Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Подготовка первичных нейронов для визуализации нейриты в Frozen-гидратной государства Использование крио-электронной томографии

Published: February 12, 2014 doi: 10.3791/50783
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 2, 3, 4
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Чтобы сохранить нейрональные процессы ультраструктурным анализа, мы опишем протокол для обшивки первичных нейронов по электронной микроскопии сеток с последующей флэш замораживания, получая образцы взвешенных в слое стекловидного льда. Эти образцы могут быть рассмотрены с крио-электронного микроскопа для визуализации структуры в нанометровом масштабе.

Abstract

Невриты, оба дендриты и аксоны, являются нейронные клеточные процессы, которые позволяют проведение электрических импульсов между нейронами. Определение структуры нейритах имеет решающее значение для понимания того, как эти процессы перемещения материалов и сигналов, которые поддерживают синаптическую связь. Электронная микроскопия (ЭМ) традиционно используется для оценки ультраструктурные особенности в рамках невриты, однако воздействие органического растворителя при дегидратации и смолы вложения могут исказить структур. Важным неудовлетворенная целью является разработка процедур, позволяющих структурных оценок не пострадавших от таких артефактов. Здесь мы создали подробную и воспроизводимый протокол для выращивания и флеш-замораживания целые нейриты различных первичных нейронов на электронной микроскопии сетей с последующим их рассмотрения с крио-электронной томографии (крио-ET). Эта техника позволяет 3-D визуализации замороженных гидратированных нейритах на нанометровым разрешением, облегчая Assessment их морфологических различий. Наш протокол дает беспрецедентный вид на спинной ганглий корень (DRG) невриты, а также визуализации гиппокампа нейритах в их почти родной государства. Как таковые, эти методы создают основу для будущих исследований по нейритах обеих нормальных нейронов и страдающих от неврологических расстройств.

Introduction

Нейроны установить сложных схем, необходимых для функции центральной и периферической нервной системы по разработке дендриты получать информацию и аксоны, часто довольно длительным, общаться с вниз по течению нейронов. Рост нейритов играет фундаментальную роль в процессе эмбрионального развития и дифференцировки нейронов и поддержания нейритах поддерживает критически функцию нервной системы. Нейритных процессы также имеют критически нейронов травмы и регенерации, а также нервной системы. Изучение нейронов архитектуры важно понять как нормальную и больного мозга. К счастью, физиологически соответствующие нейронные системы клеточных культур существуют, которые могут повторять сложные и гетерогенных клеточных структур. На основе выяснения твердых экспериментальных площадок, эффективных стратегий визуализации, которые позволяют качественный и количественный анализ нейронной морфологии необходимы. Особенно полезно будетбыть подробная методология, которая обеспечивает согласованную платформу для визуализации нейриты, как аксонов и дендритов в нанометровом масштабе.

Традиционный электронная микроскопия требует использования органического растворителя в процессе дегидратации и смолы вложения, которые могут вызывать искажения в образцах от их истинное положение. На сегодняшний день большинство структурные характеризации в нанометровом масштабе основаны на больших клеток или тканей, которые подвергаются таких агрессивных химикатов - таким образом, ограничивающих интерпретацию результатов 4,9,25. Кроме того, для проникновения электронного пучка, секционирование требуется для организмов или клеточных выступов, обладающих толщину большую, чем 1 мкм 12. Наконец, срезы или измельченный результаты тканей в набор дискретных срез конкретных наборов данных, что делает обременительным определение удлиненного элемента нейритов. Даже для крио-ЭМ, в котором секционирования с замороженными гашеной образец можно, метод вводит сжатия Artifдействует 1.

В последние годы исследователи научились выращивать гиппокампа нейронов непосредственно на развивающихся сетей и вспышкой замораживания их в жидком этана впоследствии визуализировать нейриты помощью крио-ET 8,10,18,23. Тем не менее, такие исследования или использовать на заказ устройство 10,23, или отсутствие детали на промокательной шага для создания достаточного тонкий стекловидный лед для рутинной визуализации 8,18. Например, в одном исследовании рекомендует использовать 30-40 сек для декантации EM сетки 10, однако это значение оптимизирован не для общего пользования, но является специфическим для этого заказного глубоководным заморозки устройства. Использование на заказ устройство, а не имеющийся в продаже один 17 для поддержания влажности до окунуться заморозки образца может создать препятствие для широкого воспроизводимости.

Хотя эти исследования были новаторским в визуализации нейриты на крио-ЭТ, мы взяли еще один шаг вперед, чтобы исследовать арприменимости из крио-ЭТ к различным нейронных образцов (гиппокампа и задних корешков ганглиев нейронов). Кроме того, мы рассмотрим оба оптимальные и неоптимальные результаты, а также потенциальные артефакты, которые можно было столкнуться с помощью крио-ET для таких образцов.

Определение подробную методику для сохранения и визуализации целые нейриты в нанометровом масштабе в почти родной государства должно расширить возможности для более исследователей осуществлять ультраструктурные исследования. С этой целью мы опишем эффективную и подробный протокол с использованием коммерчески доступного оборудования для подготовки нефиксированные, неокрашенные нейроны визуализировать нейриты. Это важный первый шаг к детализации ультраструктуры здоровых невриты и заложить основу для понимания того, что структурные различия присутствуют в моделях заболевание нервной системы. С крио-ЭТ может решить нефиксированные, неокрашенные особенности аксонов в 3-D в нанометровом масштабе, метод позволит как никогда бытьПоэтому, чтобы определить нейритных архитектуры 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка Посуда с Е. М. сетям для гальванических первичных нейронов

