Summary
Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.
Abstract
Neuriten, beide Dendriten und Axone sind neuronale zelluläre Prozesse, die die Leitung der elektrischen Impulse zwischen den Neuronen zu ermöglichen. Festlegen der Struktur von Neuriten ist entscheidend für das Verständnis, wie diese Prozesse bewegen, Materialien und Signale, die synaptische Kommunikation unterstützen. Elektronenmikroskopie (EM) wurde traditionell verwendet, um die ultrastrukturelle Merkmale in Neuriten beurteilen, jedoch kann die Exposition gegenüber organischen Lösemittel während der Dehydratisierung und Harzeinbettungsstrukturen verzerren. Ein wichtiges Ziel ist die unerfüllte Formulierung von Verfahren, die für die strukturelle Auswertungen nicht durch solche Artefakte beeinflusst ermöglichen. Hier haben wir eine detaillierte und reproduzierbare Protokoll für wachsende und Schockgefrieren ganze Neuriten von verschiedenen primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von deren Untersuchung mit Kryoelektronentomographie (Kryo-ET) eingerichtet. Diese Technik ermöglicht 3-D-Visualisierung von gefrorenen, hydratisierten Neuriten in Nanometer-Auflösung, die Erleichterung assessment ihrer morphologischen Unterschiede. Unser Protokoll liefert eine beispiellose Ansicht der Hinterwurzelganglien (DRG) Neuriten und eine Visualisierung des Hippocampus in der Nähe von Neuriten-nativen Zustand. Als solche sind diese Methoden schaffen ein Fundament für zukünftige Studien auf Neuriten der beiden normalen Neuronen und die von neurologischen Erkrankungen betroffen.
Introduction
Neuronen stellen die komplexe Schaltung für die Funktion des zentralen und peripheren Nervensystem durch die Ausarbeitung Dendriten und Axone, um Informationen, die oft recht lang, um mit nachgeschalteten Neuronen kommunizieren. Neuritenwachstum spielt eine fundamentale Rolle in der Embryonalentwicklung und neuronalen Differenzierung und Erhaltung von Neuriten kritisch unterstützt die Funktion des Nervensystems. Neuritische Prozesse verfügen kritisch in neuronalen Verletzungen und Regeneration sowie Erkrankungen des Nervensystems. Die Untersuchung der neuronalen Architektur ist entscheidend, sowohl die normalen und erkrankten Gehirn zu verstehen. Glücklicherweise gibt es physiologisch relevanten neuronalen Zellkultur-Systeme, dass komplexe und heterogene Zellstrukturen rekapitulieren kann. Auf der Grundlage der experimentellen Aufklärung der festen Plattformen effektive Visualisierung Strategien, die qualitativen und quantitativen Analysen der neuronalen Morphologie ermöglichen benötigt. Besonders nützlich wäreist eine detaillierte Methode, die eine einheitliche Plattform zur Visualisierung von Neuriten, beide Axonen und Dendriten im Nanometerbereich enthält.
Traditionelle Elektronenmikroskopie erfordert die Verwendung von organischen Lösungsmittels während der Dehydratisierung und Harzeinbettung, die Verzerrungen in den Proben von ihrem wahren Zustand induzieren kann. So die Interpretation der Ergebnisse 4,9,25 Begrenzung - Bis heute sind die meisten strukturellen Charakterisierung auf der Nanometerskala auf größere Zellen oder Geweben, die zu solchen aggressiven Chemikalien ausgesetzt sind, basiert. Darüber hinaus für die Elektronenstrahldurch, Schnitte für Organismen oder Zell Vorsprünge aufweist eine Dicke von mehr als 1 um 12 erforderlich. Schließlich, geschnitten oder gefräst Gewebe Ergebnisse in der Sammlung von diskreten Scheibe spezifischen Datensätzen, so schwerfällig die Definition des Lang Funktion von Neuriten. Selbst für Kryo-EM, in der Schnitt eine tiefgefrorenen Probe möglich ist, stellt die Methode Kompression Artifwirkt ein.
In den letzten Jahren haben die Forscher gelernt, wie Neuronen im Hippocampus direkt auf EM-Gitter und Flash-Einfrieren in flüssigem Ethan zu Neuriten mit Kryo-ET 8,10,18,23 anschließend visualisieren wachsen. Doch solche Studien entweder eine Sonderanfertigung 10,23 oder mangelnde Informationen über die Löschschritt zum Erzeugen dünn genug glasigen Eis für Routine-Visualisierung 8,18. Zum Beispiel empfiehlt eine Studie, die Verwendung von 30-40 sec für Abtupfen der EM Gitter 10, jedoch ist dieser Wert nicht für den allgemeinen Gebrauch optimiert, sondern ist spezifisch für diese maßgeschneiderte Tauchgefriergerät. Mit einer Sonderanfertigung, anstatt einen handelsüblichen 17 ein für die Aufrechterhaltung der Luftfeuchte vor stürzen Gefrieren der Probe kann eine Hürde für die weit verbreiteten Reproduzierbarkeit darstellen.
Während diese Studien haben bei der Visualisierung von Neuriten Kryo-ET bahnbrech wurde, haben wir einen Schritt weiter, um die ap erkundenbarkeit der Kryo-ET zu einer Vielzahl von neuronalen Proben (hippocampalen und dorsalen Wurzelganglienneuronen). Darüber diskutieren wir beide optimale und suboptimale Ergebnisse sowie die möglichen Artefakte, die auftreten können mit einem Kryo-ET für solche Proben.
Definieren einer detaillierten Technik für die Erhaltung und Visualisierung ganze Neuriten im Nanometerbereich in einer nahezu nativen Zustand würde die Fähigkeit für mehr Forscher zur Durchführung von ultrastrukturellen Studien zu verbessern. Zu diesem Zweck wird mit kommerziell erhältlichen Ausrüstung, um nicht fixierte, ungefärbten Neuronen vorzubereiten, zu visualisieren Neuriten beschreiben wir eine effektive und detaillierte Protokoll. Dies ist ein wichtiger erster Schritt zur Detaillierung der Ultrastruktur von gesunden Neuriten und den Grundstein für das Verständnis, was strukturelle Unterschiede im Nervensystem Modelle Krankheit vorliegen legen. Seit Kryo-ET kann nicht fixierten, ungefärbten Neuriten-Funktionen in 3-D auf der Nanometerskala zu beheben, wird das Verfahren machen es möglich, wie nieVordergrund zu neuritische Architektur 12 zu definieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zubereitung der Speisen mit EM Grids für Überzug primären Neuronen
- Überprüfen Sie die Integrität der löchrigen Kohlenstoff auf den Gold-EM-Gitter mit einem Lichtmikroskop bei einer Vergrößerung von mindestens 25X. Stellen Sie sicher, Kohlenstoff Löcher sind> 98% intakt.
