Summary
כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.
Abstract
Neurites, גם דנדריטים ואקסונים, הם תהליכים תאיים עצביים המאפשרים ההולכה של דחפים חשמליים בין תאי עצב. הגדרת המבנה של neurites היא קריטית להבנה כיצד תהליכים אלה להעביר חומרים ואותות שתומכים בתקשורת הסינפטי. במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) כבר משמש באופן מסורתי כדי להעריך את תכונות ultrastructural בתוך neurites, עם זאת, החשיפה לממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף יכולה לעוות מבנים. מטרה שלא סופקו חשובה היא גיבוש נהלים המאפשרים להערכות מבניות אינם מושפעות מממצאים כאלה. הנה, הקמנו פרוטוקול מפורט ולשעתק לגידול וneurites כל הקפאה-הבזק של נוירונים עיקרי שונה ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבדיקה שלהם עם טומוגרפיה האלקטרונים cryo-(cryo-ET). טכניקה זו מאפשרת להדמיה 3-D של neurites הקפואה, התייבשות ברזולוציה ננומטר, בהנחיית assessment של ההבדלים מורפולוגיים שלהם. הפרוטוקול שלנו מניב תצוגה חסרת תקדים של הגנגליון הגבי שורש neurites (DRG), ויזואליזציה של neurites בהיפוקמפוס במדינה הקרובה למולדתם. ככזה, שיטות אלה ליצור בסיס למחקרים עתידיים בneurites של שני נוירונים נורמלים ואלה מושפעים מהפרעות נוירולוגיות.
Introduction
נוירונים להקים חיוני מעגלים המורכבים לתפקוד של מערכת העצבים המרכזית ואת הפריפריה על ידי לפרט דנדריטים לקבל מידע ואקסונים, לעתים קרובות די ארוך, כדי לתקשר עם הנוירונים במורד הזרם. התוצאה neurite ממלאת תפקיד מהותי במהלך התפתחות עוברית והתמיינות ותחזוקה של neurites עצביות תומכת באופן ביקורתי את התפקוד של מערכת העצבים. תהליכים מדלקת עצבים גם תכונה קריטית בפגיעה עצבית והתחדשות, כמו גם הפרעות במערכת עצבים. לימודי אדריכלות עצבית הוא חיוניים כדי להבין הן את המוח הבריא והחולה. למרבה המזל, מערכות תרבית תאים עצביות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית קיימות שיכול לשחזר מבנים תאיים מורכבים והטרוגנית. בהתבסס על הבהרה של פלטפורמות ניסיוניות מוצקות, אסטרטגיות יעילות להדמיה המאפשרות ניתוחים איכותיים וכמותית של מורפולוגיה עצבית יש צורך. שימושי במיוחד הייתלהיות מתודולוגיה מפורטת המספקת פלטפורמה אחידה המאפשרת הדמית neurites, שני אקסונים ודנדריטים בקנה המידה ננומטרי.
במיקרוסקופ אלקטרונים מסורתי דורש שימוש בממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף, אשר יכולה לגרום לעיוותים בדגימות ממצבם האמיתי. עד כה, רוב האפיונים מבניים בקנה המידה ננומטרי מבוססים על תאים גדולים יותר או רקמות שנחשפים לכימיקלים קשים כגון - ובכך להגביל את הפרשנות של הממצאים 4,9,25. יתר על כן, לחדירת קרן אלקטרונים, חתך נדרש לאורגניזמים או בליטות סלולריות מציגים עובי גדול מ 1 מיקרומטר 12. לבסוף, מחולק או הסתובב תוצאות רקמות באוסף של ערכות נתונים פרוסה ספציפית בדידות, מה שהופך מסורבלת להגדרת התכונה המוארכת של neurites. אפילו לcryo-EM, שבו חתך דגימה קפוא התייבשות הוא אפשרי, השיטה מציגה artif דחיסהפועל 1.
בשנים האחרונות, חוקרים למדו איך לגדל תאי עצב בהיפוקמפוס ישירות על רשתות EM ו באתאן הנוזלי כדי לחזות בהמשך neurites באמצעות cryo-ET 8,10,18,23 הקפאת הבזק. עם זאת, מחקרים כאלה או להשתמש בהתקן מותאם אישית 10,23, או פרטי חוסר בצעד הסופג ליצירת קרח זגוגי מספיק דק להדמיה שגרתית 8,18. לדוגמא, מחקר אחד ממליץ על השימוש של 30-40 שניות לסופגים רשת EM 10, עם זאת, ערך זה הוא מותאם לא לשימוש כללי, אלא הוא ספציפי לאותו מכשיר ההקפאה לצלול בהזמנה אישית. שימוש במכשיר בהזמנה אישית ולא אחד 17 זמינים מסחרי לשמירה על לחות לפני מדגם ההקפאה לצלול יכול להוות מכשול לשחזור נרחב.
בעוד שמחקרים אלה היו פורץ באופן חזותי neurites ידי cryo-ET, נקטנו צעד נוסף כדי לחקור את applicability של cryo-ET למגוון רחב של דגימות עצביות (נוירונים בהיפוקמפוס וגנגליון השורש הגבי). בנוסף, אנו דנים בשתי תוצאות אופטימליות והכי מוצלחות, כמו גם חפצים הפוטנציאליים שאפשר להיתקל באמצעות cryo-ET לדגימות מסוג זה.
הגדרת טכניקה מפורטת לשימור באופן חזותי כל neurites בקנה המידה ננומטרי במצב כמעט טבעי היה לשפר את היכולת ליותר חוקרים לבצע מחקרי ultrastructural. לשם כך, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ומפורט תוך שימוש בציוד זמין מסחרי כדי להכין נוירונים מבולבל, בלא כתם לדמיין neurites. זהו צעד ראשון חשוב לקראת המפרט את ultrastructure של neurites בריאה וכדי להניח את היסודות להבנה מה הבדלים מבניים קיימים בדגמי מחלה של מערכת עצבים. מאז cryo-ET יכול לפתור את תכונות neurite מבולבל, בלא כתם ב 3-D בקנה המידה ננומטרי, השיטה תגרום אפשרי כפי שמעולם לא יהיה זהביטוי להגדרת ארכיטקטורה מדלקת עצבים 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מאכלים עם EM רשתות עבור נוירונים העיקרי ציפוי
- בדוק את התקינות של פחמן מחורר על רשתות EM הזהב באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של לפחות 25X. לעשות חורי פחמן בטוחים> 98% בשלמותה.
