerin her biri uygun bir şekilde hizalanması için kullanılabilecek yapısal özellikler çeşitli yüksek kontrast gösterdi, çünkü referans işaretleri kullanılmamıştır Çapraz-korelasyon (3-D yığını ihtiva eden). Çıkan görüntü yığını de bu yaklaşımı kullanarak hizalanmış ve sonraki 3-D renk açıklama için kullanılabilir edildi.
ent "> gelecek çalışmalar için, bir enerji filtresi ile bir mikroskop kullanılarak elastik olmayan dağınık elektronlar ancak böyle bir özellik en çok elektron mikroskopisi tesislerinde hazır olmayabilir kaynaklanan gürültüyü azaltabilir. Bizim prosedür görüntüler, standart bir 200 kV mikroskop neden olabilir ne ortaya hiçbir enerji filtreli, hangi geniş nörobilim topluma daha yaygın kullanılabilir olabilir.Burada açıklanan protokol hazırlanması ve cryo-EM ve cryo-ET için ticari olarak mevcut ekipman kullanarak sıçan embriyonik DRG akson ve hipokampal nevritlerle hem görselleştirme için optimize edilmiştir. Bu tekniğin en önemli avantajlarından biri de, kesit değil bütün nöritlere yapısal bilgi, bunların ultra yapısını görüntülemek için, öğütülmüş ya da çeşitli kimyasal reaktifler ile tedavi verir olmasıdır. Biz cryo-ET etkisini incelemek için bir yakın-to-yerli halde nöron ultrastrüktürel analizler gelecekte kullanılmak için özellikle mükemmel bir yöntemdir kadar göstermiştirnörit yapısına nörolojik hastalık.
Aşağıdaki gibi, bu yazıda belirtildiği gibi 3-D tomogram için Elektron Mikroskobu Veri Bankası katılım numaraları: sıçan hipokampal akson için EMDB, (8:45-09:01 'dan itibaren), Şekil 8 ve ana video gösterildiği gibi erişim numarası EMD-5887 olduğunu. Şekil 4 ve (9:02-09:15 'dan itibaren) ana video gösterildiği gibi sıçan dorsal kök gangliyon akson için, EMDB erişim numarası EMD-5885 olan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu araştırma NIH hibe (PN2EY016525 ve P41GM103832) tarafından desteklenmiştir. SHS Gulf Coast Konsorsiyum (NIH Hibe No T32EB009379) Disiplinlerarası Biyobilim Eğitim WM Keck Merkezi'nin Nanobiyoloji Disiplinlerarası Lisansüstü Eğitim Programı bir burs ile desteklenmiştir.
SHS, disseke büyüdü ve DRG ve hipokampus hücrelerini vitrifiye, cryo-EM ve DRG ve hipokampal akson kriyo-ET toplanan verileri, yeniden ve tilt serisi renk açıklamalı. MRG disseke ve MnR laboratuarında hipokampal hücreleri sağladı. SC tilt serisi açıklama destekli. SHS nöronlar incelemek ve büyümeye nasıl CW tarafından eğitildi. SHS, WCM ve WC deneyler tasarlanmıştı. SHS diğer yazarlar girişi ile el yazması hazırladı.
Bu video t Biozentrum Hücresel Görüntüleme ve NanoAnalytics (C-Cina) için Merkezi'nde çekildiÜniversite Basel diye. C-Cina Basel, İsviçre'de bulunan ETH Zürich arasında Biyosistem Bilimi ve Mühendisliği (D-BSSE) için Bölümü entegre edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al.
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al.
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al.
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G.
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al.
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
