Summary
För att bevara neuronala processer för ultra analys, beskriver vi ett protokoll för plätering av primära neuroner elektronmikroskopi nät följt av flash frysning, vilket ger prov suspenderade i ett lager av glaskroppen is. Dessa prover kan undersökas med en Cryo-elektronmikroskop för att visualisera strukturer på nanometerskala.
Abstract
Neurites, både dendriter och axoner, är neuronala cellulära processer som möjliggör ledning av elektriska impulser mellan nervceller. Definiera strukturen på neuriter är avgörande för att förstå hur dessa processer flytta material och signaler som stöder synaptisk kommunikation. Elektronmikroskop (EM) har traditionellt använts för att bedöma de ultrastrukturella funktioner inom neuriter, men kan exponering för organiska lösningsmedel under uttorkning och harts inbäddning snedvrida strukturer. En viktig otillfredsställda mål är utformningen av förfaranden som möjliggör strukturella utvärderingar som inte påverkas av dessa artefakter. Här har vi etablerat en detaljerad och reproducerbar protokoll för att odla och flash-frysa hela neuriter av olika primära nervceller elektronmikroskopi nät följt av deras granskning med kryo-elektron tomografi (kryo-ET). Denna teknik gör det möjligt att 3-D visualisering av frysta, hydratiserade neuriter på nanometer upplösning, underlättar Assessment av deras morfologiska skillnader. Vår protokoll ger en helt ny bild av dorsala ganglion (DRG) neurites, och en visualisering av hippocampus neuriter i sin nästan infödda tillstånd. Som sådana dessa metoder skapar en grund för framtida studier på neuriter på både normala nervceller och de som påverkas av neurologiska sjukdomar.
Introduction
Nervceller fastställa komplexa kretsar avgörande för funktionen av de centrala och perifera nervsystemen genom att utarbeta dendriter för att få information och axoner, ofta ganska långa, för att kommunicera med nervceller nedströms. Neuritutväxt spelar en grundläggande roll under fosterutvecklingen och neuronal differentiering och underhåll av neuriter stöder kritiskt funktionen av nervsystemet. Neuritic processer har också kritiskt i neuronal skada och förnyelse, samt nervsystemet. Studien av neuronal arkitektur är avgörande för att förstå både normal och sjuk hjärna. Lyckligtvis fysiologiskt relevanta neuronala cellodlingssystem finns som kan rekapitulera komplexa och heterogena cellstrukturer. Behövs Utifrån klarlägga solida experimentella plattformar, effektiva visualiseringsstrategier som möjliggör kvalitativa och kvantitativa analyser av neuronal morfologi. Speciellt användbar skullevara en detaljerad metod som ger en enhetlig plattform för visualisering neuriter, både axoner och dendriter på nanometerskala.
Traditionell elektronmikroskopi kräver användning av organiska lösningsmedel under uttorkning och harts inbäddning, vilket kan framkalla snedvridningar i proverna från sitt sanna tillstånd. Hittills är de flesta strukturella karakteriseringar på nanometerskala baserad på större celler eller vävnader som utsätts för sådana starka kemikalier - vilket begränsar tolkningen av resultaten 4,9,25. Dessutom för elektronstrålepenetration är sektione krävs för organismer eller cellulära utsprång som uppvisar en tjocklek som är större än 1 | im 12. Slutligen sektionerad eller slipat vävnad resulterar i samling av diskreta segmentspecifika datamängder, vilket gör besvärlig definitionen av den långsträckta egenskap hos neuriter. Även för Cryo-EM, där snitt en frusen hydrerad exemplar är möjligt, introducerar metoden komprimerings artiffungerar 1.
Under senare år har forskarna lärt sig hur man odlar hippocampus nervceller direkt på EM-nät och flash-frysa dem i flytande etan att sedan visualisera neuriter använder kryo-ET 8,10,18,23. Men sådana studier antingen använda en specialanpassad produkt 10,23, eller saknar information om läsk steg för att generera tillräckligt tunn glaskroppen is för rutin visualisering 8,18. Rekommenderas till exempel en studie av användningen av 30 till 40 sek för läsk EM-galler 10, dock är det här värdet inte optimerade för allmänt bruk men är specifikt för att skräddarsydd plunge frysning enhet. Med hjälp av en specialanpassad produkt snarare än ett kommersiellt tillgängligt en 17 för att bibehålla fuktigheten innan störta-frysa provet skulle kunna utgöra ett hinder för utbredd reproducerbarhet.
Även om dessa studier har varit banbrytande i att visualisera neuriter med Cryo-ET, har vi tagit ett steg längre för att utforska applicability av kryo-ET till en mängd olika neuronala prover (hippocampus och dorsal root ganglion neurons). Dessutom diskuterar vi både optimala och suboptimala resultat, samt de potentiella artefakter som man kan stöta på med hjälp av Cryo-ET för sådana exemplar.