  1. Изучите целостность дырявой углерода на золото на развивающихся сеток с использованием светового микроскопа при увеличении не менее 25X. Убедитесь углерода дыры> 98% нетронутыми.
  2. Для обшивки первичные нейроны, использовать горелку, чтобы пламя стерилизовать сетки ЭМ и одновременно сделать их гидрофильными. Используйте пинцет, чтобы забрать EM сетку за края, а не центральный решетчатого участка. ВНИМАНИЕ: Никогда не оставляйте зажженную Бунзена горелки без присмотра, и не используйте перчатки или пинцеты с пластиковых компонентов при выполнении действия:
    1. Перед включением горелку, установить настройке воздуха и газа в минимально открытом положении.
    2. Зажгите горелку с помощью форварда кремень или бутан зажигалка.
    3. Измените настройке воздуха и газа для достижения небольшой, синий внутренний огонь внутри повыше, легче синий / фиолетового пламени. Кончик внутренней пламени самая горячая часть пламени. Ручка подНит горелка регулирует количество газа, поступающего в трубу горелки, а ствол горелки могут быть превращены регулировать количество воздуха, поступающего в горелку. Включение регулировки воздуха по часовой стрелке уменьшает воздуха (в результате чего фиолетовым пламенем) и против часовой стрелки увеличивает воздуха (в результате в желтом пламени).
    4. Использование металлических пинцет (не пластиковые части) провести EM сетки, пройти его быстро через пламя дважды, перед углерод-вверх. Боковая углерода появится больше штейна (менее блестящий) и с большим количеством сероватым оттенком, чем другая сторона.
    5. Сразу передачи сетку (углерод-стороной вверх) в центре стеклянным дном блюдо размещается в 10 см от горелку. Используйте одну EM сетку за блюдо (рис. 1). Используйте только с прозрачным дном блюда, которые presterilized, т.е. гамма-излучением.
  3. Используйте светового микроскопа, чтобы проверить целостность сетки (углерода отверстия нетронутыми), все еще держа ЭМ сетку внутри стеклянной-Боттаом блюдо (чтобы избежать загрязнения). При применении любого вещества на сетке или что-нибудь, что будет вступать в контакт с нейронами, использовать стерильную порядок и стерильные наконечники пипеток.
  4. В капот культуры ткани с использованием стерильной процедуру, применять 250 мкл соответствующего покрывающего вещества медленно и осторожно в центральной части стеклянной чашки Петри. Убедитесь, что соответствующее вещество покрытия охватывает всю EM сетки.
    1. Для нейронов гиппокампа с помощью поли-L-лизин (PLL, 1 мг / мл) в качестве подвижной фазы, полученной, как описано ранее 19. Обратите внимание, что 250 мкл необходимы в EM сетки, за блюдо, поэтому масштабировать партию соответственно. Для спинной ганглий корень нейронов (DRG), используйте гелеобразную смесь белок выделяется Engelbreth-Холм-Рой (EHS) мыши клеток саркомы (см. Таблицу материалов и реагентов) в качестве покрывающего вещества, подготовьтесь следующим образом. Обратите внимание, что 250 мкл необходимы в EM сетки, за блюдо, поэтому масштабировать партию соответственно.
      1. Оттепель фондовый бутылкуиз желатиновой смеси белок выделяется Engelbreth-Холм-Swarm (EHS) мыши клеток саркомы в течение ночи при 4 ° С.
      2. Держите холодной желеобразные смесь белок выделяется Engelbreth-Холм-Swarm (EHS) мыши клеток саркомы, и всех компонентов, используемых для приготовления раствора, т.е., держа их на льду.
      3. В то время как на льду, разбавить эту гелеобразную смесь белка в Neurobasal среде с получением разбавление 1:20 (т.е. разбавленный 500 мкл желатиновой белковой смеси в 10 мл Neurobasal).
      4. Разделить разбавляют желеобразную смесь белка в 1 мл аликвоты, и сразу же хранить любые дополнительные аликвоты при -20 ° С
      5. Применить 250 мкл на EM сетки, за блюдо, как описано в разделе 1.4.
  5. Накройте чашку Петри с его верхней и инкубировать (либо с ФАПЧ для гиппокампа образцов, либо с желатиновой смеси белка для образцов DRG) в течение 1 ч при комнатной температуре в капот культуры ткани.
  6. Аспиоценить все PLL (для гиппокампа образцов) или гелеобразную протеиновой смеси (для DRG образцов) из блюд. Чтобы сделать это, используйте вакуумную систему в капот культуры ткани. Используйте стерильный наконечник пипетки, прикрепленный к вакуумной трубки. Избегайте прямого контакта с ЭМ сетки.
  7. С помощью регулируемого воздуха смещения пипетку осторожно применять 250 мкл стерильной PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) в EM сетки в центральной области стекла каждую чашку Петри таким образом, что сетка EM полностью покрывается PBS. Тогда, аспирации PBS от каждого блюда. Повторите 3 раза.
  8. Позвольте блюда с ЭМ сеток для сушки под капот культуры ткани в течение 15 мин. Убедитесь, что они полностью не высохнут, проверяя под световым микроскопом в комнатной культуре ткани. Убедитесь, что нет пузырьков влаги в сетке. Если это так, тщательно аспирации рядом с EM сетки для устранения этой лишнюю влагу. Сетка покрытием следует использовать сразу для гальванических нейроны.

