Summary
Neuronale processen bewaren voor ultrastructurele analyse beschrijven we een protocol voor beplating van primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door flash-bevriezen, waardoor monsters gesuspendeerd in een laag van glasachtige ijs. Deze monsters kunnen worden onderzocht met een cryo-elektronenmicroscoop om structuren te visualiseren op de nanometer schaal.
Abstract
Neurieten, zowel dendrieten en axonen, zijn neuronale cellulaire processen die de geleiding van elektrische impulsen tussen neuronen mogelijk. Het definiëren van de structuur van neurites is cruciaal om te begrijpen hoe deze processen te verplaatsen materialen en signalen die synaptische communicatie ondersteunen. Elektronenmicroscopie (EM) is van oudsher gebruikt om de ultrastructurele functies binnen neurites beoordelen, maar kan de blootstelling aan organische oplosmiddelen tijdens uitdroging en hars inbedding structuren verstoren. Een belangrijke onvervulde doel is het formuleren van procedures die het mogelijk maken voor structurele evaluaties niet beïnvloed door dergelijke artefacten. Hier hebben wij een gedetailleerde en reproduceerbare protocol voor het kweken en Snelkoelen geheel neurieten van verschillende primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door de behandeling met cryo-electron tomografie (cryo-ET) vastgesteld. Deze techniek maakt 3-D visualisering van bevroren gehydrateerd neurieten op nanometer resolutie vergemakkelijken assessment van hun morfologische verschillen. Ons protocol levert een ongekend uitzicht op dorsale wortel ganglion (DRG) neurites, en een visualisatie van de hippocampus neuronen in hun buurt-inheemse staat. Als zodanig zijn deze werkwijzen maakt een basis voor toekomstige studies neurieten van zowel normale neuronen en die beïnvloed door neurologische stoornissen.
Introduction
Neuronen stellen de complexe schakelingen essentieel zijn voor de functie van het centrale en perifere zenuwstelsel door de uitwerking dendrieten en axonen informatie, vaak nogal lang, communiceren downstream neuronen ontvangen. Neuriet uitgroei speelt een fundamentele rol tijdens embryonale ontwikkeling en neuronale differentiatie en onderhoud van neurieten ondersteunt de kritische functie van het zenuwstelsel. Neuritische processen hebben ook kritisch in neuronale schade en herstel, evenals aandoeningen van het zenuwstelsel. De studie van neuronale architectuur is cruciaal voor zowel de normale en zieke hersenen te begrijpen. Gelukkig, fysiologisch relevante neuronale celkweek systemen bestaan die kunnen complexe en heterogene cellulaire structuren recapituleren. Gebaseerd op de opheldering van vaste experimentele platforms, effectieve visualisatie strategieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyses van neuronale morfologie mogelijk nodig. Vooral nuttig zouzijn een gedetailleerde methodologie die een consistent platform voor het visualiseren neurites, zowel axonen en dendrieten op de nanometer schaal biedt.
Traditionele elektronenmicroscopie vereist het gebruik van organische oplosmiddelen bij uitdroging en hars inbedding, die verstoringen kunnen veroorzaken in de monsters uit hun ware staat. Tot op heden zijn de meeste structurele karakteriseringen op nanometerschaal op basis van grotere cellen of weefsels die worden blootgesteld aan zulke agressieve chemicaliën - en dus de interpretatie van de bevindingen 4,9,25 beperken. Bovendien, voor elektronenbundel penetratie, snijden is vereist voor organismen of cellulaire uitsteeksels vertonen een dikte van meer dan 1 urn 12. Tenslotte doorsnede of gemalen weefsel leidt verzameling van discrete slice-specifieke datasets, waardoor omslachtige de definitie van de langwerpige kenmerk van neurieten. Zelfs voor cryo-EM, waarbij snijden diepvriesbewaarruimte gehydrateerde monster mogelijk is, stelt de werkwijze compressie artifhandelingen 1.
In de afgelopen jaren hebben onderzoekers geleerd hoe hippocampusneuronen direct groeien op EM roosters en-flits bevriezen ze in vloeibare ethaan om vervolgens neurites visualiseren met behulp van cryo-ET 8,10,18,23. Echter, deze studies gebruik maken van een hulpmiddel naar maat 10,23, of het ontbreken details over de blotting stap voor het genereren dun genoeg glasvocht ijs voor routinematige visualisatie 8,18. Bijvoorbeeld, een studie adviseert het gebruik van 30-40 seconden voor blotting de EM rooster 10, maar wordt deze waarde niet geoptimaliseerd voor algemeen gebruik, maar is specifiek voor die custom-made-duik bevriezing apparaat. Met behulp van een op maat gemaakte inrichting in plaats van een commercieel verkrijgbaar een 17 voor het behoud van vocht voorafgaand aan een duik-bevriezing van het monster kan een hindernis voor grootschalige reproduceerbaarheid opleveren.
Hoewel deze studies zijn baanbrekend visualiseren neurieten door cryo-ET, hebben we een stap verder naar de ap verkennentoepasselijkheid van cryo-ET van verschillende neuronale specimens (hippocampus en dorsale wortel ganglion neuronen). Daarnaast bespreken we zowel optimale en suboptimale resultaten, alsook de mogelijke artefacten die men zou kunnen optreden bij het gebruik cryo-ET voor dergelijke specimens.