Definiera en detaljerad teknik för att bevara och visualisera hela neuriter på nanometerskala i en nära-naturliga tillstånd skulle öka möjligheten för fler forskare att utföra ultrastrukturella studier. För detta ändamål beskriver vi ett effektivt och detaljerat protokoll med användning av kommersiellt tillgänglig utrustning för framställning av icke-fixerade, ofärgade neuroner att visualisera neuriter. Detta är ett viktigt första steg mot att uppgifter om ultra friska neuriter och att lägga grunden för att förstå vilka strukturella skillnader finns i nervösa modeller systemet sjukdom. Eftersom kryo-ET kan lösa ofixerade, ofärgade neurite funktioner i 3-D på nanometerskala, kommer metoden att göra det möjligt att aldrig varadärför att definiera neuritic arkitektur 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Rätter med EM Galler för plätering Primära Nervceller
- Undersök integritet Holey kol på guld EM-nät med hjälp av ett ljusmikroskop vid förstoring på minst 25X. Se till att kol hål är> 98% intakt.
- För plätering av primära neuroner, använd en bunsenbrännare för att flamma-sterilisera EM-nät och samtidigt göra dem hydrofila. Använd pincett för att plocka upp EM rutnät i kanten, inte den centrala inrutade ytan. VARNING: Lämna aldrig en tänd bunsenbrännare utan uppsikt, och inte använda handskar eller pincett med plastdelar när de utför dessa steg:
- Innan du tänder bunsenbrännare, ställ in luft och gas justeringar av ett minimalt öppet läge.
- Tänd bunsenbrännare med hjälp av en anfallare flinta eller butan ljusare.
- Ändra luft och gas justeringar för att åstadkomma en liten, blå inre lågan inom en längre, ljusare blå / violett flamma. Spetsen hos den inre lågan är den varmaste delen av lågan. Vredet ineath brännaren justerar mängden av gas som kommer in i brännarröret, medan pipan av brännaren kan vridas för att justera mängden av luft som kommer in i brännaren. Slå luftjustering medsols minskar luften (vilket resulterar i en lila flamma) och moturs ökar luft (vilket resulterar i en gul låga).
- Med hjälp av metall pincett (inga plastdelar) för att hålla EM rutnätet, passerar snabbt genom lågan två gånger, mot kol-sidan uppåt. Kolet sidan kommer att visas mer matte (mindre glänsande) och med mer av en gråaktig nyans än den andra sidan.
- Överför omedelbart rutnätet (kol-sidan uppåt) i mitten av glas nedre skålen placeras inom 10 cm från bunsenbrännare. Använd en EM rutnät per fat (Figur 1). Använd endast glasbottnade rätter som försteriliserade, det vill säga via gammastrålning.
- Använd ett ljusmikroskop för att kontrollera nätet integritet (kol hål intakt) och ändå behålla EM galler inuti glaset-BottOM skålen (för att undvika kontaminering). Vid tillämpning av någon substans på gallret eller vad som helst som kommer att komma i kontakt med nervceller, använd steril procedur och sterila pipettspetsar.
- I en vävnadskultur huva med hjälp av steril procedur gäller 250 l av lämplig beläggning substansen långsamt och försiktigt till den centrala glasområdet i petriskål. Se till att lämplig beläggning ämnet täcker hela EM rutnätet.
- För hippocampusneuroner använder poly-L-lysin (PLL, 1 mg / ml) som beläggningssubstansen, som framställts såsom tidigare beskrivits 19. Observera att 250 l behövs per EM rutnät, per fat, så skala partiet i enlighet därmed. För dorsala ganglion (DRG) nervceller, använd en geléproteinblandning som utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus-sarkomceller (se tabell i Material och reagens) som beläggnings ämne, förbereda följande. Observera att 250 l behövs per EM rutnät, per fat, så skala partiet i enlighet därmed.
- Tina en aktieflaskaav geléproteinblandning som utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus-sarkomceller över natten vid 4 ° C.
- Förvara kallt det geléproteinblandning som utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus-sarkomceller, och alla komponenter som används för att göra lösningen, dvs genom att hålla dem på is.
- Medan på is, späds den gelartade proteinblandning i Neurobasal-medium för att ge en 1:20 spädning (dvs späd 500 | il av den gelartade proteinblandningen i 10 ml Neurobasal).
- Divide utspädd gelatinös proteinblandningen i 1 ml alikvoter, och omedelbart lagra några extra alikvoter vid -20 ° C.
- Applicera 250 l per EM rutnät, per fat, vilket beskrivs i avsnitt 1.4.
- För hippocampusneuroner använder poly-L-lysin (PLL, 1 mg / ml) som beläggningssubstansen, som framställts såsom tidigare beskrivits 19. Observera att 250 l behövs per EM rutnät, per fat, så skala partiet i enlighet därmed. För dorsala ganglion (DRG) nervceller, använd en geléproteinblandning som utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus-sarkomceller (se tabell i Material och reagens) som beläggnings ämne, förbereda följande. Observera att 250 l behövs per EM rutnät, per fat, så skala partiet i enlighet därmed.
- Täck petriskål med sin topp och inkubera (antingen med PLL för hippocampus prover, eller med geléproteinblandning för DRG exemplar) under 1 timme i rumstemperatur i vävnadsodling huva.
- Aspibetygsätta alla PLL (för hippocampus exemplar) eller geléproteinblandning (för DRG exemplar) från disken. För att göra detta använder vakuumsystemet i vävnadsodling huva. Använd en steril pipettspets fäst på vakuumröret. Undvik direkt kontakt med EM rutnät.
- Använd en justerbar luft förskjutning pipett noggrant tillämpa 250 l sterilt PBS (fosfatbuffrad saltlösning) till EM elnätet i centrala glasyta i varje petriskål, så att EM-gallret är helt täckt av PBS. Sedan aspirera PBS från varje maträtt. Upprepa 3x.