2. Подготовка и Plating первичных нейронов на EM сетям

  1. К пластине первичные нейроны, первый рассекать, Trypsinize (с использованием 2,5% трипсина) и измельченного в порошок диссоциировать гиппокампа (или ганглиев дорзальных корешков 18-дневных эмбрионов крыс) на отдельные клетки, как описано выше 19.
    1. Triturate является общим термином, используемым для описания нейробиологов диссоциации скопления клеток на отдельные клетки, в частности, путем использования стеклянной пипетки с наконечником огневой полировкой. Результат достигается за счет осторожно и медленно рисования и выпуская клетки, вверх и вниз, несколько раз (~ 30) через пипетку.
  2. Следуйте процедурам, ранее описанные для DRG рассечения и выделения клеток 24, принимая к сведению использовать 0,25% трипсина (в HBSS), чтобы изолировать DRG нейроны крысы, а не использовать ферменты, предложенные (папаин, коллагеназы / диспаза), которые больше подходят для мыши DRG нейроны.
  3. Рассчитать количество изолированных нейронов (т.е. использованием гемоцитометра)и использовать это значение для вычисления соответствующего объема клеток для применения в каждую чашку для достижения концентрации 50000 клеток / мл на чашку. Максимальный объем применять составляет 250 мкл. Заметим, что это только заполняет центральную площадь остекления, а не весь блюдо.
  4. Выдержите посуду в течение 30 мин в СО 2-инкубаторе при температуре 37 ° С. Разрешить клетки для восстановления и придерживаться.
  5. Медленно добавьте 1,5 мл утепленных СМИ к каждому блюду, стараясь не потревожить EM сетки. Тип носителя зависит от типа клеток (гиппокампа или DRG).
    1. Подготовка соответствующий носитель для нейронов гиппокампа либо 19 или нейронов ганглиев дорзальных корешков 24, который должен быть нагревают в 37 ° С водяной бане до использования. Выдержите посуду на ночь в СО 2-инкубаторе.
    2. Для нейронов гиппокампа, смены носителя на следующий день. Изменение половина СМИ каждые два дня дальнейшими течение 14 дней. Теплый СМИ в 37 ° С водяной бане до использования. Для DRG нейронов, на следующий день после вскрытия / обшивки, подготовить свежий запас СМИ с антимитотические агента (Уридин и 5'-фтор-2'-дезоксиуридина) сделать 10 мМ маточного раствора каждого, отдельно; использовать окончательное концентрации 10 мкМ каждого из них. Удалить половина DRG информации (875 мкл) и добавляют 875 мкл свежей среды с анти-митотического агента.
      1. Для DRG нейронов, каждые два дня в течение первой недели, альтернативный сменить носитель между антимитотические СМИ и стандартной DRG СМИ. Для второй недели, изменить стандартные DRG СМИ каждые два дня.

3. Стеклующихся нейронов на EM сетям

  1. Подготовка оборудование и все материалы для замораживания и хранения золото EM сетки при криогенной температуре: а стеклования устройство с влажной камере 17, тонкой точкой специализированные пинцет для стеклования машины, длинный плоский пинцет, точечных Дьюара (ы) с жидким азотом (LN 2), вoolant контейнер, ящик для хранения ЭМ сетки, кальций без фильтровальной бумаги.
  2. Запустите стеклования устройство. Установка влажности до 100% и температуре 32 ° С. В разделе "Консоль", установить время пятно на ноль секунд. Это позволяет руководству промокательной через боковую окна камере влажности стеклованию машины.
  3. Обращайтесь с кальцием бесплатно фильтровальную бумагу в перчатках, отводками их таким образом, что три документа укладываются. Разрежьте стек в 0,5 см широкими полосами, которые ~ 2 см длиной. Согните их под углом 90 °, что одна сторона бумаги имеет 0,5 см х 0,5 см лица (рис. 2). С помощью пинцета удалите средний бумагу и поместите ее на другую бескальциевой фильтровальной бумаги до использования.
  4. Положите кнопку хранения сетки в держатель кнопки в остекловыванию камеры. Заполните внутреннюю камеру контейнера охлаждающей жидкости с жидким азотом и подождать до полного испарения. Заполните внешнюю камеру гое охлаждающей жидкости контейнер с жидким азотом, пока она не достигает стабильной температуры для перехода к следующему шагу. Заполните внутреннюю камеру с высокой чистоты газообразного этана, который будет конденсироваться в жидком состоянии в охлаждаемой камере.
  5. Переместите тарелку (адреса) из инкубатора в значительной 100 мм полистирола блюдо для транспортировки в остекловыванию комнате, если не в непосредственной близости. Используйте специализированные пинцет стеклования тщательно выбрать EM сетку из чашки. Примечание какой стороны нейроны растут на EM сетки; позиция будет иметь значения для следующего шага. Используйте черный скользящий замок на пинцета надежно запирает пинцет на EM сетки.
  6. Вставьте пинцет в стеклования машины таким образом, чтобы стороны от EM сетки, на которой нейроны придерживался лица слева, от бокового открытия отверстие стеклования машины. Уберите специализированные пинцетом в остекловыванию машины.
  7. Поместите контейнер охлаждающей жидкости в соответствующем держателеиз стеклования машины. Это должны быть заполнены с адекватной LN 2 и жидкого этана. Использование соответствующую команду экрана стеклования машины, поднять камеру охлаждающей жидкости вверх, пока он не промыт в нижней части камеры влажности.
  8. С плоских точечных пинцетом, понять один край фильтровальной бумаги такого, что короткая сторона (в 0,5 см х 0,5 см лицо) перпендикулярна помощью пинцета. Это лицо будет вступать в непосредственный контакт с EM сетки для блоттинга (рис. 2б). Осторожно вставьте фильтровальную бумагу в боковой отверстие камере влажности стеклованию машины (рис. 2А). Стабильно держать бумагу против EM сетки (сторона, обращенная в сторону от образца) на 10 сек. Откажитесь бумагу позже и сразу окунуться-заморозить образец в жидком этана с использованием средств автоматизации стеклованию машины.
  9. Осторожно перенести замороженные гидратированных EM сетки в один из слотов в одном изКнопки хранения сетки. Повторите эту процедуру для дополнительных сеток ЭМ в блюдах. Кнопки хранения сетки EM, используемые в этих экспериментах можно хранить несколько замороженных гидратированных сетки ЭМ.