- Für Beschichtung primären Neuronen, verwenden Sie einen Bunsenbrenner flamm sterilisieren EM-Gitter und gleichzeitig machen sie hydrophil. Pinzette zu holen die EM Gitter am Rand, nicht das zentrale Gitterbereich. ACHTUNG: Lassen Sie eine brenn Bunsenbrenner unbeaufsichtigt und nicht Handschuhen oder Pinzette mit Kunststoff-Komponenten während der Durchführung dieser Schritte aus:
- Vor dem Anzünden des Bunsenbrenners, stellen Sie die Luft-und Gas Anpassungen minimal offene Position.
- Zünden Sie die Bunsenbrenner mit einem Stürmer Feuerstein oder Gasfeuerzeug.
- Ändern Sie die Luft-und Gas Anpassungen, um eine kleine, blau innere Flamme in einem größeren, helleren blauen / violetten Flamme zu erreichen. Die Spitze der inneren Flamme ist der heißeste Teil der Flamme. Der Knopf unterunterhalb der Brenner stellt die Menge des Gases, das in das Brennerrohr, während das Rohr des Brenners geschwenkt werden, um die Menge an Luft, die in den Brenner anzupassen. Durch Drehen des Lufteinstellung im Uhrzeigersinn verringert die Luft (was in einer lila Flamme) und gegen den Uhrzeigersinn erhöht die Luft (was eine gelbe Flamme).
- Mit Pinzette aus Metall (keine Kunststoffteile), um die EM Netz halten, geben sie schnell durch die Flamme zweimal, mit Blick auf Kohlenstoff-Seite nach oben. Die Kohlenstoff-Seiten wird matter (weniger glänzend) sind und mit einer gräulichen Farbton als die andere Seite.
- Das Raster (Kohlenstoff-Seite nach oben) sofort in die Mitte des Glasbodenschale innerhalb von 10 cm des Bunsenbrenners gebracht übertragen. Verwenden Sie eine EM Gitter pro Schale (Abbildung 1). Verwenden Sie nur Glasboden Gerichte, die vorsterilisierten werden, dh über Gamma-Bestrahlung.
- Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um das Raster Integrität (Kohlenstoff Löcher intakt), während er weiterhin den EM Gitter im Inneren des Glas bott überprüfenom Schüssel (um eine Kontamination zu vermeiden). Bei der Anwendung jeder Stoff auf dem Gitter oder etwas, das in Kontakt mit den Neuronen kommen wird, sterile Verfahren und sterile Pipettenspitzen.
- In einer Gewebekultur Kapuze mit sterilen Verfahren gelten 250 ul des geeigneten Beschichtungssubstanz langsam und vorsichtig an die zentrale Glasfläche der Petrischale. Stellen Sie sicher, dass der geeigneten Beschichtungssubstanz umfasst die gesamte EM-Raster.
- Für hippocampale Neuronen verwenden, Poly-L-Lysin (PLL, 1 mg / ml) als Beschichtungsstoff, hergestellt wie zuvor beschrieben 19. Beachten Sie, dass 250 ul pro EM Gitter benötigt, pro Schale, so skaliert die Batch entsprechend. Für Hinterwurzelganglien (DRG) Neuronen, verwenden Sie eine gallertartige Proteinmischung von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maus-Sarkom-Zellen sezerniert (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien) als Beschichtungsstoff, bereiten Sie wie folgt. Beachten Sie, dass 250 ul pro EM Gitter benötigt, pro Schale, so skaliert die Batch entsprechend.
- Tauen Sie eine Vorratsflascheder gallertartige Proteinmischung von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maus-Sarkom-Zellen bei 4 ° C über Nacht abgesondert
- Halten Sie die kalte gallertartige Proteinmischung von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maus-Sarkom-Zellen und alle verwendet, um die Lösung zu Komponenten, dh, indem man sie auf Eis ausgeschieden wird.
- Während auf Eis, verdünnt diese gelatineartigen Protein-Mischung in Neurobasal Medium, um eine Verdünnung von 1:20 zu ergeben (dh verdünnte 500 ul des gelartigen Proteinmischung in 10 ml Neurobasalmedium).
- Teilen verdünnt gallertartige Proteingemisch in 1 ml Aliquots, und keine zusätzlichen Aliquots bei -20 ° C sofort speichern
- Bewerben 250 ul pro EM Raster, pro Gericht, wie in Abschnitt 1.4 beschrieben.
- Für hippocampale Neuronen verwenden, Poly-L-Lysin (PLL, 1 mg / ml) als Beschichtungsstoff, hergestellt wie zuvor beschrieben 19. Beachten Sie, dass 250 ul pro EM Gitter benötigt, pro Schale, so skaliert die Batch entsprechend. Für Hinterwurzelganglien (DRG) Neuronen, verwenden Sie eine gallertartige Proteinmischung von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maus-Sarkom-Zellen sezerniert (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien) als Beschichtungsstoff, bereiten Sie wie folgt. Beachten Sie, dass 250 ul pro EM Gitter benötigt, pro Schale, so skaliert die Batch entsprechend.
- Decken Sie die Petrischale mit seiner Ober-und inkubieren (entweder mit PLL zur Hippocampus-Proben, OR mit der gallertartige Proteinmischung für DRG-Proben) für 1 h bei Raumtemperatur in der Gewebekultur Kapuze.
- Aspibewerten alle PLL (für Hippocampus-Proben) oder die gallertartige Proteingemisch (DRG für Proben) von den Gerichten. Um dies zu tun, verwenden Sie das Vakuumsystem in der Gewebekultur Kapuze. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze in die Vakuumröhre angebracht. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit dem EM-Raster.
- Verwenden einen einstellbaren Luftverdrängungspipette zu 250 ul sterilem PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) sorgfältig gelten für die EM Gitter in dem mittleren Bereich jeder Glaspetrischale, so dass der EM Gitter vollständig von PBS behandelt. Dann saugen Sie den PBS aus jedem Gericht. 3x wiederholen.
- Lassen Sie die Gerichte, die mit EM-Gitter unter der Gewebekultur Haube für 15 Minuten trocknen. Achten Sie darauf, sie durch die Kontrolle unter dem Lichtmikroskop in der Gewebekulturraum vollständig trocken sind. Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen an Feuchtigkeit in der Startaufstellung. Wenn ja, sorgfältig absaugen neben dem EM-Raster, um diese zusätzliche Feuchtigkeit zu beseitigen. Die beschichtete Gitter sollte sofort für die Plattierung der Neuronen verwendet werden.