- Låt rätter med EM-galler för att torka under vävnadsodling huva i 15 min. Se till att de är helt torra genom kontroll under ljusmikroskop i vävnadsodlingsrummet. Se till att det inte finns några bubblor av fukt i nätet. Om så är fallet, försiktigt aspirera intill EM-nätet för att eliminera denna extra fukt. Den belagda gallret ska användas omedelbart för plätering nervceller.
2. Förbereda och Plating Primär Neuroner på EM Galler
- Till plattan primära neuroner, först dissekera, trypsinize (med användning av 2,5% trypsin) och triturera att dissociera hippocampi (eller dorsala rotganglier av 18 dagar gamla råttembryon) in i enskilda celler, som tidigare beskrivits 19.
- Finfördela är en vanlig term som används av neurobiologists att beskriva dissocierande klumpar av celler till enskilda celler, i synnerhet genom användning av ett glas pipett med en brand-polerad spets. Resultatet uppnås genom att försiktigt och långsamt dra och släppa cellerna upp och ner flera gånger (~ 30) via pipett.
- Följ förfaranden som tidigare beskrivits för DRG dissekering och cellisolering 24, som noterar att använda 0,25% trypsin (i HBSS) för att isolera råtta DRG nervceller, istället för att använda de enzymer som föreslås (papain, kollagenas / dispas) som är mer lämpade för mus DRG-neuroner.
- Beräkna antalet av isolerade neuroner (dvs. med användning av en hemocytometer)och använda detta värde för att beräkna lämplig volym av celler att gälla för varje rätt för att uppnå en koncentration på 50.000 celler / ml per skål. Den maximala volymen att ansöka är 250 pl. Observera att detta endast fyller den centrala glasområdet, inte hela skålen.
- Inkubera skålarna i 30 min i en CO2-inkubator vid 37 ° C. Låt cellerna att återhämta sig och följa.
- Tillsätt långsamt 1,5 ml värms media till varje maträtt, noga med att inte störa EM rutnätet. Typen av medium beror på celltypen (hippocampus eller DRG).
- Förbered lämpliga medier för antingen hippocampusneuroner 19 eller dorsala rot ganglieneuroner 24, som skall värmas i en 37 ° C vattenbad före användning. Inkubera skålarna över natten i CO2 inkubator.
- För hippocampus nervceller, ändrar media nästa dag. Ändra halv mediernas varannan dag och framåt i 14 dagar. Värm media i en 37 ° C vattenbad före användning. För DRG nervceller, dagen efter dissektion / plätering, förbereda en ny lager av media med en anti-mitotiska medel (Uridin och 5'-fluor-2'-deoxiuridin) gör en 10 mM stamlösning av varje, separat, använd en slutlig koncentration av 10 | iM för varje. Ta bort hälften av DRG-media (875 ^ il) och tillsätt 875 | il färskt medium med anti-mitotiskt medel.
- För DRG nervceller, varannan dag för den första veckan, suppleant föränderliga medie mellan anti-mitotiska medier och standard DRG media. För den andra veckan, ändra standard DRG media varannan dag.
3. Förglasa Neuroner på EM Galler
- Förbered utrustning och allt material för frysning och lagring av guld EM galler vid kryogen temperatur: en förglasning enhet med en fuktkammare 17, fin-punkt specialiserade pincett för förglasning maskinen, långa platta punkt pincett, Dewar (s) i flytande kväve (LN 2), coolant behållare, EM rutnät förvaringsbox, kalciumfritt filterpapper.
- Starta förglasning enheten. Ställ in fuktighet till 100%, och temperaturen till 32 ° C. I avsnittet "Console", ställ in blot tid till noll sekunder. Detta möjliggör manuell läsk genom sidofönstret på förglasning maskinens fuktkammare.
- Hantera kalciumfritt filterpapper med handskar, skiktning dem så att tre tidningar är staplade. Skär bunten i 0,5 cm breda remsor som är ~ 2 cm långa. Böja dem vid en 90 ° vinkel så att en sida av papperet har en 0,5 cm x 0,5 cm yta (figur 2). Med hjälp av en pincett, ta bort mitt papper och placera den på en annan kalciumfritt filterpapper fram till användning.
- Sätt knappen lagringsnätet i knapphållaren i förglasning kammaren. Fyll den inre kammaren av kylvätska behållaren med flytande kväve och vänta tills fullständig avdunstning. Fyll den yttre kammaren av the kylvätska behållare med flytande kväve tills den uppnår stabil temperatur för att gå vidare till nästa steg. Fyll den inre kammaren med hög renhet gasformiga etan som kondenserar till flytande form i den kylda kammaren.
- Flytta skålen (er) från inkubatorn till en stor 100 mm polystyren skålen för transport till förglasning rummet, om än inte i den omedelbara närheten. Använd de specialiserade vitrifikationsprodukter pincett för att försiktigt plocka EM rutnät från skålen. Notera vilken sida nervceller växer på EM-nätet, den positionen kommer att fråga för nästa steg. Använd den svarta glidlåset på pincett för att säkert låsa pincett på EM rutnätet.
- Sätt pincetten i förglasning maskin såsom den sidan av EM-galler på vilket neuroner vidhäftar ytorna till vänster, bort från det sidoöppningshålet hos förglasning maskinen. Dra in de specialiserade pincett i förglasning maskinen.
