Summary
Per conservare processi neuronali per l'analisi ultrastrutturale, si descrive un protocollo per la placcatura di neuroni primari su Electron griglie microscopia seguite da congelamento flash, ottenendo campioni sospesi in uno strato di ghiaccio vitreo. Questi campioni possono essere esaminate con un microscopio crio-elettroni per visualizzare le strutture in scala nanometrica.
Abstract
Neuriti, entrambi i dendriti e degli assoni, sono processi cellulari neuronali che consentono la conduzione degli impulsi elettrici tra i neuroni. Definire la struttura dei neuriti è fondamentale per capire come questi processi si muovono materiali e segnali che supportano la comunicazione sinaptica. La microscopia elettronica (EM) è stato tradizionalmente usato per valutare le caratteristiche ultrastrutturali all'interno neuriti, tuttavia, l'esposizione a solventi organici durante la disidratazione e resina embedding può distorcere strutture. Un importante obiettivo insoddisfatto è la formulazione di procedure che consentano alle valutazioni strutturali non interessate da tali artefatti. Qui, abbiamo stabilito un protocollo dettagliato e riproducibile per la coltivazione e il flash congelamento neuriti interi di diversi neuroni primari di elettroni griglie di microscopia seguita dalla loro esame con crio-elettroni tomografia (crio-ET). Questa tecnica permette di visualizzazione 3-D di surgelati, neuriti idratati a risoluzione nanometrica, facilitando assessment delle loro differenze morfologiche. Il nostro protocollo produce una visione senza precedenti della radice dorsale ganglio (DRG) neuriti, e una visualizzazione dei neuriti dell'ippocampo nel loro stato quasi native. Come tali, questi metodi creano una base per gli studi futuri su neuriti di entrambi i neuroni normali e quelle colpito da disturbi neurologici.
Introduction
I neuroni stabiliscono il complesso essenziale circuiteria per la funzione del sistema nervoso centrale e periferico elaborando dendriti ricevere informazioni e assoni, spesso molto lunghe, per comunicare con i neuroni a valle. Crescita dei neuriti gioca un ruolo fondamentale durante lo sviluppo embrionale e la differenziazione e la manutenzione di neuriti neuronale supporta criticamente la funzione del sistema nervoso. Processi neuritic dispongono inoltre criticamente in danno neuronale e rigenerazione, così come disturbi del sistema nervoso. Lo studio di architettura neuronale è fondamentale per capire sia il cervello normale e malato. Fortunatamente, fisiologicamente rilevanti sistemi di coltura di cellule neuronali esistono che possono ricapitolare strutture cellulari complesse ed eterogenee. Sulla base della spiegazione di piattaforme sperimentali solide strategie di visualizzazione efficaci che consentano analisi qualitative e quantitative di morfologia neuronale sono necessari. Particolarmente utile sarebbeuna metodologia dettagliata che fornisce una piattaforma coerente per la visualizzazione neuriti, sia assoni e dendriti in scala nanometrica.
Microscopia elettronica tradizionale richiede l'uso di solventi organici durante la disidratazione e l'incorporamento resina, che può indurre distorsioni nei campioni dal loro vero stato. Ad oggi, la maggior parte delle caratterizzazioni strutturali a scala nanometrica sono basati su cellule o tessuti più grandi che sono sottoposti a tali sostanze chimiche aggressive - limitando così l'interpretazione dei risultati 4,9,25. Inoltre, per la penetrazione fascio di elettroni, sezionamento è necessaria per gli organismi o sporgenze cellulari che presentano uno spessore maggiore di 1 micron 12. Infine, sezionato o lavorato risultati tessuto in collezione di insiemi di dati discreti specifico slice, rendendo ingombrante la definizione della funzione allungata di neuriti. Anche per crio-EM, in cui sezionando un campione congelato-idratato è possibile, il metodo introduce artif compressioneatti 1.
Negli ultimi anni, i ricercatori hanno imparato a coltivare i neuroni dell'ippocampo direttamente su griglie EM e-flash congelamento loro in etano liquido per visualizzare successivamente neuriti con crio-ET 8,10,18,23. Tuttavia, tali studi né usano un dispositivo su misura 10,23, oppure dettagli mancanza sul gradino assorbente per la generazione di ghiaccio vitreo abbastanza sottile per la visualizzazione di routine 8,18. Per esempio, uno studio raccomanda l'uso di 30-40 sec per blotting griglia EM 10, tuttavia, questo valore non è ottimizzata per uso generale, ma è specifico per il dispositivo-tuffo congelamento misura. Utilizzando un dispositivo su misura, piuttosto che un disponibile in commercio un 17 per mantenere l'umidità prima di immergersi congelamento del campione potrebbe rappresentare un ostacolo per la diffusa riproducibilità.
Anche se questi studi sono stati Innovativo nel visualizzare neuriti da crio-ET, abbiamo compiuto un ulteriore passo avanti per esplorare l'applicability di crio-ET ad una varietà di esemplari neuronali (ippocampo e gangli delle radici dorsali neuroni). Inoltre, si discute sia i risultati ottimali e non ottimali, così come i potenziali artefatti che si potrebbe riscontrare utilizzando crio-ET per tali esemplari.
Definizione di una tecnica dettagliata per la conservazione e la visualizzazione di neuriti interi su scala nanometrica in uno stato quasi native aumenterebbe la possibilità per i più ricercatori di effettuare studi ultrastrutturali. A tal fine, si descrive un protocollo efficace e dettagliato utilizzando apparecchiature disponibili in commercio per la preparazione non fissati, i neuroni non colorati per visualizzare neuriti. Questo è un primo importante passo verso dettagliare l'ultrastruttura dei neuriti sani e di gettare le basi per capire quali sono presenti in modelli di malattia del sistema nervoso differenze strutturali. Poiché crio-ET in grado di risolvere non fissate, le caratteristiche dei neuriti non colorati in 3-D su scala nanometrica, il metodo renderà possibile, come mai esserepertanto definire architettura neuritic 12.