- לציפוי נוירונים עיקרי, השתמש במבער בונזן להבה לעקר רשתות EM ובמקביל להבהיר להם הידרופילי. להשתמש בפינצטה כדי להרים את רשת EM על ידי הקצה שלה, לא את אזור gridded המרכזי. זהירות: לעולם אל תשאיר את מבער בונזן מואר ללא השגחה, ולא להשתמש בכפפות או פינצטה עם רכיבי פלסטיק בעת ביצוע הפעולות הבאים:
- לפני שהדלקתי את המבער בונזן, הגדר את התאמות האוויר וגז למיקום מינימאלי פתוח.
- להדליק את המבער בונזן באמצעות צור חלוץ או מצית.
- שנה את התאמות האוויר וגז כדי להשיג אש קטנה, כחולה פנימית בתוך להבה גבוהה יותר, קלה יותר כחול / סגולה. קצה הלהבה הפנימית הוא החלק החם ביותר של הלהבה. הידית מתחתNeath צורב מתאים את כמות הגז שנכנס לצינור צורב, ואילו החבית של המבער ניתן להפעיל כדי להתאים את כמות האוויר שנכנס למבער. הפיכת כיוון השעון התאמת האוויר מקטינה את האוויר (וכתוצאה מלהבה סגולה) ונגד כיוון שעון מגביר את האוויר (וכתוצאה מלהבה צהובה).
- באמצעות פינצטה מתכת (ללא חלקי פלסטיק) כדי להחזיק את רשת EM, להעביר אותו במהירות דרך הלהבה פעמיים, מול פחמן בצד למעלה. צד פחמן יופיע יותר מט (פחות מבריק) ועם יותר מגוון אפרפר יותר מהצד השני.
- מייד להעביר את הרשת (פחמן בצד למעלה) למרכז צלחת הזכוכית תחתונה ממוקמת בתוך 10 סנטימטר של המבער בונזן. השתמש ברשת EM אחד לכל צלחת (איור 1). להשתמש רק בזכוכית התחתונה מנות הpresterilized, כלומר באמצעות גמא הקרנה.
- השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבדוק את תקינות הרשת (חורי פחמן ללא פגע) תוך שמירת רשת EM בתוך זכוכית בוטהמנה om (כדי למנוע זיהום). כאשר פונה לכל חומר על הרשת או כל דבר שבאות במגע עם תאי העצב, השתמש בהליך סטרילי וטיפים פיפטה סטרילית.
- במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות הליך סטרילי, להחיל 250 μl של חומר הציפוי המתאים לאט ובזהירות לאזור הזכוכית המרכזי של צלחת פטרי. ודא שחומר הציפוי המתאים מכסה את כל רשת EM.
- לנוירונים בהיפוקמפוס, השתמש פולי-L-ליזין (PLL, 1 מ"ג / מיליליטר) כחומר הציפוי, שהוכן כמתואר 19 בעבר. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם. לגנגליון שורש הגבי נוירונים (DRG), להשתמש בתערובת חלבון דביקה המופרש על ידי Engelbreth-Holm-הנחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר (ראה טבלה של חומרים וריאגנטים) כחומר ציפוי, להכין באופן הבא. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם.
- להפשיר בקבוק המניהשל תערובת החלבונים הדביקה מופרש על ידי Engelbreth-Holm-נחיל תאי סרקומה עכבר (EHS) הלילה ב 4 ° C.
- שמור על קור תערובת חלבונים הדביקה מופרש על ידי Engelbreth-Holm-נחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר, ואת כל הרכיבים המשמשים לייצור הפתרון, כלומר על ידי שמירה על אותם על קרח.
- בעוד על קרח, לדלל תערובת חלבונים הדביקה הזה במדיום Neurobasal להניב דילול 01:20 (כלומר לדלל 500 μl של תערובת החלבונים הדביקה ל10 מיליליטר של Neurobasal).
- פער בדילול תערובת חלבונים דביק לתוך 1 מיליליטר aliquots, ולאחסן באופן מיידי כל aliquots נוספים ב -20 ° C.
- החל 250 μl לרשת EM, לכל צלחת, כפי שתואר בסעיף 1.4.
- לנוירונים בהיפוקמפוס, השתמש פולי-L-ליזין (PLL, 1 מ"ג / מיליליטר) כחומר הציפוי, שהוכן כמתואר 19 בעבר. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם. לגנגליון שורש הגבי נוירונים (DRG), להשתמש בתערובת חלבון דביקה המופרש על ידי Engelbreth-Holm-הנחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר (ראה טבלה של חומרים וריאגנטים) כחומר ציפוי, להכין באופן הבא. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם.
- מכסה את צלחת פטרי עם הראש שלה ודגירה (או עם PLL לדגימות בהיפוקמפוס, או עם תערובת החלבונים הדביקה לדגימות DRG) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר במכסת המנוע בתרבית הרקמה.
- ASPIלדרג כל PLL (עבור דגימות בהיפוקמפוס) או תערובת הדביקה החלבון (לדגימות DRG) מהכלים. כדי לעשות זאת, השתמש במערכת הוואקום במכסת המנוע בתרבית הרקמה. השתמש בקצה פיפטה סטרילית המצורף לצינור הוואקום. להימנע ממגע ישיר עם רשת EM.
- השתמש פיפטה אוויר העקירה מתכווננת ליישם בזהירות 250 μl של PBS סטרילי (פוספט שנאגרו מלוח) לרשת EM באזור הזכוכית המרכזית של כל צלחת פטרי, כך שרשת EM מכוסה באופן מלא על ידי PBS. ואז, לשאוב את PBS מכל מנה. חזור 3x.
- לאפשר המנות עם רשתות EM לייבוש מתחת למכסת המנוע בתרבית הרקמה במשך 15 דקות. לוודא שהם יבשים לחלוטין על ידי בדיקה מתחת למיקרוסקופ האור בחדר בתרבית הרקמה. ודא שאין בועות של לחות ברשת. אם כן, בזהירות לשאוב הבא לרשת EM לחסל לחות נוספת זה. יש להשתמש ברשת המצופה באופן מיידי לציפוי תאי העצב.
2. הכנה וPlating ראשי נוירונים בEM רשתות
- לצלחת נוירונים עיקרי, לנתח ראשון, trypsinize (באמצעות טריפסין 2.5%) וtriturate לנתק hippocampi (או גנגליון השורש הגבי של עוברי עכברים ישנים 18 יום) לתאים בודדים, כמתואר 19 בעבר.