- Placera kylvätska behållaren i lämplig hållareav förglasning maskinen. Det bör fyllas med tillräcklig LN 2 och flytande etan. Med användning av lämplig sikt kommando av förglasning maskinen höja kylmedelskammaren uppåt tills den spolas med botten av fuktkammare.
- Med den platta punkt pincett, ta tag ena kanten av filterpapper så att den kortare sidan (de 0,5 cm x 0,5 cm ansikte) är vinkelrät mot pincett. Detta ansikte kommer i direkt kontakt med EM-nätet för blotting (Figur 2B). Försiktigt in filterpapper i sidohålet i förglasning maskinens fuktkammare (figur 2A). Stabilt hålla papperet mot EM rutnätet (den sida som vetter bort från provet) under 10 sek. Kasta papperet efteråt och genast störta-frysa provet i flytande etan med hjälp av förglasning maskinens automation.
- Försiktigt överföra din frusna-hydrerad EM rutnät till ett av facken i en av derutnät förvarings knappar. Upprepa processen för ytterligare EM galler i disken. EM rutnät förvarings knappar som används i dessa experiment kan lagra flera frysta-hydrerad EM galler.
4. Bild Insamling, bearbetning och Annotation
- Fortsätt att samla 2-D-elektronmikrofotografier, och / eller 3-D tilt serie 5 av neuriter med användning av en kryo-elektronmikroskop enligt en lågdos-tillstånd. De 2-D bilder var avsedda för att bedöma kvaliteten på nätet i form av istjocklek och möjliga områden för att vara användbart för 3D-tilt-serien.
- I detta fall var alla bilder uppsamlades med användning av en 4k x 4k CCD-kamera kopplad till en 200 kV elektronmikroskop utrustat med en enda lutning flytande kväve kryo överföringshållaren, vid 20k mikroskop förstoring på ett mål underfocus av 7 fim och provtagning av 4,4 Å / pixel.
- För att få en 3D-tomogram av provet, ta en serie projektionsbilder medan stegvis luta prov along en axel av transmissionselektronmikroskop (TEM). Med tanke på lutningsvinklar och andra experimentella inställningar, det finns flera olika programvaror som finns för att automatiskt samla in tilt serien 5. Den 3D-lutning serien visas här samlades på samma mikroskop med hjälp av halvautomatisk tilt serie förvärv programvara 26 över ett intervall av -60 ° till 60 ° vid 5 ° steg med en kumulativ dos på ~ 60 e / Å 2.
- Rekonstruera lutningsserie neurites hjälp av bildbehandlingsprogram 21 som tidigare beskrivits för andra prover 5,29.
- Färg-kommentera de 3-D-funktioner i neuriter genom att först segmentera tomogram och skapa en yta modell med hjälp av en 3-D bildbehandlingsprogram som tidigare beskrivits 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Före frysning och bildbehandling via kryo-ET, bör ljusmikroskopbilder tas till EM rutnät där nervceller växer. Neuriter bör tydligt vara synlig utan betydande överlappning med varandra. En färgad ruta i figur 3A är ett område som zoomas in för att visa en högre förstoring i figur 3B, där neurites sträcker sig över fackverk av nätet. Varje grid-kvadrat består av en Holey kol film som stödjer nervceller och deras neuriter. Dessa hål är synliga i en låg dos Cryo-EM bild tagen vid 4k förstoring, som visar neuron kroppen som en relativt stor, mörk, elektron-täta föremål (figur 3C), från vilken neurites projekt utåt.
En del av neurite vilande ovanför ett hål i kolet är valt i en färgad ruta i figur 3C, och zoomat in på en större förstoring (20k) i figur 3D. Vid denna förstoring, bör tydliga interna cellulära strukturer inklusive mikrotubuli, blåsor och mitokondrier vara tydligt (Figur 3D), särskilt i optimalt tunn is som genereras genom att följa detta protokoll. De mörka svarta strukturer i mitten av bilden (Figur 3D) är sexkantiga ispartiklar som anses som föroreningar och bör normalt undvikas, men med tanke på att de är mycket glesa och utanför neuriter själva, att de inte stör återuppbyggnad och färg-anteckning av de interna strukturer för analys och tolkning (Figur 4). En annan låg dos, låg förstoring bilden visas i fig. 5, från vilken en neurite kan placeras, varefter flera 2-D-bilder kan tas och digitalt sys samman med bildbehandlingsprogram för att generera en montage (Figur 6).
Den initialalåg plätering koncentration (50.000 celler / ml per platta) av nervceller på EM-nät möjliggör nervceller som är placerade tillräckligt långt ifrån varandra för att säkerställa tydlig visualisering av sina neuriter (figur 3C), högre koncentrationer än rekommenderat (> 50.000 celler / ml per platta ) kan resultera i suboptimala bilder av trånga neuriter som är svåra att spåra eller attribut cellulära komponenter (figur 7b och 7c).
Figur 1. System för växande nervceller på EM-nät inom glasbottnade rätter. (A) glasbottnade rätter visas, delvis fyllda med cellmedia (rosa). (B) Varje rätt innehåller en guld EM galler, som en närmare titt avslöjar. (C) Beläggning av EM rutnät med poly-lysin visas som en tecknad sido cutaway. Glaset nedre skålen består av en fyrkantig täckglas, som är fäst till botten av en plastodlingsskål, som omfattar en cirkulär öppning som ursprungligen skars ut från botten. Dessa glas botten rätter är gamma steriliseras och kommersiellt köpas som färdiga. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Schematisk för manuell blotting av EM galler med neuroner vidhäftade. (A) Närbild av förglasning maskinens glid inresa kortplats (svart pil) till fukt / läskkammare, där pincett kommer att införas för att torka provet manuellt. (B)Tecknad schema som visar hur kalcium fritt filterpapper (0.5 cm x 0.5 cm ansikte) ska hanteras med hjälp av platt-punkts pincett och in genom ingångsplatsen i fuktkammare för förglasning maskinen för läsk EM rutnät där nervceller följs (droppe av rosa cellmedie visas). EM rutnät innehas av fin-point specialiserade pincett inne i fuktkammare. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Visualisera fryst, hydratiserade nervceller på guld elektronmikroskopi (EM) nät. (A) Ljusmikroskopbild på 10X förstoring av det centrala området av ett EM rutnät som råtta primära nervceller har grovinge för två veckor. (B) Zoomad-med tanke på aqua låda som visas i (A), i vilka neuroner och deras neurite utsprången är synliga (rosa pilarna). (C) elektronmikrofoto vid 4K förstoring av en neurite utskjutande utåt från neuron kroppen (röd pil). Schematiskt motsvarar ett område (dvs. den röda rutan) inom någon av de rutor som visas i (B). Blue box ses närbild i (D), där neurite interna funktionerna syns tydligt på 20k förstoring (grön pil mitokondrier, orange pil mikrotubuli, vesikler blå pil). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. 3-D rekonstruktion och annotering av en råtta DRG axonet tomogram. (A) Tomographic skiva från en rekonstruerad bunt bilder tagna vid olika lutningsvinklar av en DRG axon. (B) Motsvarande 3-D anteckning av samma axon. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. 2-D Cryo-EM bild av en råtta DRG neuron (center-vänster) med axonal prognoser (röd box) vid 4k förstoring. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 6. Montage av fyra 2-D-EM kryo bilder av en enda råtta DRG axon. Varje bild togs vid 20k förstoring. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. Cryo-EM 2-D bilder av neuriter. (A) En råtta DRG axon avbildas närmare i anslutning till cellen soma. (B, C) Exempel på trängsel av neuriter grund av hög plätering koncentration av nervceller på EM galler. Alla neuriter var flash-fryst två veckor efter plätering på guld EM-nät. Alla bilder togs vid 20k;. Förstoring Klicka här för att visa en större bild .
Figur 8. 3-D rekonstruktion och annotering av en råtta hippocampus neurite tomogram. (A) Tomographic skiva från en rekonstruerad bunt bilder tagna vid olika lutningsvinklar av en hippocampus neurit. (B) Motsvarande 3-D anteckning av samma neurite. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visar att rått embryonala nervceller (dorsala ganglion och hippocampus) kan odlas på guld elektronmikroskopi (EM) nät och fryst i glaskroppen is tunt nog för sina neuriter som ska avbildas med Cryo-EM 2-D och 3-D-kryo- ET. Medan hippocampus neuriter har tidigare avbildas med Cryo-ET 8,10,18,23, ett protokoll tillräckligt detaljerade för framgångsrik replikering med hjälp av kommersiellt tillgängliga enheter har saknats. Dessutom, medan deras forskning har börjat använda sig av kryo-ET för att visualisera hippocampus neuriter, våra studier undersöker tillämpligheten av kryo-ET till mer än en typ av neuronala exemplar.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll förbereder EM galler med antingen hippocampus och dorsala ganglion (DRG) nervceller, läsk dem för att uppnå optimalt tunn is, och störta-frysa dem för avbildning av Cryo-ET. Optimal blotting tid är ett som inte resulterar i is för tjock för elektronstrålen för att tränga in i,inte heller för tunn att den glaskroppen is visas med särskilt annorlunda gradient från kanten av Holey kol till det innersta av Holey kol. Vidare kan uppnå optimalt tunn is genom att använda en förglasning maskin 17 vara något olika för varje projekt, och robust frysning med hjälp av förglasning maskinen kräver en inlärningskurva.
Medan tidigare forskning har fokuserat på hippocampus nervceller, även utforskas här i våra studier har vi gått vidare för att visa bilder på nanometerskala med intakta, frysta hydrerad hela axoner av dorsala ganglion (DRG), aldrig avbildas innan kryo- EM eller Cryo-ET. DRG-celler valdes eftersom de (i motsats till hippocampus neuroner) uteslutande ge upphov till axoner 34. Ett protokoll för att avbilda dem cryo-EM/cryo-ET skulle kunna vara användbar för dem som är intresserade att härleda axonal ultra dvs i sensoriska neuroner. Vi också närvarande och diskutera både optimala och suboptimala resultat, samteftersom de potentiella artefakter som man kan stöta på med hjälp av Cryo-ET för sådana exemplar.
Vid korrekt cellkoncentrationen (50.000 celler / ml per skål), är avståndet mellan nervceller så att neuriter möjliggör utmärkt åtkomst med hjälp av ljus-och elektronmikroskopi (Figur 3A och 3B) med en eller två neuroner som förekommer per grid-square (Figur 3B) . Att tillåta tillräckligt separation mellan nervceller är nödvändig för tydlig visualisering av neuriter via Cryo-EM (figur 3C och 3D). De nervceller och deras neuriter stöds på en Holey kol film av guld nätet, vilket kan ses tydligt i Cryo-EM bilder (figur 3C och 3D). De neuron organ, som kan variera från ~ 15-50 ìm för hippocampus nervceller och dorsala ganglion (DRG) nervceller 30,33 är för tjock för avbildning med Cryo-EM och verkar helt svart, vilket är typiskt för vsom leveranselektrontäta objekt och tjocka prover, i jämförelse med de relativt tunnare projektioner av neuriter (ej överstigande 1 | im i diameter) som strålar ut från dem (fig 3C och 5).
Harts-inbäddade 3D-hjärnvävnad avslöjar inte neuriter som är helt rund i tvärsnitt 14, i själva verket är deras morfologi variabel. Det är alltså inte känt om den icke-cirkulära formen av neuriter är naturligt eller ett exemplar förberedelse artefakt. Den uppmätta tjockleken av DRG axon (figur 4) som odlas på TEM-rutnät, blottades och avbildas såsom visas i denna studie var 0,32 ^ m i z-riktningen (i djupet av den glasartade is) och en genomsnittlig bredd på 0,53 ^ m i xy-planet. Den uppmätta tjockleken hos hippocampal neurite (Figur 8) som odlas på TEM-rutnät, blottades och avbildas såsom visas i denna studie var 0,50 ^ m i z-riktningen (i djupet av den glasartade is) och engenomsnitt av 0,72 | im i xy-planet. Den blotting process som beskrivs häri kan platta till neurites även om de förblev hydrerad i sin ursprungliga buffert under hela processen med blotting och dopp-frysprocessen.
Den något flackare neuriter på nätet som observerats av cryoET tycks inte påverka strukturen på sin interna beståndsdelar såsom blåsor som visas här, som är nästan helt rund och visar inga tecken på uttorkning. Däremot de kemiska processer som vanligen används i "traditionella" EM-förberedelser, särskilt kemisk fixering med glutaraldehyd och paraformaldehyd följt av dehydrering i etanol, resulterar i okontrollerad vävnad krympning. Potentialen för att stöta på en sådan skadlig cellulär effekt elimineras i metoden presenterar vi för cryoET i vårt manuskript.
Dessutom våra neuriter prover omedelbart störta-frysta i flytande etan, vilket resulterar i instant "inbäddning" i glaskroppen is. Vävnader som är frysta i ett glasaktigt tillstånd verkar mycket mer lik den fysiologiska tillstånd än andra tekniker. Nivån på ultra detalj är inte den enda aspekt som gör den teknik som beskrivs i våra protokoll för att vara värdefull för neurovetenskap forskare. Tekniken att odla nervceller på EM-nät, omedelbart läsk / dopp-frysa dem att bevara i ett glasaktigt tillstånd för screening / avbildning av cryoET är en attraktiv teknik eftersom det öppnar upp möjligheten att undersöka ultra av nervceller under olika genetisk, kemisk eller miljö betonar utan bekymmer av potentiella uttorkning artefakter.
De blotting förhållanden före frysning, som beskrivs i detta protokoll, är viktiga för att skapa is tunt nog för visualisering av Cryo-ET av de ultrastrukturella funktioner, inklusive interna komponenter såsom mitokondrier, blåsor och mikrotubuli (figur 4, 6, 7A). Mitokondrier, till exempel, kunde identifieras i våra förberedelser eftersom de verkar strukturellt liknar det som ses i celler (kanterna av musen embryonala fibroblaster) via kryo-elektron tomografi 20. De visar också crista, vilket kan ses i 3-D-färg kommenterad bilder som förekommer i detta manuskript. Suboptimala bilder kan bli följden av tjock is där Cryo-EM bild visas generellt ogenomskinlig, hindrar framgång i att identifiera sådana funktioner som mitokondrier och mikrotubuli inom neurite. Brist på tillräckliga uppgifter för att framställa sådana exemplar, bl.a. om hur att producera optimalt tunn is, nästan säkert bidragit till den begränsade framgång i att definiera ultra av neuriter 8,10,17,23.
Suboptimala bilder kan också vara resultatet av utstrykning för många neuroner på gallret (> 50000 celler / ml per skål), som resulterar i överbeläggningen av neuriter (fig.0, 7B och 7C). Suddiga bilder kan vara ett resultat av felaktig defocus och måste justeras, det minskad fokus på bilderna här togs med en riktad underfocus av 7 um. Bilder samlades vid den defocus att säkerställa högre kontrast och synlighet ultra funktioner, men kan en lägre minskad fokus (dvs. 2-3 mikrometer) också användas för att få högre upplösning uppgifter om sådana funktioner.
Andra faktorer som kan bidra till suboptimala bilder. Till exempel, även om det kan vara frestande att använda andra egenskaper hos förglasning maskin, i synnerhet halvautomatiska läsk funktion, snarare än manuell blotting beskrivs häri, gav detta oönskade resultat. Dubbelsidig läsk initialt försökt att använda denna halvautomatiska funktionen, där förglasning maskinen (snarare än användaren) utplånar provet direkt med hjälp av sådana parametrar som blotting och antal plumpar som anges av användaren. Emellertid after imaging sådana prover, visade det sig att alla nervceller hade lyserat öppen, rinner ut deras innehåll (multivesikulära organ, etc.). Därför är förglasning maskinen bäst i det här fallet för dess temperatur-reglerbara fuktkammare där provet blottas före störta frysning. Att upprätthålla provet i ett sådant tillstånd (med fukt in nära 100%) minimerar vatten förluster vid beredning och bidrar till att säkerställa optimal glaskroppen is efter frysning 3,7.