2. Vorbereitung und PlAting Primäre Neuronen auf EM-Grids
- Um primäre Neuronen ersten sezieren, trypsinize (mit 2,5% Trypsin) und verreiben, um die Platte hippocampi (oder Hinterwurzelganglien von 18 Tage alten Rattenembryonen) in einzelne Zellen zu distanzieren, wie zuvor beschrieben 19.
- Man reibt ist ein gebräuchlicher Begriff von Neurobiologen zur distanziert Klumpen von Zellen in einzelne Zellen zu beschreiben, vor allem durch die Verwendung einer Glaspipette mit einer feuerpolierten Spitze. Das Ergebnis wird durch vorsichtig und langsam Ziehen und Lösen der Zellen, oben und unten, mehrere Male (~ 30) durch die Pipette erreicht.
- Befolgen Sie die Anweisungen, wie zuvor für DRG-Dissektion und Zellisolierung 24 beschrieben, unter Hinweis auf 0,25% Trypsin (in HBSS) verwenden, um die Ratten-DRG-Neuronen isolieren, verwenden, anstatt die Enzyme vorgeschlagen (Papain, Kollagenase / Dispase), die besser geeignet sind für Maus DRG-Neuronen.
- Berechnen Sie die Anzahl der isolierten Neuronen (dh mit einer Zählkammer)und diesen Wert um das entsprechende Volumen der Zellen zu berechnen, die jedem Gericht beantragen, um eine Konzentration von 50.000 Zellen / ml pro Schale zu erreichen. Die maximale Lautstärke anzuwenden ist 250 ul. Beachten Sie, dass dies nur füllt den zentralen Glasfläche nicht die gesamte Schale.
- Geschirr für 30 Minuten in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C. Lassen Zellen sich zu erholen und zu halten.
- Langsam zu jedem Gericht hinzufügen 1,5 ml erwärmt Medien, kümmert sich nicht um die EM-Netz stören. Die Art der Medien hängt vom Zelltyp (Hippocampus-oder DRG).
- Die geeignete Medien für entweder 19 oder Hippokampus-Neuronen Hinterwurzelganglienneuronen 24, die in einem 37 ° C Wasserbad vor der Verwendung erwärmt werden. Das Geschirr über Nacht inkubieren im CO 2-Inkubator.
- Für Hippocampus-Neuronen, verändern die Medien am nächsten Tag. Ändern der Hälfte der Medien alle zwei Tage weiter für 14 Tage. Wärmen Sie die Medien in einem 37 ° C Wasserbad vor der Verwendung. Für DRG-Neuronen, dem Tag nach Dissektion / Beschichtung, eine frische Bestand an Medien mit einer anti-mitotische Mittel (Uridin und 5'-Fluoro-2'-desoxyuridin) einen 10 mM Stammlösung von jeweils getrennt, verwenden Sie eine endgültige Konzentration von 10 &mgr; M für jeden. Entfernen Sie die Hälfte des DRG-Medien (875 ul) und fügen Sie 875 ml frisches Medium mit der anti-mitotische Mittel.
- Für DRG-Neuronen, alle zwei Tage für die erste Woche, alternative verändernden Medien zwischen anti-mitotische Medien-und Standard-DRG-Medien. Für die zweite Woche, ändern Sie Standard-DRG-Medien alle zwei Tage.
3. Verglasen von Neuronen auf EM-Grids
- Bereiten Sie alle Geräte und Materialien für das Einfrieren und Lagern der Gold EM-Gitter bei tiefen Temperaturen: eine Verglasung Gerät mit einer feuchten Kammer 17, feinen Punktfach Pinzette zur Verglasung Maschine, lange flache Punkt Pinzette, Dewar (n) von flüssigem Stickstoff (LN 2) coolant Behälter, EM Grid-Storage-Box, Calcium-freier Filterpapier.
- Starten Sie die Verglasungseinrichtung. Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit bis 100% und die Temperatur auf 32 ° C. In dem Abschnitt "Console", stellen Sie die Zeit auf Null Blot Sekunden. Dies ermöglicht die manuelle Lösch durch die Seitenfenster des Feuchtekammer der Verglasung Maschine.
- Gehen Sie mit dem kalziumfreien Filterpapier mit Handschuhen, Schichtung, so dass sie drei Papiere gestapelt sind. Schneiden Sie den Stapel in 0,5 cm breite Streifen, die ~ 2 cm lang sind. Biegen sie in einem 90 ° Winkel, so daß eine Seite des Papiers eine 0,5 cm x 0,5 cm Fläche (Fig. 2). Mit einer Pinzette aus der Mitte Papier und legen Sie es auf einem anderen kalziumfreies Filterpapier bis zum Gebrauch.
- Setzen Sie den Grid-Storage-Button in der Knopfhalter in der Kammer der Verglasung. Füllen Sie den Innenraum des Kühlmittelbehälter mit flüssigem Stickstoff und warten, bis eine vollständige Verdampfung. Füllen Sie den äußeren Kammer the Kühlmittelbehälter mit flüssigem Stickstoff, bis stabile Temperatur erreicht man zum nächsten Schritt. Füllen Sie den Innenraum mit hochreinem gasförmigen Ethan, die in einen flüssigen Zustand in der gekühlten Kammer kondensiert wird.
- Bewegen Sie den Teller (es) aus dem Inkubator zu einem großen 100 mm Polystyrolschale für den Transport zum Verglasen Raum, wenn nicht in der unmittelbaren Umgebung. Mit den spezialisierten Verglasung Pinzette sorgfältig wählen Sie die EM Gitter aus der Schüssel. Beachten welche Seite die Neuronen auf der EM Gitter wächst, wird die Position für den nächsten Schritt wichtig. Verwenden Sie den schwarzen Schiebe-Sperre auf die Pinzette, um sicher zu verriegeln der Pinzette auf die EM-Raster.
- Legen Sie die Pinzette in den Verglasungs Maschine so daß die Seite des EM-Gitter, auf dem die Neuronen auf der linken Seite angeklebt Flächen weg von der Seitenlochöffnung des Verglasungs Maschine. Fahren Sie die Fach Pinzette in den Verglasungs Maschine.
- Setzen Sie den Kühlmittelbehälter in der entsprechenden InhaberVerglasung der Maschine. Es sollte mit angemessenen LN 2 und flüssigem Ethan gefüllt werden. Mit dem entsprechenden Bildschirm Kommando der Verglasung Maschine, heben Sie den Kühlmittelraum nach oben, bis es mit der Unterseite der Feuchtigkeitskammer gespült.
- Mit den flachen Pinzette Punkt, fassen einen Rand des Filterpapiers, so dass die kürzere Seite (die 0,5 cm x 0,5 cm Fläche) senkrecht zu den Pinzetten ist. Diese Fläche wird für Lösch (2B) in direkten Kontakt mit dem EM-Gitter kommen. Das Filterpapier vorsichtig in die Seitenöffnung des Feuchtekammer der Verglasung Maschine (Abbildung 2A). Stabil halten das Papier gegen die EM Gitter (der abgewandten Seite der Probe) für 10 Sekunden. Entsorgen Sie das Papier danach stürzen und sofort einfrieren die Probe in flüssigem Ethan mit der Automatisierung der Verglasung Maschine.
- Ihre tiefgefrorenen EM Netz transferieren Sie einen der Schlitze in einer derGrid-Storage-Tasten. Wiederholen Sie den Vorgang für weitere EM-Gitter in den Gerichten. Die EM Grid-Storage-Tasten in diesen Experimenten verwendet mehrere tiefgefrorenen EM-Gitter zu speichern.
4. Bildsammlung, Verarbeitung und Annotation
- Fahren Sie mit 2-D-elektronenmikroskopischen Aufnahmen und / oder 3-D-Neige Serie 5 der Neuriten mit einem Kryo-Elektronenmikroskop unter einer Niedrigdosis-Zustand zu sammeln. Die 2-D-Bilder wurden bestimmt, um die Qualität des Netzes in Bezug auf die Dicke des Eises und die möglichen Bereichen zu beurteilen nützlich für die 3-D-Tilt-Serie zu sein.
- In diesem Fall wurden alle Bilder gesammelt unter Verwendung eines 4k x 4k CCD-Kamera mit einem 200 kV-Elektronen-Mikroskop mit einem einzigen Neigungs flüssigem Stickstoff Kryo Transferhalter ausgestattet angebracht, bei 20k Mikroskopvergrößerung zu einem Zielunterfokus von 7 um und Probenahme von 4,4 Å / Pixel.
- Um ein 3D-Schnittbild der Probe zu erhalten, nehmen Sie eine Reihe von Projektionsbildern, während schrittweise Kippen der Proben alOng einer Achse des Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Angesichts der Neigungswinkel und andere experimentelle Einstellungen, gibt es verschiedene Software zur Verfügung, um automatisch die Neigung zu sammeln Serie 5. Die 3-D Kippserie hier dargestellt wurden auf die gleiche Mikroskop mit halbautomatischen Kippserie Erfassungssoftware 26 über einen Bereich von -60 ° bis 60 ° in 5 °-Schritten mit einer Gesamtdosis von ca. 60 E / A 2 gesammelt.
- Rekonstruieren Sie den Neigungs Reihe der Neuriten mit Bildverarbeitungssoftware 21, wie zuvor für andere Proben 5,29 beschrieben.
- Farbanno die 3-D-Merkmale der Neuriten durch Segmentieren des ersten Schichtbild und Erzeugen eines Oberflächenmodells unter Verwendung eines 3-D-Bildverarbeitungssoftware, wie zuvor beschrieben 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vor dem Einfrieren und Bildgebung mittels Kryo-ET, sollte leicht Mikroskopbilder der EM-Gitter, auf dem die Neuronen wachsen genommen werden. Neuriten sollten deutlich sichtbar, ohne signifikante Überlappung miteinander sein. Eine farbige Box in 3A repräsentiert einen Bereich, der vergrößerten wird, um eine höhere Vergrößerung in 3B, in der Neuriten erstrecken sich über die Gitterwerk des Gitters zu zeigen. Jedes Gitter-Platz ist einer löchrigen Kohlenstoffschicht, die die Nervenzellen und ihre Neuriten unterstützt zusammen. Diese Löcher sind in einem niedrig dosierten Kryo-EM-Bild bei 4k Vergrößerung, die das Neuron Körper eine relativ große, dunkle, elektronendichte Gegenstand (Fig. 3C), von denen Neuriten stehen nach außen zeigt, ersichtlich.
Ein Teil der Neuriten Ruhe oben ein Loch in der Kohlenstoff in einem farbigen Feld in 3C ausgewählt ist, und vergrößerten mit einer höheren Vergrößerung (20k) in 3D. Bei dieser Vergrößerung sollten klare interne Zellstrukturen einschließlich der Mikrotubuli, Vesikel und Mitochondrien klar ersichtlich (Abbildung 3D), besonders in der optimal dünnem Eis, wie nach diesem Protokoll erzeugt. Die dunklen schwarzen Strukturen in der Mitte des Bildes (Fig. 3D) hexagonal Eispartikel, die als Verunreinigungen betrachtet werden, und sollte in der Regel vermieden werden, aber da sie sehr schwach und außerhalb der Neuriten selbst sind, dass sie nicht mit der interferieren Rekonstruktion und farb Annotation von den inneren Strukturen für die Analyse und Interpretation (Abbildung 4). Ein weiteres niedrig dosierte, geringe Bildvergrßerung ist in Fig. 5 gezeigt ist, von dem ein Neurit angeordnet werden kann, wonach die verschiedenen 2-D-Bilder können aufgenommen und digital zusammen mit Bildverarbeitungssoftware, um eine Montage (Fig. 6) zu erzeugen genäht.
Die Anfangsniedrigen Beschichtungskonzentration (50.000 Zellen / ml pro Platte) von Neuronen auf den EM-Gitter ermöglicht Neuronen, die weit genug voneinander entfernt sind, um klare Visualisierung der Neuriten (3C) zu gewährleisten; Konzentrationen höher als empfohlen (> 50.000 Zellen / ml pro Platte ) in suboptimale Bilder von überfüllten Neuriten, die schwer zu verfolgen oder Attribut zellulären Komponenten (7B und 7C) sind führen.
Fig. 1 ist. Schema für wachsende Nervenzellen auf EM-Gitter im Glasboden-Gerichte. (A) Glasboden Gerichte werden gezeigt, teilweise mit Zellmedium (pink) gefüllt. (B) Jedes Gericht enthält eine Gold-EM Gitter, wie ein genauerer Blick offenbart. (C) Beschichtung der EM Netz mit Poly-Lysin wird als eine Cartoon-Seite-Cutaway gezeigt. Die Glasbodenschale ist aus einem quadratischen Deckglas, das an der Unterseite eines Kunststoffkulturschale für eine kreisförmige Öffnung, die ursprünglich aus dem Boden geschnitten wurde angebracht zusammensetzt. Diese Glasboden Gerichte sind Gamma-sterilisiert und im Handel als vorgefertigte gekauft. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Schematische für Hand Blotting von EM Gitter mit Neuronen eingehalten werden. (A) Close-up der Schiebeeingangsschlitz der Verglasung Maschine (schwarzer Pfeil), um die Feuchte-/ Löschkammer, in der Pinzette wird eingesetzt, um die Probe manuell auslöschen werden. (B)Cartoon-Schema zeigt, wie die Calcium-freier Filterpapier (0,5 cm x 0,5 cm Fläche) sollte mit der Flachpunkt Pinzette für Abtupfen der EM Gitter behandelt werden und in der Feuchtigkeitskammer der Maschine durch die Verglasung der Eingangsschlitz eingeführt, auf denen die Neuronen eingehalten werden (Tröpfchen rosa Zellmedien gezeigt). Die EM-Netz wird durch feine Punktfach Pinzette in der feuchten Kammer statt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Visualisierung gefrorenen hydratisierten Neuronen auf Gold-Elektronenmikroskopie (EM) Netze. (A) Lichtmikroskopische Aufnahme bei 10-facher Vergrößerung des zentralen Bereichs eines EM Gitter, auf dem primären Ratten-Neuronen wurden groFlügel für 2 Wochen. (B) gezoomten Ansicht des in (A) gezeigt Aqua Box, in der Neuronen und ihre Projektionen Neuriten sichtbar sind (rosa Pfeile). (C) Elektronenmikroskopische Aufnahme bei 4K Vergrößerung eines Neuriten von dem Neuron Körper (roter Pfeil) nach außen ragt. Tisch entspricht einer Fläche (dh die roten Feld) in einer der in (B) gezeigt Gitterquadrate. Blue-Box ist close-up in (D) gesehen, in denen interne Funktionen des Neuriten sind eindeutig auf 20k Vergrößerung sichtbar (grüner Pfeil Mitochondrien, orangefarbenen Pfeil Mikrotubuli; Vesikel blauer Pfeil). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
4. 3-D-Rekonstruktion und Kommentierung einer Ratte DRG Axon Tomogramm. (A) Tomographische Scheibe aus einem Stapel von Bildern rekonstruiert in unterschiedlichen Neigungswinkeln von einem DRG-Axon übernommen. (B) entsprechende 3-D-Annotation des gleichen Axon. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
5. 2-D-Kryo-EM-Bild von einer Ratte DRG-Neuron (Mitte-links) mit axonalen Fortsätze (rotes Feld) bei 4k-Vergrößerung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
6. Montage von vier 2-D-Kryo-EM-Bilder von einer einzigen Ratte DRG Axon. Jedes Bild wurde auf 20k Vergrößerung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 7. 2-D-Kryo-EM-Aufnahmen von Neuriten. (A) eine Ratten-DRG Axon abgebildet näher bei der Zellsoma. (B, C) Beispiele für Überbelegung von Neuriten aufgrund der hohen Konzentration der Beschichtung Neuronen auf EM-Gitter. Alle Neuriten waren schockgefroren zwei Wochen nach Plattierung auf Gold EM-Gitter. Alle Bilder wurden bei 20k genommen;. Vergrößerung Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 8. 3-D-Rekonstruktion und Kommentierung eines Ratten-Hippocampus Neuriten Tomogramm. (A) Tomographische Scheibe aus einem Stapel von Bildern rekonstruiert in unterschiedlichen Neigungswinkeln von einem Hippocampus-Neuriten übernommen. (B) entsprechende 3-D-Annotation des gleichen Neuriten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir zeigen, dass embryonale Rattenneuronen (Hinterwurzelganglien und Hippocampus) auf Gold-Elektronenmikroskopie (EM) Gittern gewachsen und im Glaskörper Eis dünn genug für ihre Neuriten, die abgebildet werden unter Verwendung von 2-D-Kryo-EM-und 3-D-Kryo-eingefroren werden ET. Während Hippocampus Neuriten haben zuvor mit Kryo-ET 8,10,18,23 abgebildet wurde, detailliert ein Protokoll für die erfolgreiche Replikation genug mit im Handel erhältlichen Geräte gefehlt hat. Darüber hinaus, während ihre Forschungen haben die Verwendung von Kryo-ET zum Visualisieren hippocampalen Neuriten Pionier unsere Studien wird die Anwendbarkeit der Kryo-ET, mehr als eine Art von neuronalen Probe.
Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll der Vorbereitung EM Gitter entweder mit Hippocampus-und Hinterwurzelganglien (DRG) Neuronen, Blotting sie optimal zu dünnem Eis zu erreichen, und tauchen Einfrieren sie für die Bildgebung von Kryo-ET. Optimale Blot Es ist eine, die nicht in Eis zu dick für den Elektronenstrahl zu durchdringen zur Folge hat,noch zu dünn ist, dass der Glaskörper Eis wird mit allem anderen Verlauf vom Rand der löchrigen Kohlenstoff in die innerste der löchrigen Kohlenstoff. Außerdem Erreichung optimal dünne Eis durch Verwendung einer Verglasung Maschine 17. Mai etwas anders für jedes Projekt zu sein, und robust Einfrieren mit der Verglasung Maschine erfordert eine Lernkurve.
Während frühere Forschung hat sich auf Hippocampus-Neuronen, die auch in unseren Studien erforscht hier konzentriert, haben wir weiter gegangen, um Bilder von der Nanometerskala von intakten, tiefgefrorenen ganze Axone des Hinterwurzelganglien (DRG) zeigen, noch nie mit abgebildet Kryo- EM-oder Kryo-ET. DRG-Zellen wurden ausgewählt, da sie (im Gegensatz zur Hippocampus-Neuronen) geben ausschließlich die zu 34 Axone. Ein Protokoll zur Abbildung von ihnen cryo-EM/cryo-ET hilfreich für die Interessenten zu axonalen Ultrastruktur, dh in sensorischen Neuronen abzuleiten. Wir auch anwesend und beide optimale und suboptimale Ergebnisse zu diskutieren sowieals potenzielle Artefakte, die auftreten können mit einem Kryo-ET für solche Proben.
An der richtigen Zellkonzentration (50.000 Zellen / ml pro Schale), so ist, dass Neuriten mit Hilfe von Licht-und Elektronenmikroskopie (3A und 3B) mit einem oder zwei Neuronen pro Raster-Quadrat (3B) erscheinen, ermöglichen eine hervorragende Anbindung Abstand von Neuronen . Zulassen genug Abstand zwischen den Neuronen ist für klare Visualisierung der Neuriten über Kryo-EM (3C und 3D) erforderlich. Die Neuronen und deren Neuriten auf einem löchrigen Kohlenstofffilm der Goldgitter abgestützt, wie deutlich in den Kryo-EM-Aufnahmen (Fig. 3C und 3D) gesehen. Die Neuron Körper, die von ~ 15-50 um für Hippocampus-Neuronen und Hinterwurzelganglien (DRG) 30,33 Neuronen sind zu dick für Bildgebung mittels Kryo-EM und erscheinen komplett schwarz variieren kann, wie es typisch ist für very elektronendichte Gegenstände und dicken Proben (Fig. 3C und 5) im Vergleich zu den relativ dünneren Vorsprünge von Neuriten (nicht mehr als 1 &mgr; m im Durchmesser), die strahlenförmig von ihnen.
Resin-eingebettete 3-D Hirngewebe nicht verraten Neuriten, die im Querschnitt 14 vollständig kreisförmig sind, in der Tat, ist ihre Morphologie variabel. Es ist daher nicht bekannt, ob die kreisförmige Form von Neuriten ist natürliche oder eine Probenvorbereitung Artefakt. Die gemessene Dicke der DRG Axon (Fig. 4) auf dem TEM-Gitter aufgewachsen, geblottet und abgebildet, wie in dieser Studie gezeigt wurde, war 0,32 &mgr; m in der z-Richtung (in die Tiefe des Glas Eis) und einer durchschnittlichen Breite von 0,53 &mgr; m der xy-Ebene. Die gemessene Dicke der hippocampalen Neuriten auf dem TEM-Gitter aufgewachsen (Fig. 8), geblottet und abgebildet, wie in dieser Studie gezeigt, betrug 0,50 &mgr; m in der z-Richtung (in die Tiefe des Glas Eis) und einDurchschnitt von 0,72 um in der xy-Ebene. Die Blotting-Verfahren wie hier beschrieben, könnten die Neuriten glätten, obwohl sie während des gesamten Prozesses der Blot und Sprung-Gefrierprozess hydrierten in ihrer ursprünglichen Puffer geblieben.
Die leichte Abflachung der Neuriten auf dem Gitter durch cryoET beobachtet nicht erscheint, um die Struktur der internen Bestandteile wie Vesikel beeinflussen, wie hier gezeigt, die nahezu perfekt kreisförmig und zeigen keine Anzeichen von Austrocknung. Dagegen sind die chemischen Prozesse häufig in "traditionellen" EM-Vorbereitungen, insbesondere chemische Fixierung mit Glutaraldehyd und Para gefolgt von Dehydratisierung in Ethanol, verwendet, führen zu unkontrollierten Gewebeschrumpfung. Das Potential der Begegnung solchen schädlichen zellulären Effekt wird in dem Verfahren zur cryoET präsentieren wir in unserer Handschrift eliminiert.
Darüber hinaus sind unsere Neuriten Proben wurden sofort in flüssigem Ethan stürzen gefroren, was inStant "Einbettung" in glasigen Eis. Gewebe, die in einem glasartigen Zustand eingefroren werden, erscheinen viel ähnlicher physiologischen Zustand als andere Techniken. Die Höhe der ultrastrukturellen Detail ist nicht der einzige Aspekt, der in unserem Protokoll beschriebene Technik wertvoll für Neurowissenschaften Forscher zu sein macht. Die Technik der wachsenden Neuronen auf EM-Gitter, sofort Lösch / Tauch Einfrieren sie in einem glasartigen Zustand für das Screening / Imaging von cryoET zu bewahren ist eine attraktive Methode, da es die Möglichkeit eröffnet, von der Prüfung Ultrastruktur von Neuronen unter verschiedenen genetischen, chemischen oder Umwelt betont, ohne die Sorge von möglichen Austrocknung Artefakte.
Die Blotting-Bedingungen vor dem Einfrieren in diesem Protokoll beschrieben, sind wichtig, um Eis dünn genug für die Visualisierung von Kryo-ET der ultrastrukturellen Merkmale, einschließlich der internen Komponenten wie z. B. Mitochondrien, Vesikeln und Mikrotubuli (Fig. 4, 6 zu erzeugen, 7A). Mitochondrien, könnte beispielsweise in den Vorbereitungen identifiziert werden, da sie über Kryoelektronentomographie 20 angezeigt strukturell ähnlich zu dem, was in Zellen beobachtet (die Ränder der embryonalen Maus-Fibroblasten). Sie zeigen auch Cristae, die in den 3-D-Farb kommentierten Bilder in dieser Handschrift vorhanden gesehen werden kann. Suboptimale Bilder können vom dickes Eis, in der die Kryo-EM-Bild erscheint in der Regel undurchsichtig und verhindert erfolgreiche Identifizierung von Funktionen wie Mitochondrien und Mikrotubuli in der Neuriten führen. Ein Mangel an ausreichenden Informationen für die Herstellung solcher Proben, insbesondere darüber, wie man optimal dünnem Eis zu produzieren, fast sicher zu den begrenzten Erfolg bei der Definition der Ultrastruktur von Neuriten 8,10,17,23 beigetragen.
Suboptimale Bilder können auch aus Plattierung zu viele Neuronen in der Startaufstellung führen (> 50.000 Zellen / ml pro Schale), die in der Überfüllung von Neuriten (Abbildungen führt0, 7B und 7C). Unscharfe Bilder kann ein Ergebnis von Fehl Defokussierung sein und muss angepasst werden, die Defokussierung in der hier gezeigten Bilder wurde mit einer gezielten Unterfokus von 7 um übernommen. Die Bilder wurden an diesem Defokussierung gesammelt, um einen höheren Kontrast und Sichtbarkeit der ultrastrukturelle Merkmale zu gewährleisten, allerdings könnte eine geringere Unschärfe-(dh 2-3 um) auch verwendet werden, um eine höhere Auflösung Details solcher Merkmale zu erhalten.
Andere Faktoren können zu suboptimalen Bilder beitragen. Zum Beispiel, obwohl es verlockend sein, andere Merkmale der Verglasung Maschine, insbesondere der halbautomatischen Löschfunktion nicht beschriebenen manuellen Blotting verwenden, hat dies zu unerwünschten Ergebnissen. Doppelseitige Blotting wurde anfänglich unter Verwendung dieses halbautomatische Funktion versucht, in dem die Verglasung Maschine (anstatt den Benutzer) befleckt die Probe direkt mit Parametern wie Löschzeit und der Anzahl von Flecken, wie vom Benutzer spezifiziert. Allerdings after Abbildungs solche Proben wurde festgestellt, dass alle Neuronen war offen lysiert Verschütten ihres Inhalts (multivesikulären Körpern, etc.). Daher ist die Verglasung Maschine ist am besten in diesem Fall für die temperierbaren Feuchte, in welcher die Probe vor stürzen Gefrieren geblottet verwendet. Die Aufrechterhaltung der Probe in einem solchen Zustand (mit Feuchte eingestellt nahe 100%) minimiert den Wasserverlust während der Vorbereitung und hilft, eine optimale Glaskörper Eis nach dem Einfrieren 3,7.