Het definiëren van een gedetailleerde techniek voor het behoud en het visualiseren hele neurites op de nanometer schaal in een near-native staat zou de mogelijkheid voor meer onderzoekers om ultrastructurele studies uit te voeren verbeteren. Daartoe doeltreffende en gedetailleerd protocol beschrijven we de handel verkrijgbare apparatuur losgemaakt, onbesmet neuronen bereiden neurieten visualiseren. Dit is een belangrijke eerste stap in de richting waarin de ultrastructuur van gezonde neurites en de basis te leggen voor het begrijpen van wat structurele verschillen aanwezig in het zenuwstelsel ziekte modellen. Sinds cryo-ET niet vastgelegde, onbesmet neuriet functies op nanometerschaal kan oplossen in 3-D, zal de methode maakt het mogelijk als nooitvoorgrond neuritische architectuur 12 definiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het voorbereiden Gerechten met EM Hekwerk voor Plating primaire neuronen
- Onderzoek de integriteit van essen koolstof op de gouden EM roosters met behulp van een lichtmicroscoop bij vergroting van ten minste 25X. Zorg ervoor dat carbon gaten zijn> 98% intact.
- Voor plating primaire neuronen, gebruik dan een bunsenbrander aan vlammen steriliseren de EM roosters en tegelijkertijd ze hydrofiel te maken. Gebruik een pincet te halen de EM-net bij de rand, niet de centrale gerasterde oppervlak. LET OP: Laat nooit een brandende bunsenbrander zonder toezicht, en geen handschoenen of een pincet gebruiken met plastic onderdelen tijdens het uitvoeren van deze stappen:
- Alvorens de bunsenbrander, zet de lucht en gas aanpassingen aan een minimaal open positie.
- Steek de bunsenbrander met een spits vuursteen of butaan lichter.
- Wijzig de lucht en gas aanpassingen aan een kleine, blauwe innerlijke vlam binnen een groter, lichter blauw / violette vlam te bereiken. De tip van de innerlijke vlam is het heetste deel van de vlam. De knop onderneath de brander regelt de hoeveelheid gas die in de branderbuis, terwijl de loop van de brander kan worden gedraaid om de hoeveelheid lucht die de brander passen. Door de lucht afstelling rechtsom verlaagt de lucht (resulterend in een paarse vlam) en tegen de klok in verhoogt de lucht (resulterend in een gele vlam).
- Met behulp van metalen pincet (geen plastic onderdelen) aan de EM rooster te houden, snel haal hem door de vlam twee keer, tegenover koolstof-kant naar boven. De koolstof kant zal meer matte (minder glimmend) verschijnen en met meer van een grijsachtige tint dan de andere kant.
- Onmiddellijk overdracht van de rooster (koolstof-kant naar boven) in het midden van de glazen bodem schaal geplaatst binnen 10 cm van de bunsenbrander. Gebruik een EM rooster per schaal (figuur 1). Gebruik alleen glazen bodem gerechten die worden vooraf gesteriliseerd, dat wil zeggen via gammastraling.
- Gebruik een lichtmicroscoop aan het net integriteit (carbon gaten intact) controleren terwijl nog het houden van de EM rooster in het glas-bottOM schotel (om besmetting te voorkomen). Bij toepassing van een stof op het rooster of iets dat in contact met de neuronen komen, steriel procedure en steriele pipet tips.
- In een weefselkweek kap met steriele procedure, van toepassing 250 ul van de juiste coating stof langzaam en voorzichtig naar de centrale glazen gedeelte van de petrischaal. Zorg ervoor dat de juiste coating stof bestrijkt het hele EM rooster.
- Voor hippocampale neuronen gebruikt poly-L-lysine (PLL, 1 mg / ml) als bekledingsstof, bereid zoals eerder beschreven 19. Merk op dat 250 ul nodig per EM rooster, per gerecht, dus houd daar rekening schaal van de partij. Voor dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen, gebruik dan een geleiachtige eiwitmengsel uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen (zie tabel van materialen en reagentia) als de coating stof, bereid als volgt. Merk op dat 250 ul nodig per EM rooster, per gerecht, dus houd daar rekening schaal van de partij.
- Ontdooi een voorraad flesvan de geleiachtige eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen overnacht bij 4 ° C.
- Houd koude de geleiachtige eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen, en alle onderdelen die worden gebruikt om de oplossing te maken, namelijk door ze op ijs.
- Terwijl op ijs, verdund dit gelatineachtige proteïne mengsel Neurobasal medium een verdunning 1:20 opleveren (bijvoorbeeld verdun 500 gl van het gelatineuze proteïne mengsel in 10 ml Neurobasal).
- Verdeel verdunde proteïne gelatineuze mengsel in 1 ml porties en onmiddellijk extra porties bewaard bij -20 ° C.
- Solliciteer 250 ul per EM rooster, per gerecht, zoals beschreven in paragraaf 1.4.
- Voor hippocampale neuronen gebruikt poly-L-lysine (PLL, 1 mg / ml) als bekledingsstof, bereid zoals eerder beschreven 19. Merk op dat 250 ul nodig per EM rooster, per gerecht, dus houd daar rekening schaal van de partij. Voor dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen, gebruik dan een geleiachtige eiwitmengsel uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen (zie tabel van materialen en reagentia) als de coating stof, bereid als volgt. Merk op dat 250 ul nodig per EM rooster, per gerecht, dus houd daar rekening schaal van de partij.
- Dek de petrischaal met zijn top en incubeer (hetzij PLL voor hippocampus specimens, of met de gelatineachtige proteïne mengsel DRG specimens) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in de weefselkweek kap.
- Aspiwaardeert alle PLL (voor hippocampus monsters) of de gelatineuze eiwitmengsel (voor DRG specimens) van de gerechten. Om dit te doen, gebruik maken van het vacuüm-systeem in de weefselkweek kap. Gebruik een steriele pipet aan de vacuümbuis. Vermijd direct contact met de EM rooster.
- Gebruik een regelbare displacement pipet 250 pi steriel PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) voorzichtig toepassing op de EM raster in het centrale glasoppervlak van elke petrischaal, zodat de EM rooster volledig onder PBS. Vervolgens zuig het PBS van elke schaal. Herhaal 3x.