4. Коллекция изображений, обработку и Аннотация

  1. Продолжать собирать 2-D электронные микрофотографии и / или наклона серии 3-D 5 из невриты, используя крио-электронного микроскопа при условии низких доз. В 2-D изображения были предназначены, чтобы оценить качество сетки с точки зрения толщины льда и возможных областях, чтобы быть полезным для наклона серии 3-D.
    1. В этом случае, все изображения были собраны с помощью ПЗС-камеры 4k 4k х, прикрепленный к электронным 200 кВ микроскопа, снабженного одной держателя наклона жидкий азот передачи крио, при увеличении микроскопа 20k в цель дефокусировки 7 мкм и отбора проб 4,4 A / пиксель.
    2. Для получения 3D томограмма образца, принять ряд проекционных изображений в то время как постепенно наклоняя образец альОнг одна ось из просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). Учитывая углы наклона и другие экспериментальные установки, существует несколько различных программного обеспечения, доступные для автоматического сбора наклона серии 5. Наклон серии 3-D показано здесь были собраны на одном микроскопе с помощью полу-автоматизированное программное обеспечение сбора наклона серии 26 в диапазоне -60 ° до 60 ° при 5 ° с шагом с накопленной дозы ~ 60 E / A 2.
  2. Реконструировать наклона ряд нейриты с использованием программного обеспечения для обработки изображений 21, как описано выше для других образцов 5,29.
  3. Цвет-аннотировать 3-D черты невриты, сначала сегментации томограмму и создания модели поверхности с помощью программного обеспечения для обработки изображений 3-D, как описано выше 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

До замораживания и обработки изображений с помощью крио-ЭТ, световым микроскопом изображения должны быть приняты в EM сетки, на которой нейроны растут. Нейриты должен быть отчетливо виден без существенных перекрытия друг с другом. Цветной блок на фиг.3А представляет собой область, которая будет увеличено в показать большее увеличение на фиг.3В, в котором нейритов проходить по решетчатой ​​сетки. Каждая сетка-квадрат состоит из дырявой углеродной пленки, которая поддерживает нейроны и их нейриты. Эти отверстия являются очевидными в низких дозах крио-ЭМ изображения, принятым на увеличения 4k, который показывает тело нейрона как относительно большой, темный, электронно-плотного объекта (рис. 3C), из которого нейриты проект наружу.

Часть аксонов отдыха над отверстием в углерода выбран в цветном поле в фиг.3С, и в масштабе в с большим увеличением (20k) в фиг.3Г. В это увеличение, четкие внутренние клеточные структуры, включая микротрубочек, везикулы и митохондрии должны быть очевидными (рис. 3D), особенно в оптимально тонкого льда, сгенерированный после этого протокола. Темные черные структуры в центре изображения (рис. 3D) являются шестиугольные ледяные частицы, которые считаются загрязнения и должны, как правило, следует избегать, однако, учитывая, что они очень редкие и за пределами самих невриты, они не мешают реконструкция и цвет-аннотации внутренних структур для анализа и интерпретации (рис. 4). Еще в низких дозах, низкий увеличенное изображение показано на рисунке 5, из которого аксонов могут быть расположены, после чего несколько 2-D изображения могут быть приняты и цифровой сшитые вместе, используя программное обеспечение для обработки изображений для создания монтаж (рис. 6).

Первоначальныйнизкая концентрация покрытие (50000 клеток / мл на чашку) нейронов на сетках ЭМ позволяет нейронов, которые расположены достаточно далеко друг от друга, чтобы обеспечить четкую визуализацию их невриты (рис. 3C); концентрации выше, чем рекомендуется (> 50,000 клеток / мл на чашку ) может привести к неоптимальных изображений густонаселенных нейритов, которые трудно проследить или атрибута клеточные компоненты (фиг. 7В и 7С).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема для выращивания нейронов на развивающихся сетей внутри стеклянным дном блюда. (А) стеклянным дном блюда показаны, частично заполнена ячейка СМИ (розовый). (В) Каждое блюдо содержит один золотой EM сетки, как ближе вид показывает. (C) Нанесение на EM сетки с поли-лизина показан в виде мультфильмов боковой разрезе. Стеклянным дном тарелки состоит из квадратной покровным стеклом, который прикреплен к нижней части пластиковой чашки для культивирования, охватывающих круглое отверстие, который был первоначально вырезать из нижней части. Эти стеклянным дном блюда гамма-стерилизации и коммерчески купил как Premade. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема для ручного блоттинга EM сетки с нейронами придерживались. (А) Крупным планом скольжения щель ввода стеклованию машины (черная стрелка) к влажности / промокательной камере, в которой пинцет будет вставлен, чтобы уничтожить образца вручную. (B)Мультфильм схема, показывающая, как кальций без фильтровальной бумаги (0,5 см х 0,5 см лицо) должны быть обработаны с использованием плоским точкой пинцет с и вставляется через щель ввода в влажности камеры стеклования машины для декантации ЭМ сетку, на которой нейроны привязаны (капелька розового клеточных сред показаны). Е.М. сетки проводится путем тонкой точечных специализированных пинцетом внутри камеры влажности. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3
Рисунок 3. Визуализация замороженные, гидратированных нейроны на золотом электронной микроскопии (ЭМ) сетках. (А) Свет микроскопическое изображение на 10-кратным увеличением центральной области ЭМ сетки, на которой крыса первичные нейроны были Грукрыло в течение 2 недель. (B) увеличенный вид части коробки, показанной на аква (а), в которых нейроны и их нейритов проекции видно (розовые стрелки). (C) Электронная микрофотография в 4K увеличением в нейрита выступающей наружу от тела нейрона (красная стрелка). Схематически соответствует области (то есть красной коробке) в одном из квадратов сетки, показанных на (B). Синяя коробка рассматривается крупным планом в (D), где внутренние особенности нейритов хорошо видны на 20k увеличении (зеленая стрелка митохондрии; оранжевые микротрубочки стрелками; пузырек синяя стрелка). Щелкните здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 4
Рисунок 4. 3-D реконструкция и аннотации крысы DRG аксона томограммы. (А) Томографическая ломтик от реконструированном стопку снимков, сделанных под разными углами наклона одного DRG аксона. (В)-корреспондент 3-D аннотации того же аксона. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 5
Рисунок 5. 2-D крио-ЭМ образ крысы DRG нейрона (левоцентристской) с аксонов проекций (Red Box) на увеличения 4k. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 6 Рисунок 6. Монтаж четырех 2-D крио-ЭМ изображений одной крысы DRG аксона. Каждое изображение было принято на 20k увеличения. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 7
Рисунок 7. 2-D крио-ЭМ образы невриты. (А) Крыса DRG аксонов в образ ближе в непосредственной близости от клеток сомы. (В, С) Примеры перенаселенность нейритов из-за высокой концентрации покрытия нейронов на развивающихся сетей. Все нейриты были флеш заморозки две недели после посева на золото на развивающихся сетей. Все снимки были сделаны в 20k;. Увеличение Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