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Protocol
1. Preparazione di piatti con EM griglie per la placcatura neuroni primari
- Esaminare l'integrità di carbonio bucata sulle griglie oro EM utilizzando un microscopio ottico a ingrandimento di almeno 25X. Assicurarsi che i fori di carbonio sono> 98% intatto.
- Per placcatura neuroni primari, utilizzare un becco Bunsen a fiamma sterilizzare le griglie EM e contemporaneamente renderli idrofilo. Utilizzare le pinzette per raccogliere la griglia di EM per il bordo, non è la zona reticolata centrale. ATTENZIONE: Non lasciare mai un becco Bunsen acceso incustodito, e non utilizzare guanti o pinze con componenti in plastica durante l'esecuzione di questi passaggi:
- Prima di accendere il bruciatore Bunsen, impostare le regolazioni aria e gas in una posizione minimamente aperta.
- Accendere il becco Bunsen con una selce attaccante o butano.
- Modificare le regolazioni aria e gas per ottenere un piccolo, fiamma interiore blu all'interno di un più alto, più leggera fiamma blu / violetto. La punta della fiamma interiore è la parte più calda della fiamma. La manopola sottoneath il bruciatore regola la quantità di gas di penetrare nel tubo del bruciatore, mentre la canna del bruciatore può essere ruotata per regolare la quantità di aria che entra nel bruciatore. Ruotando la regolazione dell'aria in senso orario diminuisce l'aria (risultante in una fiamma viola) e in senso antiorario, l'aria (risultante in una fiamma gialla).
- Con una pinzetta in metallo (senza parti in plastica) per tenere la griglia di EM, passare rapidamente attraverso la fiamma per due volte, di fronte carbonio-side up. Il lato carbonio apparirà più opaco (meno lucida) e con più di una tinta grigio rispetto al lato opposto.
- Trasferire immediatamente la griglia (carbonio-lato alto) nel centro del piatto fondo di vetro collocato entro 10 cm dal becco Bunsen. Utilizzare una griglia di EM per ogni piatto (Figura 1). Utilizzare solo piatti con fondo di vetro che sono presterilized, vale a dire tramite raggi gamma.
- Utilizzare un microscopio ottico per controllare l'integrità della rete (buchi di carbonio intatto) pur mantenendo la griglia EM all'interno del vetro-bottpiatto om (per evitare contaminazioni). Quando si applica qualsiasi sostanza sulla griglia o qualsiasi cosa che verrà in contatto con i neuroni, utilizzare procedura sterile e puntali sterili.
- In una cappa di coltura utilizzando la procedura sterile, applicare 250 microlitri della sostanza di rivestimento appropriato lentamente e accuratamente la superficie vetrata centrale della piastra di Petri. Assicurarsi che l'appropriato sostanza di rivestimento copre l'intera griglia EM.
- Per neuroni ippocampali, utilizzare poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) come sostanza di rivestimento, preparato come descritto in precedenza 19. Si noti che 250 microlitri sono necessari per griglia EM, per ogni piatto, in modo da scalare il lotto di conseguenza. Per i gangli spinali (DRG) neuroni, utilizzare una miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del sarcoma del mouse (vedi Tabella dei Materiali e reagenti) come sostanza di rivestimento, preparare quanto segue. Si noti che 250 microlitri sono necessari per griglia EM, per ogni piatto, in modo da scalare il lotto di conseguenza.
- Scongelare una bottiglia stockdella miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del mouse sarcoma notte a 4 ° C.
- Mantenere freddo miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del sarcoma topo, e tutti i componenti utilizzati per rendere la soluzione, ossia del loro mantenimento sul ghiaccio.
- Mentre su ghiaccio, diluire questa miscela proteica gelatinosa Neurobasal mezzo per ottenere una diluizione 1:20 (cioè attenuare 500 microlitri della miscela proteica gelatinosa in 10 ml di Neurobasal).
- Dividere diluito miscela proteica gelatinosa in aliquote da 1 ml, e memorizzare immediatamente eventuali aliquote supplementari a -20 ° C.
- Applicare 250 microlitri per griglia EM, per ogni piatto, come descritto nella Sezione 1.4.
- Per neuroni ippocampali, utilizzare poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) come sostanza di rivestimento, preparato come descritto in precedenza 19. Si noti che 250 microlitri sono necessari per griglia EM, per ogni piatto, in modo da scalare il lotto di conseguenza. Per i gangli spinali (DRG) neuroni, utilizzare una miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del sarcoma del mouse (vedi Tabella dei Materiali e reagenti) come sostanza di rivestimento, preparare quanto segue. Si noti che 250 microlitri sono necessari per griglia EM, per ogni piatto, in modo da scalare il lotto di conseguenza.
- Coprire il piatto Petri con la sua parte superiore e incubare (sia con PLL per campioni ippocampali, OR con miscela proteica gelatinosa per campioni DRG) per 1 ora a temperatura ambiente nella cappa coltura tissutale.
- Aspiclassificare tutti PLL (per campioni di ippocampo) o miscela proteica gelatinosa (per campioni DRG) dai piatti. Per effettuare questa operazione, utilizzare il sistema di aspirazione della cappa coltura tissutale. Utilizzare un puntale sterile attaccato al tubo a vuoto. Evitare il contatto diretto con la rete EM.
- Utilizzare una pipetta a spostamento d'aria regolabile attentamente applicare 250 microlitri di PBS sterile (PBS) alla griglia EM nella zona centrale in vetro di ogni piatto Petri, tale che la griglia EM è completamente coperto da PBS. Poi, aspirare il PBS da ogni piatto. Ripetere 3x.