- Triturate היא מונח נפוץ בשימוש על ידי neurobiologists לתאר גושים מתנערים של תאים לתוך תאים בודדים, בעיקר על ידי שימוש בפיפטה זכוכית עם קצה אש מלוטשת. התוצאה מושגת על ידי ציור בזהירות ובאיטיות ומשחרר את התאים, מעלה ומטה, מספר רב של פעמים (~ 30V) באמצעות פיפטה.
- בצע את ההליכים כפי שתוארו לעיל לנתיחה DRG ותא בידוד 24, בשים לב לשימוש טריפסין 0.25% (בHBSS) כדי לבודד את הנוירונים DRG חולדה, ולא להשתמש באנזימים הציעו (פפאין, collagenase / dispase) שמתאימים יותר לעכבר נוירונים DRG.
- לחשב את מספר תאי העצב הבודד (כלומר באמצעות hemocytometer)ולהשתמש בערך זה כדי לחשב את הנפח המתאים של תאים שיחולו על כל מנה כדי להשיג ריכוז של 50,000 תאים / מ"ל לכל צלחת. הנפח המרבי ליישם הוא 250 μl. שים לב שזה רק ממלא את האזור המרכזי הזכוכית, לא את כל המנה.
- דגירה את הכלים ל30 דקות בCO 2 באינקובטור ב 37 ° C. לאפשר לתאים להתאושש ולדבוק.
- לאט לאט להוסיף 1.5 מיליליטר של תקשורת חיממה לכל מנה, נזהר שלא להפריע לרשת EM. הסוג של מדיה תלוי בסוג התא (בהיפוקמפוס או DRG).
- הכן את המדיה המתאימה לאף אחד מתאי עצב בהיפוקמפוס 19 או נוירונים גנגליון השורש הגבי 24, אשר שחמם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. דגירה צלחות הלילה בחממת CO 2.
- לנוירונים בהיפוקמפוס, לשנות את התקשורת ביום שלמחרת. שינוי מחצית התקשורת בכל יומיים ואילך ל14 ימים. לחמם את התקשורת באמבט המים C ° 37 לפני השימוש. לנוירונים DRG, ביום שלמחרת לנתיחה / ציפוי, להכין מלאי חדש של תקשורת עם סוכן אנטי mitotic (uridine ו5'-Fluoro-2'-deoxyuridine) להפוך את פתרון מניות 10 מ"מ של כל אחד, בנפרד; להשתמש סופי ריכוז של 10 מיקרומטר לכל אחד. הסר מחצית תקשורת DRG (875 μl) ולהוסיף 875 μl של תקשורת טרי עם הסוכן אנטי mitotic.
- לנוירונים DRG, כל יומיים בשבוע הראשון, חלופי שינוי תקשורת בין כלי תקשורת אנטי mitotic ותקשורת DRG הסטנדרטי. בשבוע השני, לשנות את תקשורת DRG סטנדרטית בכל יומיים.
3. Vitrifying נוירונים בEM רשתות
- הכן את הציוד ואת כל החומרים להקפאה ואחסון רשתות EM זהב בטמפרטורת קירור: מכשיר vitrification עם תא לחות 17, פינצטה מיוחדת עדין נקודה למכונת vitrification, פינצטה נקודה ארוכה שטוחה, דיואר (ים) של חנקן נוזלי (LN 2), גמיכל oolant, תיבת אחסון רשת EM, נייר סינון ללא סידן.
- הפעל את מכשיר vitrification. הגדר את הלחות ל100% וטמפרטורה ל32 ° C. בסעיף "המסוף", הגדר את זמן כתם לאפס שניות. זה מאפשר למדריך לסופג דרך צד החלון של תא הלחות של המכונה vitrification.
- ידית נייר סינון ללא סידן עם כפפות, שכבותיהם כך ששלושה עיתונים נערמים. חותכים את הערימה לרצועות רחבה 0.5 סנטימטר כי הם ~ עוד 2 סנטימטר. לכופף אותם בזווית של ° 90 כך שצד אחד של הנייר יש 0.5 סנטימטר x 0.5 פנים סנטימטר (איור 2). בעזרת פינצטה, להסיר את הנייר באמצע ומניח אותו על נייר סינון ללא סידן נוסף עד לשימוש.
- שים את כפתור אחסון רשת בבעל הכפתור בתוך תא התהליכים. למלא את התא הפנימי של מיכל נוזל הקירור עם חנקן נוזלי ולחכות עד אידוי מוחלט. למלא את התא החיצוני של המיכל נוזל קירור דואר עם חנקן נוזלי עד שהוא משיג טמפרטורה יציבה שלימשיך לשלב הבא. למלא את התא הפנימי עם אתאן גזי טוהר גבוה שיהיה לדחוס למצב נוזלי בתוך התא מקורר.
- הזז את הצלחת (es) מהחממה לצלחת קלקר 100 מ"מ גדול להובלה לחדר vitrification, אם לא בסביבה הקרובה. השתמש בפינצטה vitrification מיוחדת כדי לבחור את רשת EM זהירות מהצלחת. שים לב באיזה צד נוירונים גדלים על רשת EM; העמדה משנה לשלב הבא. השתמש בנעילה הזזה השחורה בפינצטה כדי לנעול מאובטח פינצטה על רשת EM.
- הכנס את פינצטה לתוך מכונה vitrification צד שכזו של רשת EM שבנוירונים הם דבקו פרצופים לשמאל, הרחק מהחור בצד הפתיחה של המכונה vitrification. לחזור בי פינצטה מיוחדת למכונה vitrification.
- מניחים את מיכל נוזל הקירור בבעל המתאיםשל המכונה vitrification. יש למלא אותו עם LN נאות 2 ואתאן הנוזלי. באמצעות פקודת המסך המתאימה של המכונה vitrification, להעלות את תא נוזל הקירור כלפי מעלה עד שהוא הסמיק עם החלק התחתון של תא הלחות.
- עם פינצטה הנקודה שטוחה, לתפוס קצה אחד של נייר הסינון כך שהצד הקצר יותר (0.5 סנטימטר 0.5 x הפנים סנטימטר) הוא בניצב לפינצטה. פניה זו באה במגע ישיר עם רשת EM לסופג (איור 2). בזהירות להכניס את נייר הסינון לצד החור של תא הלחות של המכונה vitrification (איור 2 א). יציבות תצמיד את נייר רשת EM (הצד הפונה הרחק מהדגימה) ל10 שניות. מחק את הנייר אחר כך ומייד לצלול להקפיא את הדגימה באתאן הנוזלי באמצעות האוטומציה של המכונה vitrification.