Рисунок 8
Рисунок 8. 3-D реконструкция и аннотации из гиппокампа крысы невритного томограммы. (А) Томографическая ломтик от реконструированном стопку снимков, сделанных под разными углами наклона одного гиппокампа нейрита. (В)-корреспондент 3-D аннотацию же нейрита. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы покажем, что крысы эмбриональных нейронов (спинной ганглий корень и гиппокампа) можно выращивать на золотом электронной микроскопии (ЭМ) сетках и замораживали в стекловидное льда достаточно тонкой для своих нейритах для включения в образ с помощью 2-D крио-ЭМ и 3-D крио- ET. В то время как гиппокампа нейриты ранее отображаемого использованием крио-ET 8,10,18,23, протокол достаточно подробным для успешного тиражирования с использованием коммерчески доступных устройств не хватало. Кроме того, в то время как их исследование пионером в использовании крио-ЭТ для визуализации гиппокампа нейриты, наши исследования рассмотреть возможность применения крио-ЭТ для более чем одного типа нейронных образца.

Здесь мы описываем подробный протокол готовится EM сетки либо гиппокампа и спинной ганглий корень (DRG) нейронов, промокательной им достичь оптимально тонкий лед, и окунуться заморозки их для работы с изображениями по крио-ЭТ. Оптимальное время блоттинга является тот, который не приводит к лед слишком толстый для электронного пучка, чтобы проникнуть,и не слишком тонкие, что стекловидное тело лед появляется с заметно отличается градиентом от края дырявой углерода до глубины дырявой углерода. Кроме того, достижение оптимально тонкий лед через использование стеклования машины 17 может быть немного отличается для каждого проекта, и надежная замораживания с использованием стеклования машины требует обучения.

В то время как предыдущие исследования сосредоточены на нейронах гиппокампа, также разведанных здесь, в наших исследованиях, мы отправились дальше, чтобы показать изображения в нанометровом масштабе интактных, замороженные увлажненной целых аксонов спинномозговых ганглиев (DRG), никогда не изображается перед использованием крио- Е.М. или крио-ЭТ. Были выбраны клетки DRG, так как они (в отличие от нейронов гиппокампа) исключительно привести к аксонов 34. Протокол для работы с изображениями их cryo-EM/cryo-ET может быть полезным для тех, кто заинтересован, чтобы вывести аксонов ультраструктуры т.е. в сенсорных нейронах. Мы также представить и обсудить как оптимальные и неоптимальные результаты, а такжекак потенциальных артефактов, которые можно было столкнуться с помощью крио-ET для таких образцов.

В соответствующей концентрации клеток (50000 кл / мл на чашку), расстояние между нейронами такова, что нейритов позволяют отличный доступ с помощью света и электронной микроскопии (фиг.3А и 3В) с одним или двумя нейроны появляются в сетке-квадрат (фиг.3В) . Разрешение достаточно разделение между нейронами необходимо для четкой визуализации нейритах через крио-ЭМ (рис. 3C и 3D). Нейроны и их нейриты поддерживаются на дырявой углеродной пленки золотого сетке, как ясно видно на изображениях крио-ЭМ (рис. 3C и 3D). Нейрона органы, которые могут варьироваться в зависимости от ~ 15-50 мкм для нейронов гиппокампа и спинной ганглий корень (DRG) нейронов 30,33 слишком толстые для визуализации с использованием крио-ЭМ и появляются полностью черным, как это характерно для VERy электронно-плотные объекты и толстых образцов, а по сравнению с относительно тонкими проекций невриты (не более 1 мкм в диаметре), исходящих из них (рис. 3C и 5).

Смола встраиваемый 3-D ткани мозга не раскрывает нейритов, которые полностью круглое поперечное сечение 14, в самом деле, их морфологии является переменным. Он, таким образом, не известно, если некруглой формы нейритах естественно или препарат артефакт образец. Измеренная толщина DRG аксона (рис. 4), выращенных на ТЕА сетки, промокают и отображаемого как показано в этом исследовании, 0,32 мкм в Z-направлении (в глубине стекловидного льда) и средняя ширина 0,53 мкм плоскость ху. Измеренная толщина гиппокампа нейритов (рис. 8), выращенных на ТЕА сетки, промокают и отображаемого как показано в этом исследовании, 0,50 мкм в Z-направлении (в глубине стекловидного льда) исреднем 0,72 мкм в плоскости ху. Процесс блоттинга, как описано здесь может сгладить нейритов хотя они оставались гидратированный в их первоначальном буфере в течение всего процесса погружения блоттинга и замораживание процесса.