- Laat de gerechten met EM roosters te drogen onder de weefselkweek kap gedurende 15 minuten. Zorg ervoor dat ze volledig droog zijn door het controleren onder de lichtmicroscoop in de weefselkweek kamer. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen van vocht in het raster. Dan zorgvuldig aspireren naast de EM net deze extra vocht te elimineren. De gecoate rooster moet onmiddellijk worden gebruikt voor plating de neuronen.
2. Voorbereiden en Plating primaire neuronen over EM Grids
- Primaire neuronen, eerste ontleden, trypsinize (met 2,5% trypsine) en vermaal plaat naar de hippocampus (of dorsale wortel ganglion van 18 dagen oude embryo rat) dissociëren in individuele cellen zoals eerder beschreven 19.
- Vermaal is een veel voorkomende term die gebruikt wordt door neurobiologen om te distantiëren groepjes van cellen te beschrijven in individuele cellen, met name door het gebruik van een glazen pipet met een brand-gepolijst tip. Het resultaat wordt bereikt door het zorgvuldig en langzaam het trekken en loslaten van de cellen op en neer, verschillende malen (~ 30) door de pipet.
- Volg de procedures zoals eerder beschreven voor DRG dissectie en celisolatie 24, nemend tot 0,25% trypsine (in HBSS) om de rat DRG neuronen te isoleren, in plaats van de enzymen voorgesteld (papaïne, collagenase / dispase) die meer geschikt zijn voor muis DRG neuronen.
- Bereken het aantal geïsoleerde neuronen (dat wil zeggen met behulp van een hemocytometer)en deze waarde om de juiste hoeveelheid cellen berekenen toepassing op elke schotel een concentratie van 50.000 cellen / ml per schaal bereiken. Het maximale volume van toepassing is 250 pl. Merk op dat dit alleen de centrale glasoppervlak, niet het gehele gerecht vult.
- Incubeer de schotels voor 30 min in een CO2 incubator bij 37 ° C. Laat cellen om te herstellen en zich te houden.
- Voeg langzaam 1,5 ml verwarmd medium bij elk gerecht, het verzorgen van de EM rooster niet te verstoren. Het type media is afhankelijk van het celtype (hippocampus of DRG).
- Bereid de juiste media voor zowel hippocampale neuronen 19 of dorsale wortel ganglion neuronen 24, die wordt verwarmd in een 37 ° C waterbad voor gebruik. Incubeer de gerechten 's nachts in de CO 2 incubator.
- Voor hippocampusneuronen, veranderen de media de volgende dag. Wijzig de helft van het medium elke twee dagen verder gedurende 14 dagen. Verwarm de media in een 37 ° C waterbad voor gebruik. Voor DRG neuronen, de dag na dissectie / plating, stelt een nieuwe voorraad van media met een anti-mitotisch middel (Uridine en 5'-fluor-2'-deoxyuridine) levert een 10 mM voorraadoplossing van elk afzonderlijk, gebruik een definitieve concentratie van 10 uM voor elk. Verwijder de helft van de DRG medium (875 pl) en voeg 875 ul vers medium met anti-mitotische middel.
- Voor DRG neuronen, elke twee dagen de eerste week, afwisselende veranderende informatie tussen anti-mitotische media en standaard DRG media. Voor de tweede week, veranderen standaard DRG media om de twee dagen.
3. Vitrifying Neuronen op EM Grids
- Bereid apparatuur en alle materialen voor het invriezen en bewaren in het EM roosters bij cryogene temperatuur: een verglazing apparaat met een vochtige kamer 17, puntig gespecialiseerde pincet voor de verglazing machine, lange vlakke punt pincet, dewar (s) van vloeibare stikstof (LN 2), coolant container, EM rooster opbergdoos, calcium-vrije filterpapier.
- Start de verglazing apparaat. Stel de vochtigheid van 100% en de temperatuur tot 32 ° C. In de sectie "Console", stelt de vlek tijd op nul seconden. Dit kan met de hand te deppen door de zijruit van vochtkamer de verglazing machine.
- Behandel de calciumvrij filtreerpapier met handschoenen, gelaagdheid hen zodanig dat drie papers worden gestapeld. Snijd de stapel in 0,5 cm brede stroken die ~ 2 cm lang. Buigen bij een 90 ° hoek zodat een zijde van het papier een 0,5 cm x 0,5 cm vlak (figuur 2). Met een pincet, verwijder het midden papier en leg het op een andere calciumvrij filtreerpapier tot gebruik.
- Zet de storage-knop in de houder knop binnen de verglazing kamer. Vul de binnenkamer van de koelvloeistof container met vloeibare stikstof en wacht tot volledige verdamping. Vul de buitenste kamer van the koelvloeistof container met vloeibare stikstof totdat het op stabiele temperatuur voor u verder gaat met de volgende stap. Vul het binnenste kamer met een hoge zuiverheidsgraad gasvormig ethaan dat zal condenseren tot een vloeibare toestand in de gekoelde ruimte.
- Verplaats de schotel (es) van de incubator een grote 100 mm polystyreen gerecht voor transport naar de verglazing kamer, zo niet in de onmiddellijke nabijheid. Gebruik de gespecialiseerde verglazing pincet om zorgvuldig kiezen van de EM rooster uit de schotel. Let op welke kant de neuronen groeien op de EM rooster, de positie van belang voor de volgende stap. Gebruik de zwarte schuiven slot op de pincet om veilig vast de pincet op de EM rooster.
- Plaats de pincet in de verglazing machine zoals die kant van de EM raster waarop de neuronen gehecht vlakken naar links, weg van de zij-opening gat van de verglazing machine. Trek de gespecialiseerde pincet in de verglazing machine.
- Plaats de koelvloeistof container in de juiste houdervan de verglazing machine. Het moet worden gevuld met voldoende LN 2 en vloeibare ethaan. Met de juiste scherm bevel van de verglazing machine, verhogen de koelvloeistof kamer naar boven totdat het gespoeld met de onderkant van de vochtige kamer.
- Met de vlakke punt pincet, grijpen een rand van het filterpapier, zodat de korte kant (het 0,5 cm x 0,5 cm gezicht) loodrecht op de pincet. Dit gezicht zal in direct contact met de EM rooster komen voor blotting (Figuur 2B). Plaats de filter papier voorzichtig in de side-gat van vochtkamer de verglazing machine (Figuur 2A). Stabiel houden het papier tegen de EM rooster (de afgekeerde zijde van het monster) gedurende 10 sec. Gooi het papier daarna meteen duik-vries het model in de vloeibare ethaan met behulp van automatisering van de verglazing machine.
- Overdragen diepvriesproducten gehydrateerd EM rooster voorzichtig een van de sleuven in een van denetwerk storage knoppen. Herhaal dit proces voor extra EM roosters in de gerechten. De EM netwerk storage-knoppen gebruikt in deze experimenten kunnen meerdere bevroren gehydrateerd EM grids slaan.
4. Afbeelding verzameling, verwerking, en annotatie
- Ga verder met 2-D electronenmicroscoop en / of 3D tilt reeks 5 van de neurieten met een cryo-elektronenmicroscoop onder een lage dosis toestand verzamelen. De 2-D beelden waren bedoeld om de kwaliteit van het netwerk beoordelen op ijsdikte en mogelijke gebieden nuttig voor 3-D tilt series zijn.
- In dit geval werden alle beelden verzameld met een 4k x 4k CCD camera aan een 200 kV elektronenmicroscoop uitgerust met een tilt vloeibare stikstof cryo overdracht houder op 20k microscoop vergroting op een doel underfocus van 7 urn en bemonstering van 4,4 Å / pixel.
- Om een 3D tomogram van het monster te verkrijgen, neem een reeks van projectie beelden terwijl stapsgewijs het kantelen van de sample along een as van de transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Gezien de hellingshoeken en andere experimentele instellingen, zijn er verschillende software beschikbaar om dit te verhelpen serie 5 automatisch verzamelen. De 3-D tilt series hier verzameld op dezelfde microscoop met semi-automatische tilt series acquisitiesoftware 26 over een bereik van -60 ° tot 60 ° in stappen van 5 ° met een cumulatieve dosis van 60 ~ e / A 2.
- Reconstrueren de tilt-serie van het neurites gebruik van image processing software 21 als eerder beschreven voor andere monsters 5,29.
- Color-annoteren de 3-D eigenschappen van de neurieten door eerst het segmenteren tomogram en het creëren van een oppervlak model met een 3-D beeldverwerkingssoftware zoals eerder beschreven 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorafgaand aan het invriezen en beeldvorming via cryo-ET dient lichtmicroscoop beelden worden gemaakt van de EM raster waarop de neuronen groeien. Neurieten moet duidelijk zichtbaar zonder aanzienlijke overlapping met elkaar. Een gekleurde doos in figuur 3A vertegenwoordigt een gebied dat wordt ingezoomd om een hogere vergroting in figuur 3B, waarbij neurieten uitstrekken over het rooster van het rooster tonen. Elk raster vierkante bestaat uit een essen koolstof film die de neuronen en hun neurieten ondersteunt. Deze gaten zijn duidelijk zichtbaar lage dosis afbeelding van een cryo-EM genomen op 4k vergroting, die het neuron lichaam toont als een relatief groot, donker, elektron-dichte object (figuur 3C), waaruit neurites project naar buiten in.
Een deel van de neurieten rust boven een gat in de koolstof wordt geselecteerd in een gekleurd vak in figuur 3C en ingezoomde bij een hogere vergroting (20k) in figuur 3D. Op deze vergroting moet duidelijke interne cellulaire structuren waaronder microtubuli, blaasjes, en mitochondriën duidelijk zichtbaar (Figuur 3D), in het bijzonder in het optimaal dunne ijs zoals gegenereerd door het volgen van dit protocol. De donkere zwarte structuren in het midden van het beeld (figuur 3D) hexagonaal ijs deeltjes die worden beschouwd als verontreiniging en dienen gewoonlijk te worden vermeden, maar aangezien zij zeer schaars en buiten de neurieten zelf, ze niet interfereren met de wederopbouw en kleur-annotatie van de interne structuren voor analyse en interpretatie (figuur 4). Lage dosis, het andere lage vergroting wordt weergegeven in figuur 5, waar een neuriet kan worden geplaatst, waarna een aantal 2-D beelden kunnen worden genomen en digitaal elkaar geplakt met beeldverwerkingssoftware een montage (figuur 6) te genereren.
De initiëlelage plating concentratie (50.000 cellen / ml per plaat) van neuronen op de EM roosters zorgt voor neuronen die ver genoeg zijn afstand van elkaar om duidelijke visualisatie van hun neurieten (figuur 3C) te waarborgen; hogere concentraties dan aanbevolen (> 50.000 cellen / ml per plaat ) kan resulteren in een suboptimale beelden van overvolle neurites die moeilijk te traceren of kenmerk cellulaire componenten (figuren 7B en 7C) zijn.