- להעביר רשת EM-התייבשות הקפואה שלך בזהירות לאחד החריצים באחדכפתורי אחסון רשת. חזור על התהליך עבור רשתות EM נוספות במנות. כפתורי אחסון רשת EM משמשים בניסויים אלה יכולים לאחסן רשתות EM מרובות התייבשות קפוא.
4. אוסף תמונה, עיבוד, וביאור
- להמשיך לאסוף micrographs אלקטרונים 2-D ו / או סדרה להטות 3-D של 5 neurites באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-בתנאי במינון נמוך. תמונות 2-D נועדו להעריך את האיכות של הרשת במונחים של עובי קרח והתחומים האפשריים להיות שימושי סדרה להטות 3-D ל.
- במקרה זה, את כל התמונות נאספו באמצעות מצלמת CCD 4k x 4k המצורפת למיקרוסקופ אלקטרונים 200 קילו וולט מצויד בבעל העברת cryo להטות חנקן הנוזלי יחיד, בהגדלה מיקרוסקופ 20k ביעד underfocus של 7 מיקרומטר ודגימה של 4.4 A / פיקסל.
- כדי להשיג tomogram 3D של המדגם, לנקוט בשורה של תמונות הקרנה תוך הטיית אל המדגם באופן הדרגתיאונג ציר מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) אחד. בהתחשב בזוויות ההטיה והגדרות ניסיוניות אחרות, יש כמה תוכנות שונות זמינות כדי לאסוף את הסדרה להטות 5 באופן אוטומטי. הסדרה להטות 3-D מוצגת כאן נאספו באותו מיקרוסקופ באמצעות תוכנת רכישת סדרה להטות חצי אוטומטית-26 על פני טווח של -60 ° 60 ° ב 5 ° מרווחים עם מינון מצטבר של ~ 60 דואר / 2.
- לשחזר את סדרת ההטיה של neurites באמצעות תוכנת עיבוד תמונה 21 כפי שתוארה קודם לכן לדוגמאות אחרות 5,29.
- צבע תסמן את תכונות 3-D של neurites ידי פילוח הראשון tomogram ויצירת מודל פני השטח באמצעות תוכנת עיבוד תמונה 3-D כפי שתואר בעבר 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני הקפאה והדמיה באמצעות cryo-ET, יש לנקוט בתמונות מיקרוסקופ אור של רשת EM שבו נוירונים גדלים. Neurites צריכה להיות לעין בלי חפיפה משמעותית אחד עם השני. קופסא צבעונית באיור 3A מייצגת אזור זה זנק ב להראות בהגדלה גבוהה יותר באיור 3 ב, שבי neurites משתרעת על פני סריג של הרשת. כל רשת מרובע מורכב מסרט פחמן מחורר התומך בתאי העצב וneurites. חורים אלה הם לכאורה בתמונת cryo-EM במינון נמוך שנלקחה ב4k הגדלה, אשר מציגה את גוף תא העצב כאובייקט גדול יחסית, כהה, אלקטרונים צפופים (איור 3 ג), שממנו neurites פרויקט כלפי חוץ.
חלק ממנוחת neurite מעל חור בפחמן נבחר בקופסא צבעונית באיור 3C, ודהר-בהגדלה גבוהה (20k) באיור 3D. בהגדלה זו, מבנים הסלולר פנימיים ברורים הכוללים microtubules, שלפוחית, ומיטוכונדריה צריכים להיות ברורים באופן ברור (איור 3D), במיוחד בקרח בצורה אופטימלית הרזה כמו שנוצרו על ידי ביצוע פרוטוקול זה. המבנים השחורים הכהים במרכז התמונה (איור 3D) הם חלקיקי קרח משושה שנחשבים כזיהום וצריך בדרך כלל להימנע, עם זאת, בהתחשב בכך שהם מאוד דלילים ומחוץ לneurites עצמם, הם לא מתערבים עם שיקום וצבע יאור של המבנים הפנימיים לניתוח ופרשנות (איור 4). במינון נמוך, תמונה בהגדלה נמוכה נוספת היא שמוצגת באיור 5, שממנו יכול להיות ממוקם neurite, שלאחריו ניתן לקחת כמה תמונות 2-D ודיגיטלי מאוחה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה כדי ליצור מונטאז (איור 6).
הראשוניריכוז נמוך ציפוי (50,000 תאים / מיליליטר לכל צלחת) של הנוירונים ברשתות EM מאפשר לתאי עצב שהם מרווחים מספיק רחוק זה מזה, כדי להבטיח להדמיה ברורה של neurites (איור 3 ג); ריכוזים גבוהים יותר ממומלץ (> 50,000 תאים / מיליליטר לכל צלחת ) יכול לגרום לתמונות הכי מוצלח של neurites הצפופה שקשה להתחקות אחר או תכונת מרכיבים תאיים (7 ב דמויות ו7C).
איור 1. ערכה לגידול הנוירונים ברשתות EM בתוך זכוכית תחתונה מנות. () זכוכית תחתונה מנות מוצגות, באופן חלקי עם תקשורת סלולרי (ורוד). (ב) כל מנה מכילה רשת EM זהב אחד, כפי שמבט קרוב יותר מגלה. ציפוי (C) של Eרשת M עם פולי-ליזין מוצגת כצד-cutaway קריקטורה. צלחת תחתית הזכוכית מורכבת מcoverslip זכוכית מרובע שמחובר לחלק התחתון של צלחת תרבות פלסטיק, המשתרע על פתח עגול שנחצב במקור מתוך בתחתית. מנות תחתית כוס אלה גמא מעוקר ומסחרי קנה כתערובת של עוגיות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. סכמטי סופג ידני של EM רשתות עם הנוירונים דבקו. () תקריב של החריץ של המכונה vitrification הזזה כניסה (חץ שחור) ללחות / הקאמרית סופג, שבו פינצטה תוכנס למחוק את הדגימה באופן ידני. (ב)ערכת קריקטורה המראה כיצד נייר הסינון ללא סידן (0.5 סנטימטר x 0.5 פנים סנטימטר) צריך להיות מטופלים באמצעות פינצטה שטוחה הנקודה ומוכנסת דרך חריץ הכניסה לתא הלחות של המכונה vitrification לסופג רשת EM שבו נוירונים הם דבקו (טיפה של תקשורת סלולרי ורודה מוצגת). רשת EM מוחזקת על ידי פינצטה מיוחדת עדינה נקודה בתוך תא הלחות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. חזותי נוירונים קפוא, התייבשות במיקרוסקופ אלקטרונים זהב רשתות (EM). (א) תמונת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 10X השטח של רשת EM שבי נוירונים עיקרי חולדה היה Gro המרכזיכנף עבור 2 שבועות. (ב) הוגדלו-בתצוגה של התיבה אקווה שמוצגת ב( א '), שבו נוירונים ותחזיות neurite גלויים (חיצים הוורודים). (ג) אלקטרונים מיקרוסקופ בהגדלה של 4K neurite מקרין החוצה מהגוף תא העצב (חץ אדום). באופן סכמטי המתאים לאזור (כלומר התיבה האדומה) בתוך אחד מריבועי הרשת שמוצגים ב( ב '). קופסא הכחולה היא הצגה מקרוב ב( ד '), שבו התכונות הפנימיות של neurite נראות בבירור ב20k הגדלה (מיטוכונדריה חץ הירוקה; microtubules חץ כתום; חץ כחול שלפוחית). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. שיקום 3-D וביאור של tomogram האקסון DRG חולדה. () פרוס טומוגרפית מתוך ערימה משוחזרת של תמונות שצולמו בזוויות הטיה שונות של האקסון DRG אחד. (ב) מקבילים ביאור 3-D של אותו האקסון. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. תמונת cryo-EM 2-D של נוירון DRG עכברוש (מרכז שמאל) עם תחזיות אקסון (תיבה אדומה) בשעה 4k ההגדלה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 6. מונטאז' של ארבע תמונות cryo-EM 2-D של האקסון DRG חולדה אחת. כל תמונה צולמה ב20k ההגדלה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 7. תמונות 2-D cryo-EM של neurites. () האקסון DRG החולדה צילמו מקרוב בסמוך לסומה התא. (B, C) דוגמאות בשל צפיפות יתר של neurites ריכוז ציפוי גבוה של הנוירונים ברשתות EM. כל neurites היו שבועיים פלאש קפוא לאחר ציפוי ברשתות EM זהב. כל התמונות צולמו ב20k;. ההגדלה לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 8. שיקום 3-D וביאור של tomogram neurite היפוקמפוס חולדה. () פרוס טומוגרפית מתוך ערימה משוחזרת של תמונות שצולמו בזוויות הטיה שונות של neurite היפוקמפוס אחד. (ב) מקבילים ביאור 3-D של אותו neurite. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו מראים שנוירונים חולדה עובריים (גנגליון שורש הגבי והיפוקמפוס) ניתן לגדל במיקרוסקופ אלקטרונים זהב רשתות (EM) וקפוא בקרח זגוגי רזה מספיק neurites להיות צילמה באמצעות 2-D cryo-EM וcryo-3-D ET. בעוד neurites בהיפוקמפוס בעבר צילמה באמצעות cryo-ET 8,10,18,23, פרוטוקול מפורט מספיק לשכפול מוצלח באמצעות מכשירים זמינים מסחרי כבר חסרים. יתר על כן, בעוד שהמחקר שלהם הוא החלוצה השימוש של cryo-ET להמחשת neurites בהיפוקמפוס, המחקרים שלנו לחקור את הישימות של cryo-ET ליותר מסוג אחד של דגימה עצבית.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט הכנת EM רשתות עם או בהיפוקמפוס וגנגליון השורש הגבי נוירונים (DRG), סופג אותם כדי להשיג בצורה אופטימלית קרח דק, ובם להדמיה על ידי cryo-ET הקפאה לצלול. זמן סופג אופטימלי הוא אחד שלא לגרום לקרח עבה מדי לקרן האלקטרונים לחדור,ולא דק מדי, כי קרח זגוגי מופיע עם שיפוע שונה בעיקר מקצה של פחמן המחורר לפנימי ביותר של פחמן המחורר. יתר על כן, להשגת בצורה אופטימלית קרח דק דרך באמצעות מכונה vitrification מאי 17 להיות שונות במקצת עבור כל פרויקט, והקפאה חזקה שימוש במכונה vitrification דורשת עקומה למידה.
בעוד מחקרים קודמים התמקדו בתאי עצב בהיפוקמפוס, גם בחנו כאן במחקרים שלנו, יש לנו הרחקנו לכת כדי להראות תמונות בקנה המידה ננומטרי של אקסונים שלמים, קפוא התייבשות השלם של גנגליון השורש הגבי (DRG), אף פעם לא צילם לפני שימוש cryo- EM או cryo-ET. תאי DRG נבחרו מאחר שהם (בניגוד לתאי עצב בהיפוקמפוס) באופן בלעדי להצמיח אקסונים 34. פרוטוקול להדמיה אותם על ידי cryo-EM/cryo-ET יכול להיות שימושי למי שמעוניין להסיק ultrastructure אקסון כלומר בתאי עצב תחושתיים. אנחנו גם בהווה ובלדון בתוצאות שני אופטימליות והכי מוצלחות, כמו גםכחפצים הפוטנציאליים שאפשר להיתקל באמצעות cryo-ET לדגימות מסוג זה.
בריכוז התאים התקין (50,000 תאים / מיליליטר לכל צלחת), מרווח בין תאי העצב הוא כזה שneurites מאפשרת גישה מצוינת באמצעות אור במיקרוסקופ אלקטרונים (3A דמויות ו3B) עם הנוירונים אחד או שניים מופיעים לרשת מרובע (איור 3 ב) . המאפשר מספיק הפרדה בין הנוירונים הוא הכרחי להדמיה ברורה של neurites באמצעות cryo-EM (3C דמויות ו3D). נוירונים וneurites נתמכים על סרט פחמן מחורר של רשת הזהב, כפי שניתן לראות בבירור בתמונות cryo-EM (3C דמויות ו3D). גופי תא העצב, שיכולים לנוע בין ~ 15-50 מיקרומטר לנוירונים בהיפוקמפוס וגנגליון שורש הגבי נוירונים (DRG) 30,33 עבים מדי להדמיה באמצעות cryo-EM ומופיעים שחור לחלוטין, כאופייני לvאובייקטי ery אלקטרונים צפופים ודגימות עבות, בהשוואה לתחזיות יחסית רזה של neurites (אינו עולה על 1 מיקרומטר קוטר) מקרינות מהם (3C ואיורים 5).
רקמת מוח 3-D-מוטבע שרף אינה חושפת neurites שהן עגולים לגמרי בחתך 14: למעשה, המורפולוגיה שלהם משתנה. בכך הוא לא ידוע אם צורת noncircular של neurites היא טבעית או מלאכותי הכנת דגימה. העובי הנמדד של האקסון DRG (איור 4) גדל על רשת TEM, מחק וצלם כפי שמוצג במחקר זה היה 0.32 מיקרומטר בכיוון-z (בעומק של קרח זגוגי) ורוחבו ממוצע של 0.53 מיקרומטר ב מישור XY. העובי הנמדד של neurite בהיפוקמפוס (איור 8) גדל על רשת TEM, מחק וצלם כפי שמוצג במחקר זה היה 0.50 מיקרומטר בכיוון-z (בעומק של קרח זגוגי) וממוצע של 0.72 מיקרומטר במישור XY. התהליך סופג כפי שתואר כאן אפשר לשטח את neurites למרות שהם נשארו להתייבש במאגר המקורי שלהם במהלך כל התהליך של סופג ותהליך הקפאת מים עמוקים.
השטחה הקלה של neurites על הרשת כפי שנצפה על ידי cryoET אינה מופיעה כדי להשפיע על המבנה של מרכיביו הפנימיים כגון שלפוחית כפי שמוצג במסמך זה, שהם כמעט מושלם מעגליים ולא מראים סימנים של התייבשות. לעומת זאת, התהליכים הכימיים המשמשים בדרך כלל בהכנות 'מסורתיות' EM, במיוחד קיבעון כימי עם glutaraldehyde וparaformaldehyde ואחרי התייבשות באתנול, לגרום להתכווצות בלתי מבוקרת של רקמות. הפוטנציאל של מפגש אפקט סלולארי מזיק כגון מתבטל בשיטה שאנו מציגים לcryoET בכתב היד שלנו.
יתר על כן, דגימות neurites שלנו היו מייד לצלול קפוא באתאן הנוזלי, וכתוצאה מכך אניnstant 'הטבעה' בקרח זגוגי. רקמות שהוקפאו במצב זגוגי מופיעות הרבה יותר דומה למצב הפיזיולוגי מאשר שיטות אחרות. רמת פירוט ultrastructural אינה ההיבט היחיד שהופך את הטכניקה שתוארה בפרוטוקול שלנו להיות בעל ערך לחוקרים במדעי מוח. הטכניקה של גידול הנוירונים ברשתות EM, סופג באופן מיידי / לשמר במצב זגוגי להקרנה / הדמיה על ידי cryoET הקפאת צניחה היא טכניקה אטרקטיבית כי זה פותח את האפשרות לבחון ultrastructure של נוירונים תחת שונה גנטי, כימי או סביבתי מדגיש מבלי החשש של חפצי התייבשות פוטנציאליים.
התנאים הסופג לפני ההקפאה, כמפורט בפרוטוקול זה, הם חשובים כדי ליצור קרח דק מספיק להדמיה על ידי cryo-ET של תכונות ultrastructural, כוללים רכיבים פנימיים כגון מיטוכונדריה, שלפוחיות וmicrotubules (איורים 4, 6, ו7 א). מיטוכונדריה, למשל, אפשר הייתה לזהות בהכנות שלנו מאז שהם מופיעים דומים מבחינה מבנית בתאים מה שכבר ראה (את הקצוות של fibroblasts העכבר העוברי) באמצעות טומוגרפיה האלקטרונים cryo-20. הם גם להציג cristae, אשר ניתן לראות בתמונות-מבואר צבע 3-D נמצאות בכתב היד הזה. תמונות לא טובים יכולות לנבוע מקרח העבה שבו דימוי cryo-EM מופיע בדרך כלל אטום, מניעת זיהוי מוצלח של תכונות כגון מיטוכונדריה וmicrotubules בתוך neurite. חוסר פרטים מספיקים להכנת דגימות כאלה, במיוחד לגבי איך לייצר בצורה אופטימלית קרח דק, כמעט בודאות תרם להצלחה המוגבלת בהגדרת ultrastructure של neurites 8,10,17,23.
תמונות הכי מוצלח יכולות להיגרם גם כתוצאה מציפוי נוירונים רבים מדי על הרשת (> 50,000 תאים / מיליליטר לכל צלחת), שתוצאתה צפיפות של neurites (איורים0; 7B ו7C). תמונות מטושטשות עלולות להיות תוצאה של defocus השגוי וחייבת להיות מותאמות; defocus בתמונות שמוצגים כאן צולם עם underfocus ממוקד של 7 מיקרומטר. תמונות נאספו בdefocus כי כדי להבטיח ניגוד ונראות של תכונות ultrastructural גבוהים יותר, עם זאת, defocus נמוך יותר (כלומר 2-3 מיקרומטר) יכול לשמש גם כדי לקבל פרטים ברזולוציה גבוהים יותר של תכונות כאלו.
גורמים אחרים יכולים לתרום לתמונות הכי מוצלח. לדוגמא, למרות שהיא עשויה להיות מפתה להשתמש בתכונות אחרות של מכשיר vitrification, במיוחד את התכונה סופג חצי אוטומטית, ולא סופג במדריך המתואר כאן, זה נתן תוצאות לא רצויות. סופג דו צדדי בתחילה ניסה שימוש בתכונה אוטומטי למחצה זה, שבו המכונה vitrification (ולא למשתמש) בכלי המדגם ישירות באמצעות פרמטרים כגון סופג זמן ומספר הכתמים כמפורט על ידי המשתמש. עם זאת, afדגימות כגון הדמיה ter, נמצא כי כל תאי העצב שlysed פתוחים, שופכים את תכולתם (גופי multivesicular, וכו '). לפיכך, המכונה vitrification המומלצת להשתמש במקרה זה לתא לחותה טמפרטורה לשליטה שבו המדגם נמחק לפני לצלול הקפאה. שמירת הדגימה במצב כזה (עם לחות שנקבעה קרוב ל100%) ממזערת את אובדן מים במהלך הכנה ומסייעת להבטיח קרח זגוגי אופטימלי 3,7 הקפאת הודעה.
באופן אידיאלי, כדי לצמצם את החשיפה של תאי העצב להפרעות חיצוניות, הם צריכים להיות מבוגרים בCO 2 באינקובטור (טמפרטורה מוגדרת 37 ° C) בסמוך לחדר עם המכונה vitrification, והטמפרטורה למנגנון זה צריך להיות מוגדר 37 מעלות לפני הנוירונים ברשתות EM-הקפאה יהבהב. יש להימנע מחשיפת נוירונים לתנודות גדולות בטמפרטורה לפני סופג. בדו"ח זה, טמפרטורה נקבעה ל 32 ° Cלסופג מטרות; נוירונים גדלו בבניין אחר ופקיעה של ~ 10 דקות זמן התרחשה בין נושא את הצלחות של נוירונים מחדר אחד למשנו. טיפול נלקח כדי להגן על הדגימות ב, מיכל למחצה מבודד עמידים במים בעת תהליך ההובלה. שינוי דומה בטמפרטורה וריכוז CO 2 (כפי שחווה על ידי נוירונים לפני סופג / לצלול הקפאה) מתרחש לתאי העצב בכל ~ 2 ימים שבם נוירונים נלקחים מתוך תא הדגירה לאמצעי התקשורת שלהם להיות שונה מתחת לבטיחות הביולוגית מכסה המנוע, כפי שנעשה בדרך כלל עבור תרבויות עצביות. זה לא ראה לגרום לתופעות רעילות לתא.
באשר לנוכחותו של מה שנראה כאלקטרונים צפופים גרגרים בתוך המיטוכונדריה 'neurites, כמה דיווחים סותרים קיימים. גרגרים כאלה נמצאו במגוון רחב של רקמות שונות, ולא תאים במיוחד עצביים. הם נתפסים ככיור של קטיונים המסדירים את יונית הפנימית environment של המיטוכונדריה. הם מופיעים גם ליצור קשר אתרים בין קרומי המיטוכונדריה פנימיים וחיצוניים שבו אנזימים יכולים לתפקד ביעילות 16.
מחקרים ניסיוניים עולה כי סידן וקטיונים דו ערכיים אחרים להצטבר במיטוכונדריה כאשר היונים אלה נמצאים בנוזל הרחצה או מיטוכונדריה המבודדת או תאים שלמים. נראה סביר להניח כי היונים אורגניים חייבים גרגרי התוך המיטוכונדריה קיימים מראש. הוא הציע, אפוא, כי גרגרים אלה צמודים לרגולציה של הסביבה יונית הפנימית של המיטוכונדריה ביום 31.
יתר על כן, הנוירונים בהכנה שלנו היו בתרבית ברשתות EM ל14 ימים, העיתוי שבם הוא טיפוסי למטרות של 15,36 תולדת neurite, לפני ההדמיה ידי cryoEM / ET. זה כבר דווח כי קיימת עלייה דרמטית בריכוז הסידן תוך תאי בתאי עצב בגיל בהשוואה לyoun גרם נוירונים 32. לכן, סביר כי המיטוכונדריה בneurites של נוירונים בגילים אלה היו להציג גרגרי המיטוכונדריה לא בהכרח כסימן ללחץ, אלא משום שיש להם נוכחות גבוהה יותר של סידן תוך תאי.
גרגרי המיטוכונדריה אלקטרונים צפופים גם דווחו בfibroblasts העכבר העוברי גדל בתרבות והדמיה על ידי אותה הטכנולוגיה (טומוגרפיה האלקטרונים cryo-) כמו בשימוש בכתב היד שלנו 20. תאים אלה לא הראו דפוסים טיפוסיים של שינוי ultrastructural קשור עם פגיעה סלולרית, כגון שיבוש וvacuolization cytoskeletal של ציטופלסמה. כמו כן, בתוך neurites כדמיינו ידי cryoET, אנו לא צופים שלד תא שיבש שאחרת היה קשור עם רעילות סלולריות. בהתחשב בשיקולים שפורט לעיל, אנו מסיקים כי הנוירונים בהכנה שלנו לא יציגו גרגרי המיטוכונדריה כתוצאה מלחץ או רעיל.
תוכן "> כדי לעקר את משטח רשת EM על מנת למנוע זיהום לתאי העצב, וגם כדי ליצור משטח נוח, הידרופילי על רשת EM שלפולי-L-ליזין יכול לדבוק, בוערת רשתות EM לפני ציפוי הנוירונים נמצא להיות יתרון. עיקור UV לא נבחר מאחר שהיא דורשת הקרנה של הרשת למשך זמן ארוך יותר (לדוגמא 20-30 דק ') במכסת מנוע הבטיחות הביולוגית. לאחר מכן, הרשתות היו צריכה להיות מחדש נחשפו שוב לסביבה כאשר להיות זוהר -שוחרר לצורך hydrophilizing פני השטח של הרשת. Glow-פריקת הרשת מבטיח כי הציפוי שלאחר מכן poly-ליזין היית למעשה 'המקל' לרשת. הטכניקה של בוער הרשתות יש יתרון שכן הוא משלב גם את צעד hydrophilizing וצעד עיקור באחד. נוירונים עיקרי ידוע להיות רגיש יותר משורות תאים המבוסס על גידול וזה הכרחי כדי לשמור על הסביבה שלהם (רשת, צלחת פטרי) כסטרילי ככל האפשר.> כדי להמחיש את התכונות שמרחיבות לאורכו של neurite, עדיף ראשון לקחת תמונה בהגדלה נמוכה יותר במינון נמוך יותר אלקטרונים (3C דמויות ו -5), המשתרע על פני יותר מאזור הרשת לצורך הבחירה אשר neurite לתמונה . לאחר מכן, ניתן לקחת תמונות cryo-EM 2-D במרווחים ודיגיטליים מאוחה למונטאז' (איור 6). טכניקה זו עשויה להיות שימושית עבור תכונות ultrastructural, כגון ארגון microtubule, על פני שטח גדול יותר מזה של תמונת cryo-EM אחת.
אם ניקח במינון נמוך, תמונות ההגדלה נמוכה (3C דמויות ו5) הוא גם שימושי בזיהוי תחומי neurite שעולה בקנה אחד בקוטר פני סרט פחמן המחורר (שניהם בחורים ועל פני פחמן) ולכן יותר אידיאלי עבור הדמיה וניתוחים שלאחר מכן. גדלה של neurites מעל חורים של סרט פחמן נתפסת בדרך כלל בneur הגדולה יותרITES (איור 5) עם באופן ברור יותר חומר פנימי מאשר neurites דקה יותר (איור 3 ג). הוא חשב לתופעה זו מתרחשת עקב חוסר תמיכה פיזית את החורים של סרט פחמן. כאשר רשת EM היא להסיר את הצלחת שבה תאי העצב גדלו, ולאחר מכן מחקה מהישבן, neurites עם מסה יותר פנימית (איור 5) יותר מאחרים (איור 3 ג) נוטה להתרחב ו / או לשקוע לתוך החורים. למרות שזה נראה מלאכותי, יש לו יתרון ככדי להראות בצורה ברורה יותר את המרכיבים הפנימיים של neurite. באמצעות סרט פחמן רציף מעולף על סרט פחמן מחורר זה עשוי לעזור כדי לעקוף בעיה זו במחקרים עתידיים. התקנה זו הייתה בתחילה ניסתה אבל הביאה קרח זגוגי עבה מדי להדמיה. ניסויים מאוחרים יותר עם עוביים שונים של פחמן רציף מעולף על רשת EM ייתכן שיהיו צורך בחקירות נוספות.
Imporיתרון tant של השיטה הנוכחית הוא כי הארגון המרחבי של מרכיבי תא בתוך neurite ניתן דמיינו בקנה המידה ננומטרי על ידי לקיחה כמה תמונות 2-D של neurite בודד בזוויות הטיה שונות, ושחזור זה ערימה של תמונות לתוך tomogram. תכונות מבניות בודדות אז יכולות להיות מבוארות באופן ידני לכל פרוסה 2-D של מחסנית 3-D בצבעים שונים באמצעות התוכנה המתאימה (ראה טבלה של חומרים וריאגנטים) כפי שמוצגות להאקסון של גנגליון שורש חולדה E18 הגבי (DRG) נוירון (איור 4) וneurite של נוירון בהיפוקמפוס עכברוש E18 (איור 8).
על ידי בחירה לקחת תמונה כל 5 מעלות במהלך הסדרה להטות, ולא ° 1 או 2, פחות תמונות נאספות אבל מינון אלקטרונים גבוה יותר יכול לשמש לכל תמונה. התוצאה היא ניגודיות גבוהה יותר ופחות רעש בתמונות גולמיות. זה טוב יותר למטרות של שיקום (יישור על ידי חוצה קשר כאחד st EP) וביאור tomogram שלאחר מכן, אשר נעשה על ידי יד לכל תמונה הכוללת את ערימת tomogram בכיוון-z. בחירת גודל תוספת תלויה גם בגודל של הדגימה; בין זוויות הטיה שונות, דגימות גדולות יותר לא משתנות הרבה באותה המידה. במקרה זה, שימוש בגודל גדול יותר תוספת (5 מעלות) נחשב מתאים יותר בשל גודל הדגימה הגדול יחסית של neurite.
יתר על כן, הוספת סמני זהב fiducial לרשת EM תסייע ליישור תמונה בסדר אם תרצה בכך. סמני Fiducial לא היו רגילים כי המדגם היה גדול יחסית בהשוואה לדוגמאות אחרות cryo-EM (וירוסים או חלבונים בבידוד) והראה ניגודיות גבוהה עם מגוון רחב של תכונות מבניות שיכול לשמש ליישור נכון של כל אחת מהתמונות 2-D (המהווה את מחסנית 3-D) על ידי מתאם צולב. ערימת התמונה שהתקבלה הייתה מיושרת היטב שימוש בגישה זו, ושמיש לביאור צבע 3-D שלאחר מכן.
אף אוזן גרון "> למחקרים עתידיים, באמצעות מיקרוסקופ עם מסנן אנרגיה יכולה להפחית את הרעש שנגרם על ידי אלקטרונים מפוזרים inelastically אבל תכונה כזו עשויה שלא להיות זמינה ברוב המתקנים במיקרוסקופ האלקטרונים. ההליך שלנו חושף את מה שתמונות יכולות לנבוע מיקרוסקופ ק סטנדרטי 200 ללא מסנן אנרגיה, שעשוי להיות יותר זמין בדרך כלל לקהילת מדעי המוח בכללותו.הפרוטוקול המתואר כאן הוא מותאם להכנה באופן חזותי את שני האקסונים החולדה עובריים DRG וneurites היפוקמפוס באמצעות ציוד מסחרי זמין עבור cryo-EM וcryo-ET. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו היא שהיא מניבה מידע מבני מכל neurites, לא מחולק, הסתובב או טופל על ידי כימיקלים שונים על מנת להציג ultrastructure שלהם. אנחנו הוכיחו איך cryo-ET הוא שיטה מצוינת לשימוש בעיקר בניתוחי ultrastructural עתיד של נוירונים במצב קרוב לילידים לבחינת ההשפעהשל מחלה נוירולוגית על מבנה neurite.
מספרי הצטרפות בנק נתונים מיקרוסקופית אלקטרונים לtomograms 3-D כפי שדווח בעיתון זה הם כדלקמן: לneurite היפוקמפוס העכברוש כפי שמוצג באיור 8 ובווידאו הראשי (מ8:45-09:01), EMDB מספר הצטרפות הוא EMD-5887. לneurite הגנגליון החולדה הגבי שורש כפי שמוצגים באיור 4 ובוידאו הראשי (מ9:02-09:15), מספר הצטרפות EMDB הוא EMD-5885.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה כבר נתמך על ידי מענקי NIH (PN2EY016525 וP41GM103832). SHS נתמכה על ידי מענק מהתכנית ללימודי ההדרכה Nanobiology בינתחומי של מרכז קק WM להבינתחומי Bioscience הדרכה של חוף מפרץ קונסורציומים (NIH גרנט מס T32EB009379).
SHS גזור, גדל ומזוגג DRG ותאים בהיפוקמפוס, שנאסף cryo-EM ונתונים cryo-ET של DRG ואקסונים בהיפוקמפוס; שוחזר וצבע-מבואר סדרת ההטיה. MRG גזור וסיפק תאים בהיפוקמפוס במעבדה של MNR. SC סייע בביאור סדרת הטיה. SHS הוכשר על ידי CW על כיצד לנתח ולגדול נוירונים. SHS, WCM והמקלחת הגו את הניסויים. SHS הכין את כתב היד עם קלט ממחברים אחרים.
וידאו זה צולם במרכז לסלולרי הדמיה וNanoAnalytics (C-Cina) של Biozentrum של tהוא באזל האוניברסיטה. C-Cina משתלב במחלקה לBiosystems מדע וההנדסה (D-BSSE) של המכון הטכנולוגי של ציריך, הממוקם בבאזל, שוויץ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