Незначительное уплощение нейритах на сетке как заметил cryoET, кажется, не влияет на структуру его внутренних компонентов, таких как пузырьки, как показано здесь, которые почти идеально круглая и не проявляют никаких признаков обезвоживания. С другой стороны, химические процессы, обычно используемые в "традиционных" ЭМ препаратов, в частности химической фиксации с глутаральдегида и параформальдегидом с последующей дегидратацией в этаноле, в результате неконтролируемого ткани усадки. Потенциал встречая такую ​​разрушительную сотовой эффект устраняется в методе мы представляем для cryoET в нашей рукописи.

Кроме того, наши образцы нейриты были немедленно окунуться-замораживали в жидком этана, в результате Instant "встраивания" в стекловидное льда. Ткани, которые заморожены в стеклообразном состоянии появляются гораздо больше похожа на физиологическое состояние, чем другие методы. Уровень ультраструктурном подробно не единственный аспект, который делает метод описан в нашем протоколе быть ценным для нейронауки исследователей. Способ выращивания нейронов на развивающихся сетей, сразу промокательной / окунуться заморозки их для скрининга / изображений по cryoET заповеднике в стекловидное состояние является привлекательным техника, потому что это открывает возможность рассмотрения ультраструктуры нейронов при различных генетических, химических или окружающей среды подчеркивает без беспокойства потенциальных артефактов обезвоживания.

Условия блоттинга перед замораживанием, как описано в данном протоколе, являются важными для генерирования лед достаточно тонкий для визуализации по крио-ET из ультраструктурных особенностей, в том числе внутренних компонентов, таких как митохондрии, пузырьки и микротрубочек (рис. 4, 6, 7А). Митохондрии, например, могут быть идентифицированы в наших препаратов, так как они появляются структурно похожи на то, что был замечен в клетках (края мышиных эмбриональных фибробластов) с помощью крио-электронной томографии 20. Они также отображать кристы, которые можно увидеть в 3-D Цвет-аннотированный изображений настоящих в этой рукописи. Субоптимальные изображения может быть результатом толстым слоем льда, в котором крио-ЭМ изображение появляется обычно непрозрачные, предотвращая успешной идентификации таких функций, как митохондрии и микротрубочек внутри нейрита. Отсутствие достаточных деталей для получения таких образцов, в частности о том, как производить оптимально тонкий лед, почти наверняка способствовал ограниченный успех в определении ультраструктуры нейритах 8,10,17,23.

Субоптимальные изображения может быть также результатом слишком много покрытие нейронов на сетке (> 50000 клеток / мл на чашку), что приводит к переполнению нейритов (рис.0; 7В и 7С). Размытые изображения могут быть результатом неправильного расфокусировки и должны быть скорректированы; расфокусировки в изображениях, показанных здесь было принято с целевой дефокусировки 7 мкм. Изображения были собраны в то расфокусировки, чтобы обеспечить более высокую контрастность и видимость ультраструктурных особенностей, однако ниже расфокусировки (т.е. 2-3 мкм) также могут быть использованы для получения более высокого детали разрешение таких функций.

Другие факторы могут внести вклад в субоптимальных изображений. Например, хотя это может быть заманчивым использовать другие особенности стеклования машины, в частности, полу-автоматизированной промокательной функции, а не ручной блоттинга, описанного здесь, это дало нежелательные результаты. Двусторонняя блоттинг первоначально попытались с помощью этого полуавтоматического функцию, в которой машина стеклования (а не пользователя) теряют контакт образца непосредственно с помощью таких параметров, как промокательной времени и количество пятнами, как указано пользователем. Тем не менее, афизображений тер такие образцы, было установлено, что все нейроны были лизированы открыт, разлив их содержимое (мультивезикулярные органы и т.д.). Таким образом, витрификация машина лучше всего использовать в этом случае для его температуры контролируемой влажности камеры, в которой образец смыл до окунуться замораживание. Поддержание образец в таком состоянии (с влажностью, установленного близка к 100%) сводит к минимуму потери воды во время приготовления и помогает обеспечить оптимальное стекловидного льда после замораживания 3,7.

В идеале, для минимизации воздействия нейронов к внешним возмущениям, они должны быть выращены в СО 2 инкубатора (температуры, установленной до 37 ° С) в непосредственной близости от комнаты с стеклования машины и температуры для этого аппарата должен быть установлен в 37 ° C до мигать заморозки нейроны на сетках с развивающихся рынков. Следует избегать разоблачения нейронов к большим колебаниям температуры до промокательной. В этом докладе, температура была установлена ​​на 32 ° Cдля целей промокательной; нейроны были выращены в другом здании и промежуток времени ~ 10 мин произошло между балансовой тарелки нейронов из одной комнаты в другую. Были приняты меры для защиты образцов в водостойкой, полу-изолированном контейнере в процессе транспортировки. Аналогичное изменение температуры и концентрации СО 2 (по опыту нейронов до промокательной / погружной замораживания) происходят в нейронах каждые ~ 2 дней, когда нейроны извлекают из инкубационной камеры для их СМИ должна быть изменена под биобезопасности капот, как это обычно делается для нейронов культур. Это не видно привести к токсическому воздействию на клетку.

Что касается присутствия, что, кажется, электронно-плотные гранулы внутри митохондрий нейриты ", существует несколько противоречивые сообщения. Такие гранулы можно найти в множестве различных тканей, а не конкретно нервных клеток. Они воспринимаются в качестве поглотителя катионов, которые регулируют внутреннюю ионных анvironment из митохондрии. Они также появляются создать контактные участки между внутренней и наружной мембранами митохондрий, в которых ферменты могут эффективно функционировать 16.