Im Idealfall, um die Exposition der Neuronen auf externe Störungen zu minimieren, sollten sie in einem CO 2-Inkubator (Temperatur auf 37 ° C eingestellt) in unmittelbarer Nähe zu dem Raum mit der Verglasung Maschine, und die Temperatur für diese Vorrichtung angebaut werden sollten eingestellt werden 37 ° C vor dem Schockgefrieren die Neuronen auf den EM-Gitter. Man sollte vermeiden, dass Nervenzellen zu großen Temperaturschwankungen vor dem Blotten. In diesem Bericht wurde die Temperatur auf 32 ° C eingestelltfür Löschzwecke; Neuronen wurden in ein anderes Gebäude angebaut und zwischen die Platten von Neuronen Durchführung von einem Raum zum anderen eine Zeitspanne von ca. 10 Minuten aufgetreten. Es wurde darauf geachtet, die Proben in einem wasserfesten, semi-isolierte Behälter während des Transportprozesses zu schützen. Eine ähnliche Veränderung in der Temperatur und CO 2-Konzentration (wie durch die Neuronen vor dem Blotten / Tauchgefrieren erfahren), um den Neuronen auftreten jeden ~ 2 Tage, wenn die Nervenzellen aus der Inkubationskammer genommen für die Medien, um unter der biologischen Sicherheit geändert werden Haube, wie sie typischerweise für die neuronalen Kulturen erfolgt. Dies ist nicht auf toxische Effekte auf die Zelle führen gesehen.
In Bezug auf die Anwesenheit von scheinbar elektronendichte Granula werden innerhalb der Neuriten 'Mitochondrien, gibt es mehrere widersprüchliche Berichte. Solche Granalien werden in einer Vielzahl von unterschiedlichen Geweben, die nicht speziell neuronale Zellen. Sie werden als Senke von Kationen, die die interne Ionen regulieren wahrgenommen enUmfeld des Mitochondrium. Sie erscheinen auch Kontaktstellen zwischen inneren und äußeren mitochondrialen Membranen, in denen Enzyme effizient funktionieren 16 erstellen.
Experimentelle Studien zeigen, dass Kalzium und anderen zweiwertigen Kationen reichern sich in den Mitochondrien, wenn diese Ionen in der Flüssigkeit Bade entweder isolierten Mitochondrien oder intakten Zellen vorhanden sind. Es scheint wahrscheinlich, dass die Ionen organisch an die bereits bestehenden inner mitochondrialen Granulat gebunden. Es wird vorgeschlagen, daher, dass diese Granulate sind für die Regulierung der internen ionischen Umgebung des Mitochondrium 31 verbunden.
Weiterhin wurden die Neuronen im Zubereitung auf kultivierten EM-Gitter für 14 Tage, das Timing von denen typische Zwecken Neuritenwachstum 15,36, vor der Bilderzeugung durch Kryo-EM / ET. Es wurde berichtet, dass es einen dramatischen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration im Alter von Neuronen im Vergleich zu youn 32 g Neuronen. Daher ist es plausibel, dass die Mitochondrien in den Neuriten dieser Gruppe Neuronen wäre mitochondrialen Granulat nicht notwendigerweise als ein Anzeichen von Stress, sondern anzeigen, da sie eine höhere Gegenwart von intrazellulärem Calcium besitzen.
Elektronendichte mitochondrialen Granulat auch in embryonalen Maus-Fibroblasten in Kultur gezüchtet und mittels der gleichen Technologie (Kryoelektronentomographie), wie in unserer Handschrift 20 verwendet abgebildet gemeldet. Diese Zellen nicht typische Muster der ultrastrukturellen Veränderungen mit Zellschädigung verbunden sind, wie Zytoskelett-Störung und Vakuolisierung des Zytoplasma zu zeigen. Ebenso in unserem Neuriten durch cryoET visualisiert, haben wir nicht beobachten, eine gestörte Zellskeletts, die sonst mit Zelltoxizität in Verbindung gebracht werden würde. Angesichts der obigen Überlegungen schließen wir, dass die Neuronen in unserer Vorbereitung haben mitochondrialen Granulat als Folge von Stress oder Toxizität nicht angezeigt.
Inhalt "> Um die EM Gitteroberfläche zu sterilisieren, um eine Kontamination mit den Neuronen zu verhindern, und auch, um eine günstige, hydrophile Oberfläche auf dem EM Gitter zu dem der Poly-L-Lysin zu erzeugen anhaften könnte, Beflammung der EM-Gitter vor dem Beschichten Neuronen gefunden vorteilhaft. UV Sterilisation nicht gewählt wurde, da es erfordert die Bestrahlung des Gitters für eine längere Zeit (z. B. 20-30 Minuten) in der biologischen Sicherheit Haube. Dann müssten die Gitter wieder an die Umgebung wieder freigelegt werden, wenn sie leuchten entladen zu Zwecken der Hydrophilieren des Rasters Oberfläche. Glow-Entladung des Grid sorgt dafür, dass der nachfolgende Poly-Lysin-Beschichtung würde effektiv "Stick" an das Netz. Die Technik der Beflammung der Gitter ist vorteilhaft, da sie sowohl die Hydrophilierungsstufe und Sterilisationsschritt vereint in einem. primären Neuronen bekannt sind empfindlicher als Tumor-Zelllinien auf der Basis, und es ist wichtig, ihre Umgebung (Gitter, Petrischale) steril zu halten.(Fig. 3C und 5), die mehr von der Gitterfläche zum Zwecke des Auswählens umfasst das Neuriten zu Bild . Dann kann 2-D-Kryo-EM-Bilder in Intervallen genommen und digital zusammen in einer Montage vernäht (Fig. 6). Diese Technik kann für die ultrastrukturelle Merkmale, wie Mikrotubuli Organisation sein, über eine größere Fläche als der einer einzelnen Bild-Kryo-EM.
Unter Niedrigdosis-, Low-Vergrößerung Bilder (3C und 5) ist auch bei der Identifizierung von Bereichen der Neuriten, die im Einklang mit einem Durchmesser über den löchrigen Kohlenstoff-Film sind (beide in die Löcher und über den Kohlenstoff) und damit mehr ideal für die Abbildung nützlich und anschließende Analysen. Vergrößerung der Neuriten über Löcher des Kohlenstofffilms wird typischerweise in größeren neur geseheniten (Abbildung 5) mit deutlich mehr interne Material als dünner Neuriten (3C). Dieses Phänomen wird angenommen, dass aufgrund des Fehlens der körperlichen Träger in den Löchern der Kohlenstoffschicht auftreten. Wenn die EM-Gitter wird von der Schale in dem die Neuronen wurden wachsende entfernt, und anschließend von der Rückseite geblottet Neuriten mit mehreren internen Masse (5) als andere (3C) dazu neigen, in die Öffnungen zu erweitern und / oder die Nachgiebigkeit. Obwohl es sich um ein Artefakt sein, hat es einen Vorteil, da die internen Bestandteile der Neuriten deutlicher zu zeigen. Mit einer kontinuierlichen Kohlenstoff-Film auf dieser löchrigen Kohlenstofffilm überlagert kann helfen, dieses Problem in zukünftigen Studien zu umgehen. Dieses Setup wurde zunächst versucht, aber führte zu glasigen Eis zu dick für die Bildgebung. Nachfolgende Studien mit unterschiedlichen Dicken der kontinuierlichen Kohlenstoff auf der EM-Gitter überlagert müssen weitere Untersuchungen.
Ein wichtige Nutzen der aktuellen Methode ist, dass die räumliche Organisation der Zellkomponenten innerhalb der Neuriten können im Nanometerbereich, indem mehrere 2-D-Bilder einer einzelnen Neuriten bei verschiedenen Neigungswinkeln, und Rekonstruieren dieses Stapels von Bildern in ein Schichtbild visualisiert werden. Einzelnen Strukturmerkmale kann dann manuell für jedes 2-D-Scheibe des 3-D-Stapel in unterschiedlichen Farben unter Verwendung der entsprechenden Software (siehe Tabelle von Materialien und Reagenzien) anno für ein Axon einer Ratte E18 dorsalen Wurzelganglien (DRG) dargestellt werden Neuron (Fig. 4) und eine Neuriten einer Ratte E18 Hippocampus (Fig. 8).
Mit der Wahl, um ein Bild alle 5 Grad während des Neigungs Serie zu nehmen, anstatt 1 oder 2 ° sind weniger Bilder gesammelt, sondern eine höhere Elektronendosis pro Bild verwendet werden. Dies führt zu höheren Kontrast und weniger Lärm in den RAW-Bilder. Dies ist besser für die Zwecke der Rekonstruktion (Ausrichtung durch Kreuzkorrelation als einer st ep) und anschließende Tomogramm Anmerkung, die von Hand für jedes Bild, die das Tomogramm Stapel in der z-Richtung durchgeführt wird. Auswahl einer Schrittweite auch von der Größe der Probe, zwischen verschiedenen Neigungswinkeln, werden größere Proben nicht so viel variieren. In diesem Fall mit einer größeren Schrittweite (5 °) wurde angenommen, dass mehr aufgrund der relativ großen Probengröße des Neuriten geeignet.
Außerdem Zugabe Bezugsgoldmarker in den EM-Netz wäre für feine Bildausrichtung helfen, falls gewünscht. Bezugsmarkierungen wurden nicht verwendet, da die Probe relativ groß im Vergleich zu anderen Kryo-EM Proben (Viren oder Proteine isoliert) und zeigte einen hohen Kontrast mit einer Vielzahl von strukturellen Merkmalen, die für die richtige Ausrichtung jeder der 2-D-Bilder verwendet werden könnten, (bestehend aus dem 3-D-Stapel) durch Kreuzkorrelation. Das resultierende Bild Stapel wurde gut ausgerichtet mit diesem Ansatz, und nutzbar für die anschließende 3-D-Farb Anmerkung.
ent "> Für zukünftige Studien mit einem Mikroskop mit einem Energiefilter können Geräusche von unelastisch gestreuten Elektronen aber eine solche Funktion nicht ohne weiteres zur Verfügung stehen höchstens Elektronenmikroskopie Einrichtungen zu reduzieren. Unser Verfahren offenbart, was Bilder können von einem Standard-200-kV-Mikroskop führen ohne Energiefilter, der mehr allgemein verfügbar auf die Neurowissenschaften Gemeinschaft zu groß sein kann.Das hier beschriebene Protokoll ist für die Vorbereitung und die Visualisierung sowohl embryonalen Ratten DRG Axonen und Hippocampus Neuriten mit im Handel erhältlichen Geräte für Kryo-EM-und Kryo-ET optimiert. Einer der Hauptvorteile dieses Verfahrens ist, daß es liefert strukturelle Informationen aus Voll Neuriten, nicht geschnitten, gefräst oder um deren Ultrastruktur anzeigen, indem verschiedene chemische Reagenzien behandelt. Wir haben gezeigt, wie Kryo-ET ist eine besonders hervorragende Methode für zukünftige ultrastrukturelle Analysen von Neuronen in einem nahe-zu-nativen Zustand für die Prüfung der Auswirkungenvon neurologischen Krankheit auf Neuriten-Struktur.
Die Elektronenmikroskopie Data Bank-Zugangsnummern für die 3-D Schnittbilder, wie in dieser Veröffentlichung sind wie folgt: Für die Ratten-Hippocampus von Neuriten, wie in Fig. 8 und in dem Haupt-Video (von 8.45 Uhr bis 9.01 Uhr), die gezeigt EMDB Zugangsnummer ist EMD-5887. Für die Ratte Dorsalwurzelganglion Neuriten, wie in Fig. 4 und in dem Haupt-Video (von 9.02 Uhr bis 09.15 Uhr) gezeigt, ist die EMDB Akzessionsnummer EMD-5885.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von den NIH Zuschüsse (PN2EY016525 und P41GM103832) unterstützt. SHS wurde von einem Stipendium der Nanobiologie interdisziplinäre Graduate Training Program des WM Keck Zentrum für interdisziplinäre Bioscience Ausbildung von der Golfküste Konsortien (NIH Grant No T32EB009379) unterstützt.
SHS seziert, wuchs und Stein DRG und Hippocampus-Zellen; gesammelt Kryo-EM-und Kryo-ET Daten der DRG und Hippocampus Axone, rekonstruiert und Farb kommentierte den Neigungs Serie. MRG seziert und bereitgestellt Hippocampus-Zellen in MNR Labor. SC in Kippserie Annotation unterstützt. SHS wurde von CW auf, wie man zu sezieren und zu wachsen Neuronen trainiert. SHS, WCM und WC konzipiert die Experimente. SHS bereit, das Manuskript mit dem Input von anderen Autoren.
Dieses Video wurde am Center for Cellular Imaging und Nanoanalytik (C-CINA) des Biozentrum t gefilmter Universität Basel. C-CINA in der Abteilung für Biosysteme (D-BSSE) der ETH Zürich, in Basel, in der Schweiz integriert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