Figuur 1. Regeling voor het kweken neuronen op EM roosters binnen glazen bodem gerechten. (A) glazen bodem gerechten worden getoond, gedeeltelijk gevuld met mobiele media (roze). (B) Elk gerecht bevat een gouden EM rooster, als een beter zicht onthult. (C) Coating van de EM rooster met poly-lysine wordt getoond als een cartoon side-cutaway. De glazen onderste schaal bestaat uit een vierkante glazen dekglaasje dat de bodem van een plastic kweekschaal, die een cirkelvormige opening die oorspronkelijk werd gesneden uit de bodem wordt bevestigd. Deze glazen bodem gerechten zijn gamma gesteriliseerd en commercieel gekocht als premade. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Schematische voor handmatige blotting van EM roosters met neuronen gehandeld. (A) Close-up van glijdende ingangsgleuf de verglazing machine (zwarte pijl) om de vochtigheid / deppen kamer, waarin pincet zal worden ingevoegd met het model handmatig vlek. (B)Regeling cartoon laten zien hoe het calcium filtreerpapier (0.5 cm x 0.5 cm face) moeten worden behandeld met behulp van de platte-punt pincet en ingebracht via de ingang sleuf in de vochtige kamer van de verglazing machine voor blotting de EM raster waarop de neuronen worden nageleefd (druppel roze mobiele media getoond). De EM rooster wordt gehouden door fijn-point gespecialiseerde pincet in de vochtige kamer. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Visualisering bevroren gehydrateerde neuronen op goud elektronenmicroscopie (EM) roosters. (A) het licht microscoop bij 10X vergroting van het centrale gebied van een EM raster waarop de rat primaire neuronen gro geweestvleugel voor 2 weken. (B) Ingezoomde-gezien de aqua doos getoond in (A), waarbij neuronen en hun neuriet projecties te zien zijn (roze pijlen). (C) EM bij 4K vergroting van een neuriet naar buiten uitsteekt uit het neuron lichaam (rode pijl). Schematisch komt overeen met een gebied (dwz het rode vak) binnen een van de hokken aangegeven in (B). Blauwe doos wordt bekeken close-up in (D), waarbij interne functies van de neuriet zijn duidelijk zichtbaar op 20k vergroting (groene pijl mitochondriën; oranje pijl microtubuli; blaasje blauwe pijl). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. 3-D reconstructie en annotatie van een rat DRG axon tomogram. (A) tomografische slice van een gereconstrueerde stapel foto's genomen op verschillende hellingshoeken van een DRG axon. (B) Overeenkomstige 3-D annotatie van hetzelfde axon. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 5. 2-D cryo-EM beeld van een rat DRG neuron (midden-links) met axonale projecties (rode doos) op 4k vergroting. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 6. Montage van vier 2-D cryo-EM beelden van een enkele rat DRG axon. Elk beeld werd genomen bij 20k vergroting. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 7. 2-D cryo-EM foto van neurieten. (A) Een rat DRG axon afgebeeld dichter nabij de cel soma. (B, C) Voorbeelden van overbevolking van neurieten door hoge plating concentratie van neuronen op EM roosters. Alle neurites waren snel bevroren twee weken na plating op goud EM roosters. Alle beelden werden genomen op 20k;. Vergroting Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 8. 3-D reconstructie en annotatie van een rat hippocampus neuriet tomogram. (A) tomografische slice van een gereconstrueerde stapel foto's genomen op verschillende hellingshoeken van een hippocampus neuriet. (B) Overeenkomstige 3-D annotatie van dezelfde neuriet. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We zien dat rat embryonale neuronen (dorsale wortel ganglion en hippocampus) kunnen worden gekweekt op goud elektronenmicroscopie (EM) roosters en glasachtige ijs dun genoeg zijn neurieten worden afgebeeld met behulp van 2-D cryo-EM en 3-D cryo-ingevroren ET. Terwijl hippocampus neurites eerder zijn afgebeeld met behulp van cryo-ET 8,10,18,23, een protocol gedetailleerd genoeg voor een succesvolle replicatie met behulp van commercieel beschikbare apparaten heeft ontbroken. Bovendien, terwijl hun onderzoek het gebruik van cryo-ET voor het visualiseren van de hippocampus neurites is een pionier, onze studies onderzoeken de toepasbaarheid van cryo-ET om meer dan een type van neuronale specimen.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voorbereiding EM roosters met ofwel de hippocampus en dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen, blotting hen om optimaal te dun ijs te bereiken, en duik-ze te bevriezen voor de beeldvorming door cryo-ET. Optimale blotting is een die niet leidt tot ijs te dik om de elektronenbundel door te dringen,noch te dun dat het glasvocht ijs verschijnt met name verschillend verloop van de rand van de essen carbon om het binnenste van de vol gaten koolstof. Bovendien, het bereiken van optimaal dun ijs door het gebruik van een verglazing machine 17 mei iets anders zijn voor elk project, en robuuste bevriezing met behulp van de vitrificatie machine heeft een leercurve.
Hoewel eerder onderzoek heeft zich gericht op de hippocampus neuronen, hier ook verkend in onze studies hebben we verder gegaan om beelden te tonen op de nanometer schaal van intacte, bevroren gehydrateerd hele axonen van de dorsale wortel ganglion (DRG), nooit in beeld gebracht voor het gebruik van cryo- EM of cryo-ET. DRG cellen werden gekozen omdat zij (in tegenstelling tot hippocampale neuronen) uitsluitend leiden tot de neuronen 34. Een protocol voor het afbeelden van hen door cryo-EM/cryo-ET kan nuttig zijn voor diegenen die geïnteresseerd zijn om axonale ultrastructuur dwz in sensorische neuronen af te leiden zijn. We hebben ook presenteren en bediscussiëren zowel optimale en suboptimale resultaten enals de mogelijke artefacten die men zou kunnen optreden bij het gebruik cryo-ET voor dergelijke specimens.
Op de juiste celconcentratie (50.000 cellen / ml per schaal), afstand tussen neuronen zodanig dat neurieten zorgen voor uitstekende toegang die lichte en elektronenmicroscopie (Figuren 3A en 3B) met een of twee neuronen opgenomen per raster vierkante (figuur 3B) . Het toestaan van voldoende scheiding tussen de neuronen is noodzakelijk voor duidelijke visualisatie van de neurites via cryo-EM (Figuren 3C en 3D). De neuronen en hun neurieten worden ondersteund op een essen carbon film van goud rooster, zoals duidelijk te zien in de cryo-EM afbeeldingen (Figuren 3C en 3D). De neuron lichamen, die kan variëren van ~ 15-50 micrometer voor de hippocampus neuronen en dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen 30,33 zijn te dik voor beeldvorming met behulp van cryo-EM en lijken volledig zwart, zoals typisch is voor very elektron-dichte objecten en dikke monsters, in vergelijking met de relatief dunnere projecties van neurieten (niet meer dan 1 urn in diameter) uitstralen van hen (Figuren 3C en 5).
Hars geïntegreerde 3-D hersenweefsel niet neurieten die volledig cirkelvormig in dwarsdoorsnede 14 blijkt, in feite, de morfologie variabel. Het is dus niet bekend of de niet-ronde vorm van neurites is natuurlijk wel een monster voorbereiding artefact. De gemeten dikte van de DRG axon (figuur 4) gegroeid op de TEM rooster, geblot en afgebeeld zoals in deze studie was 0,32 urn in de z-richting (in de diepte van het glasvocht ijs) en een gemiddelde breedte van 0,53 urn het xy-vlak. De gemeten dikte van de hippocampale neurieten (figuur 8) gegroeid op de TEM rooster, geblot en afgebeeld zoals in deze studie was 0,50 urn in de z-richting (in de diepte van het glasvocht ijs) en eengemiddelde van 0,72 micrometer in het xy-vlak. De blotting werkwijze zoals hierin beschreven kan de neurieten plat hoewel zij bleven gehydrateerd in de oorspronkelijke buffer gedurende het gehele proces van blotting en duik vriesproces.
De lichte afvlakking van neurieten op het rooster zoals waargenomen door cryoET lijkt niet de structuur van de interne bestanddelen zoals vesicles beïnvloeden hierin getoond, die bijna perfect cirkelvormig en vertonen geen tekenen van uitdroging. Daarentegen chemische processen vaak gebruikt in "traditionele" EM preparaten, met name chemische fixatie met glutaraldehyde en paraformaldehyde, gevolgd door dehydratatie in ethanol, leiden tot ongecontroleerde weefsel krimp. Het potentieel van geconfronteerd dergelijke schadelijke cellulaire effect geëlimineerd in de werkwijze presenteren we voor cryoET onze handschrift.
Verder is onze neurieten monsters werden onmiddellijk onderdompelen-bevroren in vloeibare ethaan, waardoor instant 'inbedding' in glasvocht ijs. Weefsels in een glasachtige toestand bevroren lijken veel meer lijkt op de fysiologische toestand dan andere technieken. Het niveau van ultrastructureel detail is niet het enige aspect dat maakt het in ons protocol beschreven techniek om waardevolle neurowetenschap onderzoekers. De techniek van het kweken neuronen op EM roosters, onmiddellijk deppen /-duik bevriezen ze te bewaren in een glasachtige toestand voor screening / beeldvorming door cryoET is een aantrekkelijke techniek, want het opent de mogelijkheid onderzoeken ultrastructuur van neuronen onder verschillende genetische, chemische of het milieu benadrukt zonder de zorg van mogelijke uitdroging artefacten.
De blotting voorwaarden vóór het invriezen, zoals beschreven in dit protocol, zijn belangrijk om het ijs dun genoeg genereren voor visualisatie door cryo-ET van de ultrastructurele functies, met inbegrip van interne componenten zoals mitochondriën, blaasjes en microtubuli (figuren 4, 6, 7A). Mitochondriën bijvoorbeeld kunnen worden geïdentificeerd voorbereidingen omdat ze lijken structureel vergelijkbaar met wat is waargenomen in cellen (de randen van muis embryonale fibroblasten) via cryo-electron tomografie 20. Ze vertonen ook cristae, die kan worden gezien in de 3-D-color geannoteerde afbeeldingen aanwezig in dit manuscript. Suboptimale afbeeldingen kunnen het gevolg zijn van dik ijs in welk beeld de cryo-EM lijkt over het algemeen ondoorzichtig, waardoor succesvolle identificatie van dergelijke eigenschappen zoals mitochondriën en microtubuli in de neuriet. Een gebrek aan voldoende gegevens voor het opstellen van dergelijke specimens, met name over hoe u optimaal dun ijs produceren, vrijwel zeker bijgedragen aan het beperkte succes bij het definiëren van de ultrastructuur van neurites 8,10,17,23.
Suboptimale afbeeldingen kunnen ook resulteren uit plating teveel neuronen op het rooster (> 50.000 cellen / ml per schaal), waardoor overbevolking van neurieten (figuren0, 7B en 7C). Wazige beelden kan een gevolg van onjuiste defocus en moet worden aangepast; de defocus in de hier getoonde afbeeldingen werd genomen met een gerichte underfocus van 7 micrometer. Beelden werden verzameld op die defocus hoger contrast en de zichtbaarheid van ultrastructurele eigenschappen zorgen, maar een lagere defocus (bijvoorbeeld 2-3 urn) kunnen ook worden gebruikt om hogere resolutie gegevens van die kenmerken te vinden.
Andere factoren kunnen bijdragen tot suboptimale afbeeldingen. Bijvoorbeeld, hoewel het verleidelijk om andere kenmerken van de verglazing machine, vooral de semi-automatische blotting functie plaats handmatige blotting hierin beschreven te gebruiken, dit gaf ongewenste resultaten. Dubbelzijdige blotting werd aanvankelijk geprobeerd met deze semi-automatische functie, waarin de verglazing machine (in plaats van de gebruiker) uitwist het monster direct met parameters zoals vloeipapier en het aantal vlekken zoals gespecificeerd door de gebruiker. Echter, after beeldvorming dergelijke monsters, bleek dat alle neuronen geopend had lyseerden, morsen uit hun inhoud (multivesiculaire lichamen, enz.). Daarom wordt de verglazing machine het best gebruikt in dit geval voor de temperatuur-beheersbare luchtvochtigheid kamer waarin het monster voorafgaand aan een duik-bevriezing wordt uitgewist. Handhaving van het monster in een dergelijke staat (met vocht ingesteld bijna 100%) minimaliseert water verliezen tijdens de bereiding en helpt ervoor te zorgen optimale glasvocht ijs achteraf invriezen 3,7.
Idealiter blootstelling van de neuronen externe verstoringen te minimaliseren, moeten ze worden gekweekt in een in de nabijheid van de kamer met de verglazing machine CO2 incubator (ingesteld op 37 ° C temperatuur) en de temperatuur van dit apparaat worden ingesteld 37 ° C voorafgaand aan flash-bevriezen van de neuronen op EM roosters. Men moet niet bloot te stellen neuronen te grote schommelingen in temperatuur voorafgaand aan blotting. In dit rapport werd de temperatuur ingesteld op 32 ° Cvoor blotting doeleinden; neuronen werden gekweekt in een ander gebouw en een tijdspanne van ~ 10 min plaatsgevonden tussen het dragen van de platen van de neuronen van de ene kamer naar de andere. Zorg is besteed aan de monsters in een waterbestendige, semi-geïsoleerde container te beschermen tijdens het transport proces. Een soortgelijke verandering in temperatuur en CO2-concentratie (zoals ervaren door de neuronen voor blotting / insteken bevriezen) ontstaan aan de neuronen om ~ 2 dagen dat de neuronen worden uit de incubatiekamer hun media onder bioveiligheid worden veranderd kap, zoals typisch gedaan neuronale culturen. Dit wordt niet gezien resulteert in toxische effecten voor de cel.
Wat betreft de aanwezigheid van wat lijken te elektron-dichte korrels binnen mitochondria de neurites ', verschillende tegenstrijdige berichten bestaan. Dergelijke korrels zijn in een verscheidenheid van verschillende weefsels, niet specifiek neuronale cellen. Ze worden gezien als een gootsteen van kationen die de interne ionische reguleren enving van het mitochondrion. Ze lijken ook contactplaatsen tussen binnenste en buitenste membranen waarin enzymen efficiënt 16 kan functioneren creëren.
Experimentele studies geven aan dat calcium en andere divalente kationen ophopen in mitochondria wanneer deze ionen in de vloeistof baden of geïsoleerde mitochondria of intacte cellen. Het lijkt waarschijnlijk dat de ionen organisch gebonden aan de reeds bestaande intra-mitochondriale granules. Voorgesteld wordt derhalve, dat deze korrels zijn verbonden aan de regulering van de interne ionische omgeving van het mitochondrion 31.
Bovendien zijn de neuronen in onze voorbereiding werden gekweekt op EM roosters voor 14 dagen, de intervallen die typisch is voor doeleinden van neuriet uitgroei 15,36 vóór beeldvormend cryoEM / ET. Er werd gemeld dat er een dramatische toename van de intracellulaire calciumconcentratie in oude neuronen vergeleken met jo g neuronen 32. Het is daarom aannemelijk dat de mitochondriën bij de neurieten van deze oude neuronen mitochondriale granules niet noodzakelijkerwijs als een teken van stress, maar liever weergeven omdat zij een grotere aanwezigheid van intracellulair calcium bezitten.
Elektronische dichte mitochondriale granules werden ook gerapporteerd in muis embryonale fibroblasten gekweekt in cultuur en afgebeeld door dezelfde technologie (cryo-electron tomografie) zoals gebruikt in onze manuscript 20. Deze cellen geen typische patronen ultrastructurele verandering geassocieerd met cellulaire schade, zoals cytoskelet verstoring en vacuolisatie van het cytoplasma tonen. Ook binnen onze neurites zoals gevisualiseerd door cryoET, hebben we niet waarnemen een verstoorde cytoskelet dat anders zou worden geassocieerd met cellulaire toxiciteit. Gezien de bovenstaande overwegingen, kunnen we concluderen dat de neuronen in onze voorbereiding niet mitochondriale korrels heeft weer als gevolg van stress of toxiciteit.
gehalte "> Om het oppervlak EM rooster steriliseren om besmetting van de neuronen voorkomen, en ook om een gunstige, hydrofiel oppervlak genereren op het EM rooster waarop de poly-L-lysine kan hechten, vlammen EM roosters vóór plateren neuronen gevonden om voordelig. UV sterilisatie niet gekozen omdat het vereist bestraling van het netwerk voor een langere tijd (bijvoorbeeld 20-30 minuten) in de bioveiligheid kap. vervolgens de netten zou moeten worden weer opnieuw worden blootgesteld aan de omgeving wanneer wordt glow -afgevoerd ten behoeve van hydrofiel oppervlak van het net. Glow-ontladen het raster zorgt ervoor dat de daaropvolgende poly-lysine coating zou effectief 'plakken' aan het net. De techniek van vlammende de roosters is voordelig omdat het een combinatie van zowel de hydrofilicerende stap en sterilisatie stap in een. worden primaire neuronen bekend gevoeliger dan tumor-gebaseerde cellijnen te zijn en het is van cruciaal belang om hun omgeving (grid, petrischaal) zo steriel mogelijk te houden.(Figuren 3C en 5), die meer van het rooster beslaat ten behoeve van het selecteren die neurieten aan het . Vervolgens kan 2-D cryo-EM foto genomen met tussenpozen en digitaal elkaar genaaid in een montage (figuur 6). Deze techniek kan bruikbaar zijn voor ultrastructurele kenmerken, zoals microtubuli organisatie, over een groter gebied dan dat het een cryo-EM van.
Lage doses, lage vergroting afbeeldingen (Figuren 3C en 5) is ook nuttig bij het identificeren van gebieden van de neurieten die consistente diameter in de essen koolstoffilm zijn (zowel in de gaten en in de koolstof) en daardoor meer geschikt voor beeldvorming en de daaropvolgende analyses. Vergroting van neurieten de gaatjes van de carbon film wordt meestal gezien in grotere neurieten (figuur 5) met duidelijk meer interne materiaal dan dunnere neurites (Figuur 3C). Dit fenomeen wordt verondersteld op te treden vanwege het gebrek aan fysieke ondersteuning in de gaten van de koolstoffilm. Wanneer de EM rooster uit de schaal waarin de neuronen groeien en vervolgens geblot van het zitvlak, neurieten meer interne massa (Figuur 5) dan de andere (figuur 3C) neigen om uit te breiden en / of uitzakken in de gaten. Hoewel dit lijkt een artefact te zijn, heeft het een voordeel om duidelijker de inwendige bestanddelen van de neurieten tonen. Met behulp van een continue carbon folie bedekt op deze essen carbon film kan helpen om dit probleem in toekomstige studies te omzeilen. Deze opstelling is in eerste instantie geprobeerd maar resulteerde in glasvocht ijs te dik voor de beeldvorming. Latere onderzoeken met verschillende diktes van continue koolstof overlay op de EM rooster kan verder onderzoek nodig.
Een belanglangrijk voordeel van de huidige methode is dat de ruimtelijke organisatie van celbestanddelen binnen de neurieten op nanometerschaal kan worden gevisualiseerd door middel van een aantal 2-D afbeeldingen van een neuriet bij verschillende hellingshoeken en reconstrueren stapel afbeeldingen in een tomogram. Individuele structurele kenmerken kan vervolgens handmatig geannoteerd elke 2-D plak van de 3-D stack in verschillende kleuren met de juiste software (zie tabel van Materialen en reagentia) zoals een axon van een rat E18 dorsale wortel ganglion (DRG) neuron (Figuur 4) en een neurieten van een rat hippocampale neuron E18 (Figuur 8).
Door te kiezen opnamegereed elke 5 graden tijdens de kanteling serie, plaats 1 of 2 °, worden minder beelden verzameld maar een hogere dosis elektronen worden gebruikt per beeld. Dit resulteert in een hoger contrast en minder ruis in de RAW-afbeeldingen. Dit is beter voor de doeleinden van de wederopbouw (alignment door cross-correlatie als een st ep) en daaropvolgende tomogram annotatie, die wordt gedaan door hand elke afbeelding die het tomogram stapel in de z-richting. Het kiezen van een stapgrootte ook afhankelijk van de grootte van het monster, verschillende kantelhoeken, zal grotere exemplaren niet zoveel variëren. In dit geval, met een grotere stapgrootte (5 °) werd gedacht geschikter vanwege de relatief grote preparaatgrootte van de neurieten worden.
Bovendien is het toevoegen de vaste gouden markers om de EM rooster zou helpen voor prima beeld uitlijning indien gewenst. Markeerders werden niet gebruikt omdat het monster relatief groot in vergelijking met andere cryo-EM monsters (virussen of proteïnen afzonderlijk) en toonde een hoog contrast met een aantal structurele kenmerken die kunnen worden gebruikt voor de juiste uitlijning van elk van de 2-D beelden (omvattende het 3-D stack) door kruiscorrelatie. Het resulterende beeld stapel werd goed uitgelijnd met behulp van deze aanpak, en bruikbaar voor de volgende 3-D kleur annotatie.
ent "> Voor toekomstige studies, met behulp van een microscoop met een energie-filter kan geluid veroorzaakt door inelastisch verstrooide elektronen, maar een dergelijke functie niet onmiddellijk beschikbaar zijn op de meeste elektronenmicroscopie faciliteiten te verminderen. Onze werkwijze laat zien wat beelden kan het gevolg zijn van een standaard 200 kV microscoop zonder energie-filter, die wellicht meer algemeen beschikbaar voor de neurowetenschappen in het algemeen.De hier beschreven protocol is geoptimaliseerd voor het voorbereiden en het visualiseren van zowel rat embryonale DRG axonen en hippocampus neurites met in de handel verkrijgbare apparatuur voor cryo-EM en cryo-ET. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is dat het oplevert structurele informatie uit compleet neurieten, niet gesegmenteerd, gemalen of behandeld met verschillende chemische reagentia om hun ultrastructuur zien. We hebben aangetoond hoe cryo-ET is een bijzonder uitstekende methode voor gebruik in toekomstige ultrastructurele analyses van neuronen in een close-to-natuurlijke toestand voor de behandeling van de gevolgenneurologische ziekte op neurieten structuur.
De Electron Microscopy Data Bank toegangsnummers voor de 3-D tomograms zoals vermeld in dit document zijn de volgende: Voor de rat hippocampale neurieten zoals getoond in figuur 8 en in het hoofd video (van 8:45-9:01), de EMDB toegangsnummer is EMD-5887. Voor de rat ganglion neuriet zoals weergegeven in figuur 4 en in de belangrijkste video (vanaf 9:02-09:15), het EMDB toegangsnummer is EMD-5885.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit onderzoek is ondersteund door de NIH subsidies (PN2EY016525 en P41GM103832). SHS werd ondersteund door een beurs van de Nanobiology Interdisciplinair Graduate Training Program van de WM Keck Centrum voor Interdisciplinaire Bioscience Training van de Gulf Coast Consortia (NIH Grant No T32EB009379).
SHS ontleed, groeide en verglaasd DRG en hippocampuscellen; verzameld cryo-EM en cryo-ET gegevens van DRG en hippocampus axonen, gereconstrueerd en kleur-geannoteerde de tilt-serie. MRG ontleed en voorzien hippocampuscellen in MNR het lab. SC bijgestaan in tilt serie annotatie. SHS werd opgeleid door CW over hoe om te ontleden en te groeien neuronen. SHS, WCM en WC bedacht de experimenten. SHS bereid het manuscript met de input van andere auteurs.
Deze video is gefilmd bij het Centrum voor Cellulaire Beeldvorming en NanoAnalytics (C-CINA) van de Biozentrum van thij universiteit van Basel. C-CINA is geïntegreerd in het Departement for Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) van de ETH Zürich, gevestigd in Bazel, Zwitserland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