Экспериментальные исследования показывают, что кальций и другие двухвалентные катионы накапливаться в митохондриях, когда эти ионы присутствуют в жидкости ванны либо изолированные митохондрии или интактных клеток. Кажется вероятным, что ионы органически связанного с уже существующими внутри митохондрий гранул. Предполагается, таким образом, что эти гранулы связаны с регулированием внутренней ионной среде митохондрии 31.

Кроме того, нейроны в нашей подготовки культивировали на развивающихся сетей в течение 14 дней, сроки, что характерно для целей рост аксонов 15,36, до визуализации по cryoEM / ET. Сообщалось, что существует значительное увеличение внутриклеточной концентрации кальция в возрасте нейронов по сравнению с Юн г нейронов 32. Таким образом, вполне вероятно, что митохондрии в нейритов этих нейронов в возрасте будет отображать митохондриальные гранулы не обязательно как признак стресса, а потому, что они обладают более высокой наличие внутриклеточного кальция.

Электронно-плотные митохондриальные гранулы также сообщалось в мышиных эмбриональных фибробластов, выращенных в-культуре и, отображаемых той же технологии (крио-электронной томографии), используемый в нашей рукописи 20. Эти клетки не показывают типичные образцы ультраструктурном изменения, связанные с клеточного повреждения, такие как цитоскелета нарушения и вакуолизации цитоплазмы. Кроме того, в наших невриты, как визуализируется cryoET, мы не наблюдали разрушенный цитоскелета, которые могли бы быть связаны с клеточной токсичности. Учетом приведенных выше соображений, мы приходим к выводу, что нейроны в нашей подготовке не отображать митохондриальные гранулы в результате стресса или токсичности.

Содержание "> Для стерилизации поверхности EM сетки, чтобы предотвратить загрязнение с нейронами, а также для создания благоприятного гидрофильную поверхность, на EM сетки, в которой поли-L-лизин может прилипать, пламенный сетки ЭМ до посева нейронов был обнаружен чтобы быть выгодным. УФ стерилизации не был выбран, поскольку он требует облучение сетки течение более длительного времени (например, 20-30 мин) в капот биологической. Затем сетки должны быть повторно подвергается снова к окружающей среде, когда будучи свечения разряжен для целей гидрофилизации поверхности сетки. раскаленной разрядки сетки гарантирует, что последующее поли-лизин покрытием эффективно будет "пряника" к сетке. Методика пылающий сеток является предпочтительным, так как он сочетает в себе как шаг гидрофилизирующего и шаг стерилизации в одном. Первичные нейроны, как известно, более чувствительны, чем опухоли на основе клеточных линий, и это очень важно сохранить свое окружение (сетки, Петри) максимальную стерильность.

(фиг. 3C и 5), который покрывает большую часть площади сетки для целей выбора того, какой нейритов к изображению . Тогда, 2-D крио-ЭМ изображения могут быть приняты на основе и цифровой сшитые вместе в монтаж (рис. 6). Этот метод может быть полезен для ультраструктурных функций, таких как организации микротрубочек, по большей площади, чем у одного крио-ЭМ изображения.

Принимая низкие дозы, низкий коэффициент увеличения изображения, рисунки (3C и 5) также полезен в идентификации областей нейритов, которые согласуются в диаметре через дырявой углеродной пленки (как в отверстия и через углерод) и, следовательно, более подходит для визуализации и последующий анализ. Увеличение нейритов более отверстий углеродной пленки, как правило, видели в большей Neurийцев (рис. 5) с четко дополнительной внутренней материала, чем тоньше невриты (рис. 3C). Это явление как полагают, происходит из-за отсутствия физической поддержки в отверстия в углеродной пленки. Когда сетка EM удаляется из тарелки, в которой нейроны растет, а затем промокают с тыльной стороны, невриты с дополнительной внутренней массы (рис. 5), чем другие (фиг.3С), как правило, расширение и / или провисание в отверстия. Хотя это, кажется, быть артефактом, он имеет преимущество в качестве, чтобы показать более четко внутренние составные части нейрита. Использование непрерывный углеродной пленки накладывается на этой дырявой углеродной пленки может помочь обойти эту проблему в будущих исследованиях. Эта установка была изначально пытались, но привело к стекловидного льда слишком толстым для работы с изображениями. Последующие испытания с различными толщинами непрерывного углерода, наложенных на EM сетки, возможно, потребуется дальнейшее расследование.

СущественнымTant преимущество текущего метода является то, что пространственная организация клеточных компонентов в рамках нейрита могут быть визуализированы в нанометровом масштабе, принимая несколько 2-D изображения одного нейрита под разными углами наклона, и реконструкции этот стек изображений в томограмме. Отдельные конструктивные особенности могут быть вручную аннотированный для каждого 2-D кусочек 3-D стека в разные цвета с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов и реагентов), как показано на аксона крыс E18 спинной ганглий корень (DRG) нейрон (рис. 4) и аксонов из крысиной E18 гиппокампа нейрона (рис. 8).

Выбирая взять изображение каждые 5 градусов во время серии наклона, а не 1 или 2 ° меньшее количество изображений собраны, но более высокая доза электронов могут быть использованы в изображении. Это приводит к более высокой контрастностью и меньшим уровнем шума в исходных изображений. Это лучше для целей реконструкции (выравнивание по кросс-корреляции, как одной ул ер) и последующее томограмма аннотации, которая осуществляется путем руку для каждого изображения, содержащего стек томограмма в г-направлении. Выборе размера приращение также зависит от размера образца; между разными углами наклона, более крупные образцы не будет изменяться, как много. В этом случае, используя больший размер хода (5 °) считалось, что больше подходит в связи с относительно большим размером образца от нейрита.