Helst för att minimera exponeringen av nervceller till externa störningar, de bör odlas i en CO 2 inkubator (temperatur inställd på 37 ° C) i nära anslutning till rummet med förglasning maskinen, och temperaturen för denna apparat ska vara inställd på 37 ° C före flash-frysa nervceller på EM galler. Man bör undvika att utsätta nervceller till stora variationer i temperatur före blotting. I denna rapport, var temperaturen inställd på 32 ° Cför läsk ändamål, neuroner odlades i en annan byggnad och en tid förflutit för ~ 10 minuter inträffade mellan bär plattor av nervceller från ett rum till ett annat. Försiktighet iakttogs för att skydda proverna i en vattenfast, halv isolerad behållare under transportprocessen. En liknande förändring i temperatur och CO2-koncentrationen (som upplevs av de neuroner före blottning / plunge-frysning) inträffa till nervceller var ~ 2 dagar när nervceller tas ur inkubationskammaren för att de medier som ska ändras i enlighet med biosäkerhet huv, som görs vanligtvis för neuronala kulturer. Detta ses inte att resultera i toxiska effekter på cellen.
När det gäller förekomsten av vad som verkar vara elektrontäta granuler inom neurites mitokondrier, finns flera motstridiga rapporter. Sådana granulat finns i en mängd olika vävnader, inte specifikt neuronala celler. De uppfattas som en sänka för katjoner som reglerar den interna joniska svmiljön av mitokondrien. De verkar även till att skapa kontaktställen mellan inre och yttre mitokondriemembranen där enzymer kan fungera effektivt 16.
Experimentella studier visar att kalcium och andra divalenta katjoner ackumuleras i mitokondrier när dessa joner är närvarande i fluidet badning antingen isolerade mitokondrier eller intakta celler. Det verkar troligt att jonerna organiskt bundet till de befintliga intra-mitokondriella granulat. Det föreslås därför att dessa granuler är kopplade till regleringen av den interna joniska miljön i mitokondrien 31.
Dessutom nervceller i våra förberedelser odlades på EM galler i 14 dagar, är tidpunkten för vilken typiskt i syfte att neurittillväxt 15,36, före avbildning av cryoEM / ET. Det har rapporterats att det föreligger en dramatisk ökning av intracellulär kalciumkoncentration i åldrade neuroner jämfört med Youn g nervceller 32. Därför är det troligt att mitokondrierna i neurites av dessa i åldern nervceller skulle visa mitokondriella granulat inte nödvändigtvis som ett tecken på stress, utan snarare för att de har en högre förekomst av intracellulär kalcium.
Elektrontäta mitokondriella korn har också rapporterats i möss embryonala fibroblaster odlade i-kulturen och avbildas med samma teknik (cryo-elektron tomografi) som används i vårt manuskript 20. Dessa celler visade inte typiska mönster av ultra förändring som förknippas med cellskador, till exempel cytoskeletal störningar och vakuolisering av cytoplasman. Likaså inom våra neuriter som visualiseras genom cryoET, vi observerade inte en störd cytoskelettet som annars skulle vara förknippade med cellulär toxicitet. Med tanke på ovanstående kan vi dra slutsatsen att de nervceller i våra förberedelser inte visa mitokondriella granulat som ett resultat av stress eller toxicitet.
innehåll "> Att sterilisera EM gallerytan för att förhindra förorening av de nervceller, och också att åstadkomma en gynnsam, hydrofil yta på EM-galler med vilka poly-L-lysin kan vidhäfta, flamma EM-galler före utstrykning neuroner befanns att vara fördelaktigt. UV-sterilisering valdes inte eftersom det kräver bestrålning av nätet under en längre tid (t ex 20-30 min) i biosäkerhet huva. Då skulle gallren måste på nytt exponeras på nytt för miljön när de blir glöd -ut i syfte att hydrofilisering nätet yta. Glöd urladdning nätet garanterar att den efterföljande poly-lysin beläggning skulle effektivt "pinne" till nätet. Tekniken för flammande näten är fördelaktig eftersom den kombinerar både hydrofilicerande steg och sterilisering steg i ett. är Primära nervceller kända för att vara känsligare än tumörbaserad cellinjer och det är viktigt att hålla sin omgivning (rutnät, petriskål) så sterilt som möjligt.(fig 3C och 5), som täcker mer av gallerområdet i syfte att välja vilken neurite bilden . Sedan kan 2-D-em kryo bilder tas med intervaller och digitalt sammanfogas till ett montage (Figur 6). Denna teknik kan vara användbar för ultrastrukturella funktioner, som mikrotubuli organisation, över en större yta än en enda Cryo-EM bilden.
Med låg dos, låg förstoring bilder (figur 3C och 5) är också användbart för att identifiera områden av neurite som är konsekventa i diameter över Holey kol filmen (både i hålen och över kol) och därmed mer idealisk för bildbehandling och efterföljande analyser. Förstoring av neuriter över hålen i kolfilmen ses typisk i större neuriter (Figur 5) med klart mer internt material än tunnare neurites (Figur 3C). Detta fenomen tros ske på grund av bristen av fysiskt stöd i hålen i kolfilm. När EM-galler avlägsnas från skålen i vilket neuronerna växte och därefter blottades från baksidan, neuriter med mer inre massa (fig 5) än andra (figur 3C) tenderar att expandera och / eller hänger ner i hålen. Även om detta verkar vara en artefakt, den har en fördel som att tydligare visa de inre beståndsdelarna i neurite. Med hjälp av en kontinuerlig kolfilmen överdras på detta Holey kol film kan bidra till att kringgå detta problem i framtida studier. Denna inställning var ursprungligen försökte men resulterade i glaskroppen is för tjock för avbildning. Efterföljande försök med olika tjocklekar på kontinuerlig kol som lagts över EM rutnätet kan behöva ytterligare undersökningar.
Ett viktigttig förmån för den nuvarande metoden är att den rumsliga organisationen av cellkomponenter inom neurite kan visualiseras på nanometerskala genom att ta flera 2-D bilder i en enda neurite vid olika lutningsvinklar, och rekonstruera denna bunt med bilder till ett tomogram. Individuella strukturella egenskaper kan sedan manuellt kommenterad för varje 2-D-skiva av 3-D stack i olika färger med hjälp av lämplig programvara (se tabell i Material och reagens) som visas för ett axon av en råtta E18 dorsala ganglion (DRG) neuron (Figur 4) och en neurite av en råtta E18 hippocampus neuron (Figur 8).
Genom att välja att ta en bild var 5 grader under tilt serien, i stället för 1 eller 2 °, är färre bilder samlas in, men en högre elektron dos kan användas per bild. Detta resulterar i högre kontrast och mindre brus i råbilder. Det är bättre i syfte att återuppbyggnaden (anpassning av korskorrelation som en st ep) och efterföljande tomogram annotering, vilket görs genom att en ägare för varje bild innefattar tomogram stacken i z-riktningen. Att välja en stegstorlek också beror på storleken av provet, mellan olika lutningsvinklar, kommer större exemplar inte variera så mycket. I detta fall använde en större stegstorlek (5 °) tros vara mer lämplig på grund av den relativt stora exemplar storlek neurit.
Dessutom skulle lägga referensguldmarkörer till EM rutnätet hjälpa för fina bildjustering om så önskas. Referensmarkörer användes inte, eftersom urvalet var relativt stora jämfört med andra Cryo-EM prover (virus eller proteiner i isolering) och visade hög kontrast med en rad olika strukturella egenskaper som kan användas för korrekt inriktning av var och en av de 2-D bilder (innefattande 3-D stack) genom korskorrelation. Den resulterande bilden stacken var väl i linje med hjälp av denna metod, och användbar för efterföljande 3D-färg anteckning.
ent "> För framtida studier, med hjälp av ett mikroskop med en energi-filter skulle kunna minska buller som orsakas av oelastiskt spridda elektroner men en sådan funktion kan inte vara lätt tillgänglig på de flesta elektronmikroskopi anläggningar. Vår procedur avslöjar vad bilder kan bli följden av en standard 200 kV mikroskop utan energifilter, kan som vara mer allmänt tillgängliga för neurovetenskap samhället i stort.Protokollet som beskrivs här är optimerad för att förbereda och visualisera både råtta embryonala DRG axoner och hippocampus neuriter med hjälp av kommersiellt tillgänglig utrustning för Cryo-EM och Cryo-ET. En av de viktigaste fördelarna med denna teknik är att den ger strukturell information från hela neuriter, inte sektioneras, slipat eller behandlas med olika kemiska reagenser för att se deras ultrastruktur. Vi har visat hur kryo-ET är en särskilt bra metod att använda i framtida ultrastrukturella analyser av nervceller i en nära-till-nativa tillstånd för att pröva effektenav neurologisk sjukdom på neurite struktur.
De elektronmikroskopi Databank anslutningsnummer för de 3-D tomogram som redovisas i denna uppsats är följande: För råtta hippocampus neurit som visas i figur 8 och i huvud video (från 8:45 till 9:01), den EMDB antal anslutnings är EMD-5887. På råtta dorsalrotganglia neurite såsom visas i fig 4 och i huvudvideo (från 9:02 till 09:15), är numret EMDB anslutning EMD-5885.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning har fått stöd av NIH bidrag (PN2EY016525 och P41GM103832). SHS fick stöd av ett stipendium från nanobiology Interdisciplinary Graduate träningsprogram för WM Keck Centrum för Tvärvetenskaplig Bioscience Utbildning av Gulf Coast konsortierna (NIH Grant No T32EB009379).
SHS dissekerade, växte och förglasat DRG och hippocampus celler, samlas Cryo-EM och Cryo-ET data för DRG och hippocampus axoner, rekonstrueras och färg-kommenterad tilt serien. MRG dissekerade och förutsatt hippocampus celler i MNR labb. SC hjälp med lutning serien anteckning. SHS var utbildad av CW om hur man dissekera och odla nervceller. SHS, WCM och WC tänkt experimenten. SHS förberett manuskriptet med input från andra författare.
Den här videon filmades vid Centrum för Cellular Imaging och NanoAnalytics (C-CINA) i Biozentrum av tHan University Basel. C-CINA är integrerad i avdelningen för Biosystems och informationsteknik (D-BSSE) av ETH Zürich, som ligger i Basel, Schweiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