- Lasciare i piatti con griglie EM ad asciugare sotto il cofano coltura di tessuti per 15 min. Assicurarsi che siano completamente asciutti controllando al microscopio luce nella stanza coltura di tessuti. Assicurarsi che non vi siano bolle di umidità nella griglia. Se è così, attenzione aspirare accanto alla griglia EM per eliminare questa umidità supplementare. La griglia rivestita deve essere usato immediatamente per la placcatura di neuroni.
2. Preparazione e Plrativo Primaria neuroni su EM griglie
- Per piastra neuroni primari, prima sezionare, trypsinize (con 2,5% tripsina) e triturare dissociare il dell'ippocampo (o dorsale radice gangli di 18 giorni di età embrioni di ratto) nelle singole celle, come descritto in precedenza 19.
- Triturare è un termine comunemente usato dai neurobiologi per descrivere dissociazione grumi di cellule in singole celle, in particolare mediante l'utilizzo di una pipetta di vetro con una punta sterilizzata. Il risultato si ottiene con attenzione e lentamente disegno e rilasciando le cellule, su e giù, più volte (~ 30) tramite la pipetta.
- Seguire le procedure descritte in precedenza per DRG dissezione e isolamento delle cellule 24, prendendo atto di usare 0,25% tripsina (in HBSS) per isolare i neuroni DRG di ratto, invece di utilizzare gli enzimi suggeriti (papaina, collagenasi / dispasi) che sono più adatti per il mouse neuroni DRG.
- Calcolare il numero di neuroni isolati (ad esempio con un emocitometro)e utilizzare questo valore per calcolare il volume appropriato di cellule da applicare a ogni piatto per ottenere una concentrazione di 50.000 cellule / ml al piatto. Il volume massimo da applicare è di 250 microlitri. Si noti che questo riempie solo la zona centrale in vetro, non l'intera piastra.
- Incubare i piatti per 30 minuti in un incubatore CO 2 a 37 ° C. Consentono alle cellule di recuperare e di aderire.
- Aggiungere lentamente 1,5 ml di mezzi riscaldati ad ogni piatto, facendo attenzione a non disturbare la griglia EM. Il tipo di supporto dipende dal tipo di cellula (dell'ippocampo o DRG).
- Preparare il supporto appropriato per entrambi neuroni ippocampali 19 o dorsali radice gangliari neuroni 24, che viene riscaldato in un bagno d'acqua a 37 ° C prima dell'uso. Incubare i piatti pernottamento in CO 2 incubatore.
- Per i neuroni dell'ippocampo, cambiare i media il giorno successivo. Cambiare la metà dei media ogni due giorni in poi per 14 giorni. Riscaldare il supporto in un bagno d'acqua a 37 ° prima dell'uso. Per neuroni DRG, il giorno dopo dissezione / placcatura, preparare un nuovo ceppo di media con un agente anti-mitotico (Uridine e 5'-Fluoro-2'-deossiuridina) ottenere una soluzione stock 10 mM di ciascuno, separatamente, utilizzare una finale concentrazione di 10 mM per ciascuno. Rimuovere la metà dei mezzi di DRG (875 ml) e aggiungere 875 ml di mezzi freschi con l'agente anti-mitotico.
- Per neuroni DRG, ogni due giorni per la prima settimana, si alternano a cambiare i media tra i media anti-mitotico e media DRG standard. Per la seconda settimana, cambiare i media DRG standard, ogni due giorni.
3. Vitrifying Neuroni su EM griglie
- Preparare attrezzature e tutto il materiale per il congelamento e la conservazione delle reti oro EM a temperatura criogenica: un dispositivo di vetrificazione con una camera di umidità 17, fine-point pinzette specializzati per la macchina vetrificazione, pinzette point lungo piatta, Dewar (s) di azoto liquido (LN 2), cContenitore oolant, contenitore griglia EM, carta da filtro priva di calcio.
- Avviare il dispositivo di vetrificazione. Impostare l'umidità al 100% e temperatura di 32 ° C. Nella sezione "Console", impostare il tempo macchia di zero secondi. Questo permette manuale assorbente attraverso il lato-finestra della camera umida della macchina vetrificazione.
- Maneggiare la carta da filtro priva di calcio con i guanti, stratificazione loro tale che tre carte sono impilate. Tagliare la pila a 0,5 centimetri strisce larghe che sono ~ 2 cm di lunghezza. Piegarle a 90 ° in modo tale che un lato della carta ha di 0,5 cm x 0,5 centimetri faccia (Figura 2). Usando le pinzette, rimuovere la carta centrale e metterlo su un altro filtro di carta senza calcio fino al momento dell'uso.
- Mettere il pulsante di memorizzazione griglia nel supporto bottone all'interno della camera di vetrificazione. Riempire la camera interna del contenitore refrigerante con azoto liquido e attendere fino a completa evaporazione. Riempire la camera esterna del secoloe contenitore refrigerante con azoto liquido finché non raggiunge una temperatura stabile per procedere al passo successivo. Riempire la camera interna con elevata purezza etano gassoso che condensano allo stato liquido all'interno della camera raffreddata.
- Spostare il piatto (es) dal termostato a un grande piatto polistirolo 100 mm per il trasporto alla camera vetrificazione, se non nelle immediate vicinanze. Utilizzare le pinzette vetrificazione specializzati per scegliere con cura la griglia EM dal piatto. Si noti che parte i neuroni crescono sulla griglia EM; posizione avrà importanza per il passaggio successivo. Utilizzare il blocco scorrimento nera sulle pinzette per bloccare saldamente le pinzette sulla griglia EM.
- Inserire le pinzette nella macchina vetrificazione tale lato della griglia EM in cui i neuroni sono rispettati volti a fianco, lontano dal foro della macchina vetrificazione apertura laterale. Ritrarre le pinzette specializzati nella macchina vetrificazione.
- Posizionare il contenitore refrigerante nel supporto appropriatodella macchina vetrificazione. Deve essere riempita con un adeguato LN 2 ed etano liquido. Utilizzo del comando schermata appropriata della macchina vetrificazione, sollevare la camera refrigerante verso l'alto fino a quando è lavata con il fondo della camera umida.
- Con le pinzette punta piatta, afferrare un bordo della carta da filtro in modo tale che il lato minore (di 0,5 cm x 0,5 centimetri faccia) è perpendicolare alle pinzette. Questa faccia entrerà in contatto diretto con la griglia EM per blotting (Figura 2B). Inserire delicatamente la carta da filtro nel lato foro della camera di umidità della macchina vetrificazione (Figura 2A). Stabilmente tenere la carta contro la griglia EM (il lato opposto a campione) per 10 sec. Eliminare la carta dopo e subito sprofondare-congelare i campioni in etano liquido utilizzando l'automazione della macchina vetrificazione.
- Trasferire accuratamente la griglia EM frozen-idrato ad uno degli slot in uno deipulsanti di storage di rete. Ripetere la procedura per ulteriori griglie EM nei piatti. I pulsanti di storage di rete EM utilizzati in questi esperimenti possono memorizzare più griglie EM congelati-idratata.
4. Immagine raccolta, elaborazione, e annotazione
- Procedere per raccogliere microscopio elettronico 2-D e / o 3-D serie tilt 5 dei neuriti utilizzando un microscopio crio-elettroni in condizioni di basse dosi. Le immagini 2-D sono stati destinati a valutare la qualità della rete in termini di spessore del ghiaccio e le possibili aree utili per serie tilt 3-D.
- In questo caso, tutte le immagini sono stati raccolti usando una camera CCD 4k x 4k attaccato ad un microscopio elettronico a 200 kV equipaggiata con un solo conduttore inclinazione azoto liquido trasferimento criogenico, a 20k microscopio ingrandimento ad un bersaglio underfocus di 7 micron e campionamento di 4,4 Å / pixel.
- Per ottenere una tomografia 3D del campione, prendere una serie di immagini di proiezione, mentre incrementale inclinando il campione along un asse del microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Date le inclinazioni e le altre impostazioni sperimentali, ci sono diversi software differenti disponibili per raccogliere automaticamente le serie tilt 5. La serie tilt 3-D mostrato qui sono stati raccolti sulla stessa microscopio usando semiautomatico software di acquisizione serie inclinazione 26 in un intervallo di -60 ° a 60 ° a 5 ° incrementi con una dose cumulativa di ~ 60 e / a 2.
- Ricostruire la serie inclinazione dei neuriti utilizzando un software di elaborazione delle immagini 21 come precedentemente descritto per altri campioni 5,29.
- Colore-annotare le caratteristiche 3-D del neuriti dal primo segmentando il tomogramma e creando un modello di superficie utilizzando una 3-D software di elaborazione di immagini come descritto in precedenza 5.
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Representative Results
Prima di congelamento e di imaging via crio-ET, immagini al microscopio di luce dovrebbero essere prese della rete EM in cui i neuroni sono in crescita. Neuriti dovrebbero essere chiaramente visibile senza sovrapposizione significativa tra loro. Una casella colorata in Figura 3A rappresenta una zona che è ingrandita per mostrare un ingrandimento maggiore nella Figura 3B, in cui neuriti estendono attraverso la struttura a reticolo della griglia. Ciascuna griglia quadrati è composto da una pellicola di carbonio bucata che supporta i neuroni e le loro neuriti. Questi fori sono evidenti in una bassa dose crio-EM immagine presa durante 4k ingrandimento, che mostra il corpo neurone come relativamente grande,, oggetto scuro elettrone-denso (Figura 3C), da cui neuriti progetto verso l'esterno.
Una parte del riposo neurite sopra un foro al carbonio è selezionato in una casella colorata in Figura 3C, ed ingrandita con un ingrandimento maggiore (20k) in Figura 3D. A questo ingrandimento, chiare strutture cellulari interne comprese microtubuli, vescicole e mitocondri dovrebbero essere chiaramente evidente (Figura 3D), in particolare nel ghiaccio ottimale sottile come generato mediante questo protocollo. Le strutture nere scure nel centro dell'immagine (Figura 3D) sono particelle di ghiaccio esagonali che sono considerati come contaminazione e devono tipicamente essere evitati, tuttavia, dato che essi sono molto scarse e al di fuori dei neuriti stessi, non interferiscono con la ricostruzione e colore annotazione delle strutture interne di analisi e di interpretazione (Figura 4). Un'altra basso dosaggio, immagine basso ingrandimento è mostrato in Figura 5, da cui un neurite puo essere, dopo che diverse immagini 2-D possono essere presi e digitalmente cuciti insieme utilizzando un software di elaborazione di immagini per generare una sequenza (Figura 6).
L'inizialeconcentrazione di placcatura bassa (50.000 cellule / ml per piastra) di neuroni sulle griglie EM permette di neuroni che sono distanziate abbastanza distanti per garantire una chiara visualizzazione dei neuriti (Figura 3C); concentrazioni superiori negativa (> 50.000 cellule / ml per piastra ) può risultare in immagini non ottimali di neuriti affollati che sono difficili da rintracciare o attributo componenti cellulari (Figure 7B e 7C).
Figura 1. Schema per la coltivazione di neuroni sulle reti EM all'interno piatti con fondo di vetro. (A) piatti con fondo di vetro sono mostrati, parzialmente riempito con supporti cellulare (rosa). (B) Ogni piatto contiene una griglia d'oro EM, come una visione più ravvicinata rivela. (C) Rivestimento del EGriglia M con poli-lisina è mostrato come un cartone laterale sezionata. Il piatto fondo di vetro è composto da un vetrino di vetro quadrato che è collegato al fondo di una capsula di Petri in plastica, che copre una apertura circolare che originariamente tagliato fuori dal fondo. Questi piatti sono peggiori di vetro sterilizzati ai raggi Gamma e commercialmente acquistato come premade. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Schema per blotting manuale di EM griglie con i neuroni aderito. (A) Close-up di slot di ingresso scorrevole della macchina vetrificazione (freccia nera) per l'umidità / camera assorbente, in cui saranno inserite le pinzette per cancellare il campione manualmente. (B)Schema del fumetto che mostra come la carta da filtro priva di calcio (0,5 centimetri x 0,5 centimetri viso) dovrebbe essere gestito con le pinze flat-point e inserito attraverso la fessura ingresso nella camera umida della macchina vetrificazione per asciugare la griglia EM su cui i neuroni siano rispettati (gocciolina di supporti cellulari rosa mostrato). La griglia EM è detenuto da fine-point pinzette specializzati all'interno della camera di umidità. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Visualizzazione congelati, neuroni idrate su oro microscopia elettronica (EM) griglie. (A) microscopio luminoso ingrandimento 10X della zona centrale di una griglia EM su cui neuroni primari di ratto sono stati groala per 2 settimane. (B) vista ingrandita della scatola aqua in (A), in cui i neuroni e le proiezioni dei neuriti sono visibili (frecce rosa). (C) al microscopio elettronico a 4K ingrandimento di un neurite sporgente verso l'esterno dal corpo del neurone (freccia rossa). Schematicamente corrisponde ad un'area (cioè la scatola rossa) all'interno di uno dei quadrati della griglia mostrati in (B). Blue box è visto close-up (D), dove le caratteristiche interne della neuriti sono chiaramente visibili a 20k ingrandimento (freccia mitocondri verde, arancione freccia microtubuli; vescicola freccia blu). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. 3-D ricostruzione e l'annotazione di un ratto DRG assone tomogram. (A) fetta tomografica da una pila ricostruito di immagini scattate a diversi angoli di inclinazione di un assone DRG. (B) corrispondente 3-D annotazioni dello stesso assone. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 5. 2-D immagine Cryo-EM di un neurone ratto DRG (centro-sinistra) con proiezioni assonale (box rosso) a 4k di ingrandimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 6. Montaggio di quattro immagini Cryo-EM 2-D di un singolo assone ratto DRG. Ogni immagine è stata scattata a 20k di ingrandimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 7. Immagini 2-D crio-EM di neuriti. (A) Un assone ratto DRG ripreso più stretta in prossimità della soma cella. (B, C) Esempi di sovraffollamento dei neuriti a causa di un'elevata concentrazione di placcatura dei neuroni sulle reti EM. Tutte le neuriti erano in flash-congelato due settimane dopo la placcatura in oro griglie EM. Tutte le immagini sono state prese a 20k;. Ingrandimento Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 8. 3-D ricostruzione e l'annotazione di un ratto dell'ippocampo neurite tomogram. (A) fetta tomografica da una pila ricostruito di immagini scattate a diversi angoli di inclinazione di uno dei neuriti ippocampale. (B) corrispondente 3-D di annotazione dello stesso neurite. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Abbiamo dimostrato che i neuroni di ratto embrionali (ganglio della radice dorsale e ippocampo) possono essere coltivate su oro microscopia elettronica (EM) griglie e congelati in ghiaccio vitreo abbastanza sottile per i loro neuriti essere ripreso con 2-D Cryo-EM e 3-D crio- ET. Mentre neuriti dell'ippocampo sono stati precedentemente fotografato con crio-ET 8,10,18,23, un protocollo abbastanza dettagliato per la replica di successo utilizzando dispositivi disponibili in commercio è stata carente. Inoltre, mentre la loro ricerca ha sperimentato l'uso di crio-ET per la visualizzazione neuriti ippocampali, i nostri studi esplorare l'applicabilità di crio-ET a più di un tipo di campione neuronali.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato preparazione EM griglie sia con ippocampo e gangli delle radici dorsali (DRG) neuroni, cancellando loro di raggiungere in modo ottimale ghiaccio sottile, e tuffiamo-congelamento li per l'imaging da crio-ET. Tempo blotting ottimale è quella che non si traduca in ghiaccio troppo spesso per il fascio di elettroni di penetrare,né troppo sottile che il ghiaccio vitreo appare con gradiente notevolmente diverso dal bordo del carbonio bucata al più interna del carbonio bucata. Inoltre, il raggiungimento di ghiaccio in modo ottimale sottile attraverso l'utilizzo di una macchina di vetrificazione 17 può essere leggermente diversa per ogni progetto, e robusto il congelamento di utilizzare la macchina vetrificazione richiede una curva di apprendimento.
Mentre precedenti ricerche si è concentrata sulla neuroni dell'ippocampo, anche esplorato qui nei nostri studi, siamo andati oltre a mostrare le immagini in scala nanometrica di assoni intatti, intere congelate-idrato del ganglio della radice dorsale (DRG), mai ripreso prima di utilizzare crio- EM o crio-ET. Cellule DRG sono stati scelti in quanto (a differenza di neuroni ippocampali) esclusivamente danno luogo a assoni 34. Un protocollo per loro l'imaging da cryo-EM/cryo-ET potrebbe essere utile per coloro che sono interessati a dedurre ultrastruttura assonale cioè in neuroni sensoriali. Abbiamo anche presentare e discutere i risultati sia ottimali e non ottimali, come purecome i potenziali artefatti che si potrebbe riscontrare utilizzando crio-ET per tali esemplari.
Alla concentrazione adeguata delle cellule (50.000 cellule / ml per piastra), la spaziatura dei neuroni è tale che neuriti permettono eccellente accesso utilizzando microscopia ottica ed elettronica (Figure 3A e 3B) con uno o due neuroni che appare per reticolato quadrato (Figura 3B) . Permettere sufficiente separazione tra i neuroni è necessaria per una chiara visualizzazione dei neuriti via Cryo-EM (Figure 3C e 3D). I neuroni e le loro neuriti sono supportati su una pellicola di carbonio bucata della griglia oro, come si vede chiaramente nelle immagini crio-EM (Figure 3C e 3D). I corpi dei neuroni, che può variare da ~ 15-50 micron per i neuroni dell'ippocampo e gangli delle radici dorsali (DRG) 30,33 neuroni sono troppo spessi per l'imaging con Cryo-EM e appaiono completamente nero, come è tipico per very oggetti elettrone-denso e campioni spessi, rispetto alle proiezioni relativamente sottili di neuriti (non superiore a 1 micron di diametro) irradiano da loro (figure 3C e 5).
3-D tessuto cerebrale resina-embedded non rivela neuriti che sono completamente circolare in sezione trasversale 14, infatti, la loro morfologia è variabile. Non è quindi noto se la forma non circolare di neuriti è naturale o un campione preparato manufatto. Lo spessore misurato della assone DRG (Figura 4) coltivate in griglia TEM, cancellato e ripreso come mostrato in questo studio era 0.32 micron nella direzione z (nella profondità del ghiaccio vitreo) e una larghezza media di 0,53 micron di il piano xy. Lo spessore misurato del neurite dell'ippocampo (Figura 8) coltivate in griglia TEM, cancellato e ripreso come mostrato in questo studio era 0,50 micron nella direzione z (nella profondità del ghiaccio vitreo) e unmedia di 0,72 micron nel piano xy. Il processo blotting come qui descritto potrebbe appiattire le neuriti pur rimanendo idratato nel loro buffer originale durante l'intero processo di blotting e processo tuffo congelamento.
Il leggero appiattimento dei neuriti sulla griglia, come osservato da cryoET non sembra influenzare la struttura dei suoi componenti interni, come vescicole, come indicato nel presente documento, che sono quasi perfettamente circolare e non mostrano segni di disidratazione. Per contro, i processi chimici comunemente utilizzati nelle preparazioni "tradizionali" EM, in particolare la fissazione chimica con glutaraldeide e paraformaldeide seguita da disidratazione in etanolo, provocano il restringimento del tessuto incontrollata. Il potenziale di incontrare un tale effetto dannoso cellulare viene eliminato nel metodo che presentiamo per la cryoET nel nostro manoscritto.
Inoltre, i nostri campioni neuriti sono stati immediatamente immergersi-congelati in etano liquido, causando instant 'embedding' in ghiaccio vitreo. Tessuti congelati in uno stato vetroso appaiono molto più simile allo stato fisiologico rispetto ad altre tecniche. Il livello di dettaglio ultrastrutturale non è l'unico aspetto che rende la tecnica descritta nel nostro protocollo di essere utile ai ricercatori Neuroscience. La tecnica di coltivazione neuroni sulle reti EM, subito tamponando /-tuffo congelamento loro di preservare in uno stato vetroso per lo screening / imaging cryoET è una tecnica interessante perché apre la possibilità di esaminare ultrastruttura dei neuroni in diverse condizioni genetiche, chimiche o ambientali sottolinea, senza la preoccupazione di possibili artefatti disidratazione.
Le condizioni assorbente prima di congelamento, come descritto in questo protocollo, sono importanti per generare ghiaccio abbastanza sottile per la visualizzazione da crio-ET delle caratteristiche ultrastrutturali, compresi i componenti interni come mitocondri, vescicole e microtubuli (Figure 4, 6, 7A). Mitocondri, per esempio, potrebbe essere identificato nella nostra preparazione in quanto appaiono strutturalmente simile a quanto già visto in cellule (i bordi di fibroblasti embrionali di topo) mediante tomografia crioelettronica 20. Esse mostrano creste, che può essere visto nelle immagini a colori con annotazioni 3-D presenti in questo manoscritto. Le immagini non ottimali possono derivare da ghiaccio di spessore in cui l'immagine Cryo-EM appare generalmente opaco, impedendo l'identificazione di successo di tali caratteristiche come mitocondri e microtubuli all'interno della neurite. La mancanza di dettagli sufficienti per la preparazione di tali esemplari, soprattutto per quanto riguarda il modo di produrre ghiaccio in modo ottimale sottile, quasi certamente contribuito al successo limitato nel definire l'ultrastruttura dei neuriti 8,10,17,23.
Immagini subottimali possono anche derivare da placcatura troppi neuroni sulla griglia (> 50.000 cellule / ml per piastra), che si traduce in sovraffollamento di neuriti (figure0, 7B e 7C). Immagini sfocate possono essere il risultato di sfocatura errato e devono essere adeguati, la sfocatura nelle immagini qui riportate è stata scattata con un underfocus mirata di 7 micron. Le immagini sono state raccolte in quel defocus garantire maggiore contrasto e la visibilità delle caratteristiche ultrastrutturali, tuttavia, una sfocatura inferiore (cioè 2-3 micron) potrebbe essere utilizzato anche per ottenere particolari risoluzione maggiore di tali caratteristiche.
Altri fattori possono contribuire a immagini subottimali. Ad esempio, anche se può essere tentati di utilizzare altre caratteristiche della macchina vetrificazione, particolarmente il tratto blotting semi-automatico, piuttosto che blotting manuale qui descritto, questo ha dato risultati indesiderabili. Biadesivo blotting è stato inizialmente tentato di utilizzare questa funzione semi-automatico, in cui la macchina vetrificazione (invece dell'utente) blot campione direttamente utilizzando parametri come tempo e numero di macchie blotting come specificato dall'utente. Tuttavia, afdi imaging ter questi campioni, si è riscontrato che tutti i neuroni erano lisati aperta, spargendo il loro contenuto (enti multivescicolari, ecc.) Quindi, la macchina vetrificazione è meglio utilizzato in questo caso per la sua camera umida a temperatura controllabile in cui il campione viene cancellato prima di immergersi congelamento. Mantenere il campione in un tale stato (con umidità situato vicino al 100%) riduce al minimo la perdita di acqua durante la preparazione e contribuisce a garantire ottimale ghiaccio vitreo-post congelamento 3,7.
Idealmente, per minimizzare l'esposizione dei neuroni di perturbazioni esterne, dovrebbero essere coltivate in un incubatore CO 2 (temperatura impostata a 37 ° C) in prossimità della camera con la macchina vetrificazione, e la temperatura di questo apparecchio deve essere impostato a 37 ° C prima di Flash-congelamento dei neuroni sulle griglie EM. Si dovrebbe evitare di esporre i neuroni ad ampie variazioni di temperatura prima di assorbente. In questa relazione, la temperatura è stata impostata a 32 ° Cper scopi assorbente; neuroni sono state coltivate in un edificio diverso e un lasso di tempo di circa 10 minuti si è verificato tra trasportano le lastre di neuroni da una stanza all'altra. Cura è stata presa per proteggere i campioni in un contenitore semi-isolato resistente all'acqua durante il processo di trasporto. Un simile cambiamento di temperatura e concentrazione di CO 2 (come sperimentato dai neuroni prima blotting / tuffo-congelamento) si verificano ai neuroni ogni ~ 2 giorni in cui i neuroni sono prese dalla camera di incubazione per i loro mezzi per essere cambiato sotto la biosicurezza cappa, come è in genere fatto per colture neuronali. Questo non è visto di provocare effetti tossici per la cellula.
Per quanto riguarda la presenza di quello che sembra essere elettrone-densi granuli all'interno dei mitocondri dei neuriti ', esistono diverse notizie contrastanti. Tali granuli si trovano in una varietà di differenti tessuti, non specificamente cellule neuronali. Essi sono percepiti come un lavandino di cationi che regolano l'ionica interna enbiente del mitocondrio. Essi appaiono anche per creare siti di contatto tra membrane mitocondriali interne ed esterne in cui gli enzimi possono funzionare in modo efficiente 16.
Studi sperimentali indicano che il calcio e altri cationi bivalenti accumulano nei mitocondri quando sono presenti nel bagno liquido di mitocondri isolati o cellule intatte questi ioni. Sembra probabile che gli ioni sono legati organicamente ai granuli intra-mitocondriali preesistenti. Si suggerisce pertanto che questi granuli sono legati alla regolazione dell'ambiente interno ionico del mitocondrio 31.
Inoltre, i neuroni nella preparazione sono state coltivate su griglie EM per 14 giorni, i tempi di che è tipico per scopi di crescita dei neuriti 15,36, prima di imaging da cryoEM / ET. E 'stato riportato che c'è un drammatico aumento della concentrazione di calcio intracellulare in neuroni invecchiati rispetto a Youn g neuroni 32. Pertanto, è plausibile che i mitocondri nelle neuriti di questi neuroni di età mostrerebbero granuli mitocondriali non necessariamente come un segno di stress, ma piuttosto perché possiedono una maggiore presenza di calcio intracellulare.
Granuli mitocondriali elettrone-denso sono stati riportati anche in fibroblasti embrionali di topo coltivate in cultura e ripreso dalla stessa tecnologia (crio-elettroni tomografia) utilizzata nel nostro manoscritto 20. Queste cellule non hanno mostrato schemi tipici dei cambiamenti ultrastrutturali associati a danno cellulare, come perturbazione del citoscheletro e vacuolizzazione del citoplasma. Allo stesso modo, all'interno delle nostre neurites come visualizzato dal cryoET, non abbiamo osservato un citoscheletro perturbato che altrimenti sarebbe associato a tossicità cellulare. Date le considerazioni di cui sopra, si può concludere che i neuroni nella nostra preparazione non mostravano granuli mitocondriali a causa di stress o tossicità.
contenuto "> Per sterilizzare la superficie della griglia EM per prevenire la contaminazione ai neuroni, e anche per produrre una superficie idrofila favorevole sulla griglia EM a cui la poli-L-lisina potrebbe aderire, fiammatura le griglie EM prima placcatura neuroni stata trovata vantaggioso. sterilizzazione UV non è stata scelta in quanto richiede irradiazione della griglia per un tempo più lungo (per esempio 20-30 min) nella cappa di biosicurezza. Poi, le griglie dovranno essere nuovamente sottoposti nuovamente ambientale quando essendo bagliore -scarica per fini idrofilizzazione superficie della griglia. Glow-scarico griglia assicura che il successivo rivestimento di poli-lisina sarebbe efficace 'bastone' alla rete. La tecnica di fiamma reti sia vantaggioso in quanto combina il passo idrofilizzazione e passo sterilizzazione in uno. neuroni primari sono noti per essere più sensibile di linee cellulari a base di tumore ed è fondamentale per mantenere il loro ambiente (griglia, piastra di Petri), sterile come possibile.(Figure 3C e 5), che copre più della superficie della griglia per scopi di selezione che neuriti all'immagine . Poi, 2-D immagini Cryo-EM possono essere presi a intervalli digitalmente e cuciti insieme in un montaggio (Figura 6). Questa tecnica può essere utile per caratteristiche ultrastrutturali, quali l'organizzazione dei microtubuli, su un'area maggiore di quella di una singola immagine crio-EM.
Prendendo a basso dosaggio, immagini a basso ingrandimento (figure 3C e 5) è anche utile per identificare le aree del neurite che sono coerenti diametro di tutti i film di carbonio bucata (sia nei fori e di tutti i carbonio) e quindi più ideale per l'imaging e successive analisi. Ingrandimento di neuriti oltre fori della pellicola di carbonio si osserva tipicamente in grande neuriti (Figura 5) con materiale nettamente più interna di neuriti sottili (Figura 3C). Questo fenomeno si pensa che si verificano a causa della mancanza di supporto fisico nei fori della pellicola di carbonio. Quando la griglia EM viene rimosso dal piatto in cui i neuroni crescevano, e successivamente cancellato dal retro, neuriti con massa più interno (Figura 5) che altri (Figura 3C) tendono ad espandersi e / o abbassamento nei fori. Anche se questo sembra essere un artefatto, ha un vantaggio per mostrare più chiaramente i componenti interni del neurite. Utilizzando una pellicola di carbonio continua sovrapposto su questa pellicola di carbonio bucata può aiutare ad aggirare questo problema in studi futuri. Questa configurazione è stato inizialmente tentato ma ha determinato in ghiaccio vitreo troppo spesso per l'imaging. Successive prove con diversi spessori di carbonio continua sovrapposti sulla griglia EM possono avere bisogno di ulteriori indagini.
Un importantetante vantaggio del metodo corrente è che l'organizzazione spaziale dei componenti cellulari all'interno della neurite può essere visualizzato in scala nanometrica effettuando varie immagini 2-D di una singola neurite a diversi angoli di inclinazione, e ricostruire questa pila di immagini in una tomografia. Caratteristiche strutturali individuali possono essere annotati manualmente per ogni fetta 2-D della pila 3-D in diversi colori utilizzando il software appropriato (vedi Tabella dei Materiali e reagenti) come indicato per un assone di un ratto E18 dorsale principale ganglio (DRG) neurone (Figura 4) e una neurite di un ratto E18 neuroni dell'ippocampo (Figura 8).
Scegliendo di riprendere un'immagine ogni 5 gradi durante la serie tilt, piuttosto che 1 o 2 °, meno immagini vengono raccolti, ma una dose maggiore di elettroni possono essere usate per immagine. Ciò si traduce in un maggiore contrasto e meno rumore nelle immagini crude. Questo è meglio ai fini della ricostruzione (allineamento di correlazione incrociata come uno st ep) e successiva annotazione tomogram, che è fatto a mano per ogni immagine comprendente la pila tomogramma nella direzione z. Sceglie la dimensione dell'incremento dipende anche dalle dimensioni del campione; tra diversi angoli di inclinazione, esemplari più grandi non variano tanto. In questo caso, utilizzando una dimensione più grande incremento (5 °) è stato pensato per essere più adatto a causa delle dimensioni relativamente grandi esemplare di neurite.
Inoltre, l'aggiunta di markers fiduciali oro alla griglia EM avrebbe aiutato per l'allineamento bella immagine, se lo desideri. Marker fiduciali non sono stati utilizzati perché il campione era relativamente grande rispetto ad altri campioni crio-EM (virus o proteine in isolamento) e ha mostrato alto contrasto con una varietà di caratteristiche strutturali che potrebbero essere utilizzati per il corretto allineamento di ciascuna delle immagini 2-D (comprendente la pila 3-D) dalla cross-correlazione. Lo stack immagine risultante era ben allineata con questo approccio, e utilizzabile per la successiva nota di colore 3-D.
ent "> Per gli studi futuri, utilizzando un microscopio con un filtro di energia potrebbe ridurre il rumore causato dagli elettroni anelasticamente sparse, ma una tale funzione potrebbe non essere immediatamente disponibile presso la maggior parte impianti di microscopia elettronica. nostra procedura rivela ciò che le immagini possono derivare da un microscopio standard da 200 kV senza filtro di energia, che può essere più comunemente a disposizione della comunità neuroscienze in generale.Il protocollo qui descritto è ottimizzata per la preparazione e la visualizzazione di entrambe le ratto assoni DRG embrionali e neuriti dell'ippocampo utilizzando apparecchiature disponibili in commercio per la crio-EM e crio-ET. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che produce informazioni strutturali da neuriti interi, non sezionato, lavorato o trattato con vari reagenti chimici per visualizzare il loro ultrastruttura. Abbiamo dimostrato come crio-ET è un metodo particolarmente eccellente per l'uso in future analisi ultrastrutturali dei neuroni in uno stato vicino-a-nativo per esaminare l'impattodi malattia neurologica sulla struttura neurite.
I numeri di accesso Electron Microscopy banca dati per le tomografie 3-D come riportati in questo documento sono i seguenti: Per il ratto dell'ippocampo neurite come mostrato in figura 8 e nel video principale (da 8:45-09:01), il EMDB numero di accesso è EMD-5887. Per il ratto ganglio della radice dorsale neurite come mostrato nella figura 4 e nella video principale (da 9:02-09:15), il numero di accesso EMDB è EMD-5885.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH (PN2EY016525 e P41GM103832). SHS è stato sostenuto da una borsa di studio dal Nanobiologia Interdisciplinare Graduate Program Formazione del WM Keck Center for Interdisciplinary Bioscience formazione della Costa del Golfo Consorzi (NIH di Grant No. T32EB009379).
SHS sezionato, crebbe e vetrificati DRG e cellule dell'ippocampo, raccolte crio-ET dati di DRG e assoni ippocampo Cryo-EM e, ricostruito e colore-annotato la serie tilt. MRG sezionato e fornito cellule dell'ippocampo nel laboratorio di MNR. SC assistito in serie tilt annotazione. SHS è stato addestrato da CW su come sezionare e crescere neuroni. SHS, WCM e WC concepito gli esperimenti. SHS preparato il manoscritto con il contributo di altri autori.
Questo video è stato girato presso il Centro di Imaging Cellulare e NanoAnalytics (C-CINA), del Biozentrum di tegli Università di Basilea. C-CINA è integrato nel Dipartimento per Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) del Politecnico federale di Zurigo, che si trova a Basilea, in Svizzera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al.
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al.
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al.
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G.
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al.
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