Кроме того, добавление фидуциальных золотые маркеры к EM сетки будет оказывать помощь для тонкой выравнивания изображения по желанию. Исходные маркеры не использовались, поскольку выборка была относительно большой по сравнению с другими образцами крио-ЭМ (вирусы или белков в изоляции) и показал высокую контрастность с различными структурными особенностями, которые могут быть использованы для правильного выравнивания каждого из 2-D изображений (в составе 3-D стек) по кросс-корреляции. В результате стек изображение было хорошо согласованы с помощью этого подхода, и полезной для последующего 3-D цвета аннотации.

ЛОР "> Для будущих исследований, с помощью микроскопа с энергией фильтра может уменьшить шум, вызванный неупругорассеянных электронов, но такая возможность не может быть легко доступны в большинстве электронной микроскопии объектов. Наша процедура показывает то, что изображения может привести от стандартного микроскопа 200 кВ без каких-либо энергии фильтра, которые могут быть более широко доступны в неврологии сообщества в целом.

Протокол, описанный здесь оптимизирован для подготовки и визуализации как крысы эмбриональных DRG аксоны и гиппокампа нейриты с использованием коммерчески доступного оборудования для крио-ЭМ и крио-ЭТ. Одним из основных преимуществ этого метода является то, что она дает структурную информацию из целых невриты, не разделяемую, измельченный или обработанной различными химическими реагентами, чтобы просматривать их ультраструктуры. Мы показали, как крио-ЭТ является особенно превосходный метод для для изучения воздействия использования в будущих ультраструктурным анализа нейронов в состоянии, близком к роднымневрологического заболевания на структуру аксонов.

Входные номера, электронная микроскопия Банк данных для 3-D томограмм как сообщалось в данном документе, являются следующие: Для гиппокампа крысы нейрита как показано на рисунке 8 и в главном видео (с 8:45-9:01), EMDB номер доступа является EMD-5887. Для крыс спинной ганглий корень нейрита как показано на рисунке 4 и в главном видео (с 9:02-9:15), регистрационный номер, EMDB является EMD-5885.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантами NIH (PN2EY016525 и P41GM103832). СВС была поддержана стипендией от подготовки выпускников Программы нанобиологии междисциплинарных из Кека Центра междисциплинарных Bioscience подготовки побережье Мексиканского залива консорциумов (NIH грант № T32EB009379).

СВС рассеченные, рос и остеклованные DRG и клеток гиппокампа; собраны крио-ЭМ и крио-ET данные DRG и гиппокампа аксонов; реконструирован и цвет-аннотированный серию наклона. MRG расчлененный и при условии, гиппокампа клетки в лаборатории МПР в. SC помощь в наклона серии аннотации. СВС обучался CW о том, как анализировать и расти нейроны. СВС, WCM и туалет задуман эксперименты. СВС подготовили рукопись с участием других авторов.

Этот фильм был снят в Центре Cellular изображений и NanoAnalytics (С-CinA) от Biozentrum третон университет Базель. С-CINA интегрирован в Департамент биосистем науки и техники (D-BSSE) от ETH Zürich, расположенный в Базеле, Швейцария.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #7 Tweezers Electron Microscopy Sciences 72803-01 For handling EM grids
Glass bottom dishes MatTek Corp. P35G-1.5-10C For growing sample
Electron microscopy grids Quantifoil Holey Carbon, Au 200, R 2/2 For growing sample
Calcium-free filter paper Whatman 1541-055 For blotting sample
Large flat point long tweezers Excelta Corporation E003-000590, 25-SA For blotting sample 
Vitrification device and tweezers FEI Vitrobot Mark III For freezing sample
Minigrid storage boxes Ted Pella, Inc. 160-40 For storing EM grids
Cryo transfer holder Gatan 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder For imaging samples
Semiautomated tilt series acquisition software SerialEM http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ For imaging samples
Image processing software IMOD eTomo http://bio3d.colorado.edu/imod/ For image processing
Transmission electron microscope for cryoEM JEOL, Tokyo 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope For imaging samples
4k x 4k CCD camera Gatan N/A For imaging samples
3-D annotation software Visage Imaging GmbH Amira/Avizo For processing 3-D data
Software for digitally stitching 2-D images Adobe Adobe Photoshop For processing 2-D data
DMEM, High Glucose Invitrogen 11965-118 For hippocampal culture
Boric acid Sigma Aldrich B-0252 For hippocampal culture
Sodium tetraborate Sigma Aldrich B-9876 For hippocampal culture
Poly-L-lysine  Sigma Aldrich P2636-500MG For hippocampal culture
Filter system Corning 430758 For hippocampal culture
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049 For DRG culture
B-27 supplement Invitrogen 17504-044 For DRG culture
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 For DRG culture
GlutaMAX Invitrogen 35050-061 For DRG culture
Recombinant rat b-NGF R&D Systems 556-NG For DRG culture
Uridine Sigma U3003-5G For DRG culture
5'-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma F0503-100MG For DRG culture
Matrigel BD Biosciences 356234 For DRG culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
  2. Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
  3. Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
  4. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  5. Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
  6. DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
  7. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
  8. Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
  9. Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
  10. Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
  11. Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
  12. Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
  13. De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
  14. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  15. Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
  16. Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
  17. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  18. Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
  21. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  22. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
  23. Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
  25. Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
  27. Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
  28. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
  29. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
  30. Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
  31. Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
  32. Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
  33. Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
  34. Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
  35. Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
  36. Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).

Tags

Неврология выпуск 84 Нейроны крио-электронной микроскопии электронный микроскоп томография Мозг крыса первичная культура нейронов морфологический анализ
Подготовка первичных нейронов для визуализации нейриты в Frozen-гидратной государства Использование крио-электронной томографии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shahmoradian, S. H., Galiano, M. R., … More

Shahmoradian, S. H., Galiano, M. R., Wu, C., Chen, S., Rasband, M. N., Mobley, W. C., Chiu, W. Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (84), e50783, doi:10.3791/50783 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter