Summary
Para preservar los procesos neuronales para el análisis ultraestructural, se describe un protocolo para la siembra de las neuronas primarias en rejillas de microscopía electrónica, seguido de congelación instantánea, dando muestras en suspensión en una capa de hielo vítreo. Estas muestras pueden ser examinados con un crio-microscopio electrónico para visualizar estructuras a escala nanométrica.
Abstract
Las neuritas, ambos dendritas y axones, son procesos celulares neuronales que permiten la conducción de impulsos eléctricos entre las neuronas. Definición de la estructura de neuritas es fundamental para la comprensión de cómo estos procesos se mueven materiales y señales que permiten la comunicación sináptica. La microscopía electrónica (EM) se ha utilizado tradicionalmente para evaluar las características ultraestructurales dentro de neuritas, sin embargo, la exposición a disolventes orgánicos durante la deshidratación y la incrustación de resina puede distorsionar las estructuras. Una meta insatisfecha importante es la formulación de procedimientos que permitan evaluaciones estructurales no afectados por este tipo de artefactos. Aquí, hemos establecido un protocolo detallado y reproducible para el cultivo y el flash de congelación neuritas enteras de diferentes neuronas primarias sobre rejillas de microscopía electrónica, seguida de su examen con la crio-tomografía electrónica (crio-ET). Esta técnica permite la visualización 3-D de las neuritas, hidratados congelados a una resolución de nanómetros, facilitando ASSEssment de sus diferencias morfológicas. Nuestro protocolo se obtiene una visión sin precedentes de la raíz dorsal (GRD) ganglio neuritas, y una visualización de neuritas hipocampo en su estado casi nativo. Como tales, estos métodos crean una base para futuros estudios sobre neuritas de las neuronas normales y los afectados por trastornos neurológicos.
Introduction
Las neuronas establecen el complejo esencial de circuitos para la función de los sistemas nerviosos central y periférico mediante la elaboración de dendritas para recibir información y axones, a menudo bastante largo, para comunicarse con las neuronas aguas abajo. El crecimiento de neuritas juega un papel fundamental durante el desarrollo embrionario y la diferenciación y el mantenimiento de las neuritas neuronal apoya críticamente la función del sistema nervioso. Procesos neuríticas también disponen de forma crítica en la lesión y la regeneración neuronal, así como trastornos del sistema nervioso. El estudio de la arquitectura neuronal es fundamental para comprender tanto el cerebro normal y enfermo. Afortunadamente, existen sistemas de cultivo de células neuronales fisiológicamente relevantes que pueden recapitular las estructuras celulares complejas y heterogéneas. Basado en la elucidación de las plataformas experimentales sólidas, estrategias de visualización eficaces que permitan a los análisis cualitativos y cuantitativos de morfología neuronal se necesitan. Especialmente útil seríaser una metodología detallada que proporciona una plataforma consistente para la visualización de las neuritas, tanto axones y dendritas en la escala nanométrica.
Microscopía electrónica tradicional requiere el uso de disolvente orgánico durante la deshidratación y la incrustación de resina, que puede inducir distorsiones en los especímenes de su verdadero estado. Hasta la fecha, la mayoría de las caracterizaciones estructurales a escala nanométrica se basan en células más grandes o los tejidos que se someten a este tipo de productos químicos agresivos - limitando así la interpretación de los hallazgos 4,9,25. Por otra parte, para la penetración del haz de electrones, se requiere de seccionamiento para los organismos o protuberancias celulares que presentan un espesor superior a 1 m 12. Finalmente, seccionada o blanqueado resultados de tejido en la colección de conjuntos de datos sobre el tramo específico discretas, lo que hace engorrosa la definición de la función alargada de neuritas. Incluso para la crio-EM, en la que el corte una muestra congelada hidratado es posible, el método introduce Artif compresiónHechos 1.
En los últimos años, los investigadores han aprendido cómo hacer crecer las neuronas del hipocampo directamente en redes de EM y el flash de congelación en etano líquido para visualizar posteriormente neuritas utilizando crio-ET 8,10,18,23. Sin embargo, tales estudios o bien utilizar un producto a medida 10,23, o los detalles de la falta en el paso de secante para la generación de hielo vítreo lo suficientemente delgada como para la visualización de rutina 8,18. Por ejemplo, un estudio recomienda el uso de 30 a 40 segundos para secar la rejilla EM 10, sin embargo, este valor no está optimizado para su uso general, pero es específica para ese dispositivo de inmersión congelación a medida. El uso de un producto a medida en lugar de un comercialmente disponible un 17 para el mantenimiento de la humedad antes de sumergirse de congelación de la muestra podría representar un obstáculo para la reproducibilidad generalizada.
Si bien estos estudios han sido pioneras en la visualización de neuritas por crio-ET, hemos dado un paso más para explorar la apaplicabilidad de la crio-ET a una variedad de especímenes neuronales (neuronas del hipocampo y del ganglio de la raíz dorsal). Además, se discuten tanto los resultados óptimos y subóptimos, así como los posibles artefactos que uno podría encontrar utilizando la crio-ET para tales especímenes.
Definición de una técnica detallada para la preservación y la visualización de las neuritas enteros a escala nanométrica en un estado casi nativo aumentaría la capacidad de más investigadores para llevar a cabo estudios ultraestructurales. Para ello, se describe un protocolo eficaz y detallada utilizando equipos disponibles comercialmente para preparar, neuronas no marcadas no fijadas para visualizar las neuritas. Este es un importante primer paso hacia la que detalla la ultraestructura de neuritas saludables y para sentar las bases para la comprensión de cuáles son las diferencias estructurales presentes en modelos de enfermedades del sistema nervioso. Desde crio-ET puede resolver, las características de neuritas sin teñir no fijadas en 3-D en la escala nanométrica, el método hará posible que nunca seatanto para definir la arquitectura neurítico 12.
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Protocol
1. La preparación de platos con EM Grids for Plating neuronas primarias
- Examine la integridad de carbono perforado en las redes de EM oro utilizando un microscopio óptico con un aumento de por lo menos 25 veces. Haga agujeros de carbono estén> 98% intacto.
- Para chapado neuronas primarias, use un mechero Bunsen a la llama-esterilizar las redes de EM y al mismo tiempo hacerlas hidrófilas. Utilice pinzas para recoger la red EM por los bordes, no en la zona cuadriculada central. PRECAUCIÓN: Nunca deje un mechero Bunsen encendida sin supervisión, y no use guantes o pinzas con componentes de plástico, mientras que la realización de estos pasos:
- Antes de encender el mechero Bunsen, fijar los ajustes de aire y gas a una posición mínimamente abierta.
- Encender el quemador Bunsen usando un pedernal delantero o butano.
- Modificar los ajustes de aire y de gas para lograr una pequeña llama interior, azul dentro de un encendedor de llama azul / violeta más alto. La punta de la llama interior es la parte más caliente de la llama. La manzana debajoNeath el quemador ajusta la cantidad de gas que entra en el tubo del quemador, mientras que el barril del quemador se puede girar para ajustar la cantidad de aire que entra en el quemador. Al girar el ajuste de aire en sentido horario disminuye el aire (lo que resulta en una llama púrpura) y sentido antihorario, aumentará el aire (lo que resulta en una llama amarilla).
- Con unas pinzas de metal (no hay piezas de plástico) para sujetar la rejilla EM, pasar rápidamente a través de la llama dos veces, con el lado de carbón. El lado de carbono aparecerá más mate (menos brillante) y con más de un tinte de color grisáceo que el otro lado.
- Transferir inmediatamente la rejilla (del lado de carbono hacia arriba) en el centro del plato con fondo de vidrio colocado dentro de los 10 cm del mechero Bunsen. Utilice una rejilla EM por placa (Figura 1). Sólo use platos con fondo de cristal que se Preesterilizadas, es decir, a través de irradiación gamma.
- Utilice un microscopio de luz para comprobar la integridad de red (agujeros de carbono intacta), mientras que todavía mantiene la rejilla EM dentro del cristal-bottplato om (para evitar la contaminación). Cuando la aplicación de cualquier sustancia en la parrilla o cualquier cosa que entre en contacto con las neuronas, utilice el procedimiento estéril y puntas de pipeta estériles.
- En una campana de cultivo de tejido utilizando el procedimiento estéril, aplicar 250 l de la sustancia de recubrimiento apropiado lentamente y con cuidado a la zona central de cristal de la placa de Petri. Asegúrese de que la sustancia de recubrimiento adecuado cubre toda la red de EM.
- Para las neuronas del hipocampo, usar poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) como la sustancia de recubrimiento, preparado como se ha descrito previamente 19. Tenga en cuenta que se necesitan 250 l por rejilla EM, por plato, así que la escala del lote correspondiente. Para ganglio de la raíz dorsal (DRG), las neuronas, utilizar una mezcla de proteína gelatinosa secretada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de ratón (véase la Tabla de Materiales y Reactivos) como la sustancia de recubrimiento, preparar como sigue. Tenga en cuenta que se necesitan 250 l por rejilla EM, por plato, así que la escala del lote correspondiente.
- Descongele una botella stockde la mezcla de proteína gelatinosa secretada por Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma de ratón (EHS) la noche a 4 ° C.
- Mantener frío la mezcla de proteína gelatinosa secretada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de ratón, y todos los componentes utilizados para hacer la solución, es decir, manteniéndolos en hielo.
- Mientras que en el hielo, se diluye esta mezcla proteína gelatinosa en medio Neurobasal para producir una dilución 1:20 (es decir, diluir 500 l de la mezcla de proteína gelatinosa en 10 ml de Neurobasal).
- Divide diluye mezcla de proteína gelatinosa en alícuotas de 1 ml y almacenar inmediatamente cualquier alícuotas adicionales a -20 ° C.
- Aplicar 250 l por rejilla EM, por plato, como se describe en la Sección 1.4.
- Para las neuronas del hipocampo, usar poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) como la sustancia de recubrimiento, preparado como se ha descrito previamente 19. Tenga en cuenta que se necesitan 250 l por rejilla EM, por plato, así que la escala del lote correspondiente. Para ganglio de la raíz dorsal (DRG), las neuronas, utilizar una mezcla de proteína gelatinosa secretada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de ratón (véase la Tabla de Materiales y Reactivos) como la sustancia de recubrimiento, preparar como sigue. Tenga en cuenta que se necesitan 250 l por rejilla EM, por plato, así que la escala del lote correspondiente.
- Cubrir la placa de Petri con su parte superior e incubar (ya sea con PLL para las muestras de hipocampo, OR con la mezcla de proteína gelatinosa para los especímenes DRG) durante 1 hora a temperatura ambiente en la campana de cultivo de tejido.
- Aspievaluar todas PLL (para los especímenes de hipocampo) o la mezcla de proteína gelatinosa (para los especímenes DRG) de los platos. Para ello, utilice el sistema de vacío en la campana de cultivo de tejidos. Utilice una punta de pipeta estéril conectada al tubo de vacío. Evite el contacto directo con la red de EM.
- Usar una pipeta de desplazamiento de aire ajustable para aplicar cuidadosamente 250 l de PBS estéril (solución salina tamponada con fosfato) a la red de EM en el área de vidrio central de cada placa de Petri, de tal manera que la rejilla EM está totalmente cubierto por PBS. Luego, aspirar el PBS de cada plato. Repita 3 veces.
- Permitir a los platos con redes de EM se sequen bajo la campana de cultivo de tejido durante 15 min. Asegúrese de que estén completamente secos marcando bajo el microscopio de luz en la sala de cultivo de tejidos. Asegúrese de que no haya burbujas de la humedad en la cuadrícula. Si es así, cuidadosamente aspirado al lado de la rejilla EM para eliminar esta humedad adicional. La rejilla recubierta debe utilizarse inmediatamente para el recubrimiento de las neuronas.
2. Preparación y PlCIONES neuronas primarias en EM Grids
- Para la placa neuronas primarias, primera disección, trypsinize (utilizando tripsina al 2,5%) y se tritura para disociar los hipocampos (o dorsal ganglio de la raíz de 18 días de edad embriones de rata) en células individuales, como se ha descrito anteriormente 19.
- Se tritura es un término común usado por neurobiólogos para describir disociación grupos de células en células individuales, en particular mediante el uso de una pipeta de vidrio con una punta pulida al fuego. El resultado se consigue mediante la cuidadosa y lentamente dibujo y la liberación de las células, arriba y abajo, varias veces (~ 30) a través de la pipeta.
- Siga los procedimientos descritos anteriormente para la disección DRG y el aislamiento celular 24, tomando nota de usar 0,25% de tripsina (en HBSS) para aislar las neuronas DRG de rata, en lugar de utilizar las enzimas sugeridos (papaína, colagenasa / dispasa) que son más adecuados para el ratón DRG neuronas.
- Calcular el número de neuronas aisladas (es decir, utilizando un hemocitómetro)y usar este valor para calcular el volumen apropiado de células para aplicar a cada plato para conseguir una concentración de 50.000 células / ml por placa. El volumen máximo a aplicar es de 250 l. Tenga en cuenta que esto sólo llena el área central de cristal, no todo el plato.
- Incubar los platos durante 30 minutos en una incubadora de CO 2 a 37 ° C. Permiten a las células se recuperen y se adhieren.
- Poco a poco agregue 1.5 ml de medio calentado a cada plato, con cuidado de no molestar a la red EM. El tipo de medios de comunicación depende del tipo de célula (hipocampo o DRG).
- Prepare el soporte de impresión adecuado, ya sea para las neuronas del hipocampo dorsal 19 o neuronas del ganglio de la raíz 24, lo que es para ser calentado en un baño de agua a 37 ° C antes de su uso. Incubar los platos durante la noche en la incubadora de CO 2.
- Para las neuronas del hipocampo, cambiar los medios de comunicación al día siguiente. Cambiar medio de los medios de comunicación cada dos días durante 14 días en adelante. Calentar los medios de comunicación en un 37 ° C baño de agua antes de su uso. Para las neuronas DRG, el día después de la disección / placas, preparar un material fresco de los medios de comunicación con un agente anti-mitótico (uridina y 5'-fluoro-2'-desoxiuridina) preparar una solución madre 10 mM de cada uno, por separado, el uso de una final concentración de 10 mM para cada uno. Retire medio de los medios de comunicación DRG (875 l) y añadir 875 l de medio fresco con el agente anti-mitótico.
- Para DRG neuronas, cada dos días durante la primera semana, se alternan entre el cambio de los medios de comunicación anti-mitótico y medios DRG estándar. Para la segunda semana, cambiar el medio de GRD estándar cada dos días.
3. Vitrificar neuronas en EM Grids
- Prepare el equipo y todos los materiales para la congelación y el almacenamiento de las redes de EM oro a temperatura criogénica: un dispositivo de vitrificación con una cámara de humedad 17, pinzas especializadas de punta fina para la máquina de la vitrificación, pinzas de punto larga y plana, Dewar (s) de nitrógeno líquido (LN 2), Ccontenedor oolant, caja de almacenamiento de red EM, papel de filtro libre de calcio.
- Inicie el dispositivo de vitrificación. Ajuste la humedad al 100% y la temperatura a 32 ° C. En la sección "Consola", ajuste el tiempo de transferencia de cero segundos. Esto permite manual de secante a través de la ventana lateral de cámara de humedad de la máquina de la vitrificación.
- Maneje el papel de filtro libre de calcio con guantes, capas ellos de tal manera que tres documentos se apilan. Corte la pila en 0,5 cm de ancho tiras que son ~ 2 cm de largo. Doblar en un ángulo de 90 ° de tal manera que un lado de el papel tiene una 0,5 cm x 0,5 cm de la cara (Figura 2). Con unas pinzas, retire el papel central y colocarlo en otro papel de filtro libre de calcio hasta su uso.
- Ponga el botón de almacenamiento de red en el soporte de botón dentro de la cámara de la vitrificación. Llenar la cámara interior del envase del líquido refrigerante con nitrógeno líquido y esperar hasta la evaporación completa. Llenar la cámara exterior de the envase del líquido refrigerante con nitrógeno líquido hasta que se alcanza una temperatura estable para proceder al siguiente paso. Llenar la cámara interior con alta pureza etano gaseoso que se condensa a un estado líquido dentro de la cámara de enfriado.
- Mueva el plato (s) de la incubadora a un gran plato de 100 mm de poliestireno para el transporte a la sala de vitrificación, si no dentro de la vecindad inmediata. Utilice las pinzas especializadas de vitrificación para escoger con cuidado la rejilla EM de la antena. Nota que lado las neuronas están creciendo en la parrilla de EM, la posición importará para el siguiente paso. Utilice el bloqueo deslizante negro de las pinzas para bloquear de forma segura las pinzas en la parrilla de EM.
- Inserte las pinzas en la máquina de vitrificación de tal manera que el lado de la red de EM en el que las neuronas se adhieren caras a la izquierda, lejos del agujero de apertura lateral de la máquina de la vitrificación. Repliegue las pinzas especializadas en la máquina de vitrificación.
- Coloque el envase del líquido refrigerante en el soporte apropiadode la máquina de la vitrificación. Debe estar lleno de LN adecuada 2 y etano líquido. Usando el comando de pantalla apropiado de la máquina de la vitrificación, elevar la cámara de refrigerante hacia arriba hasta que se inundó con la parte inferior de la cámara de humedad.
- Con las pinzas de punto plana, sujete un borde del papel de filtro de tal manera que el lado más corto (los 0,5 cm x 0,5 cm de la cara) es perpendicular a las pinzas. Esta cara se encuentran en contacto directo con la red de EM para Blot (Figura 2B). Introduzca con cuidado el papel de filtro en el orificio lateral de la cámara de humedad de la máquina de la vitrificación (Figura 2A). De forma estable sostener el papel contra la rejilla EM (el lado alejado de la muestra) durante 10 s. Deseche el papel después e inmediatamente sumergirse a congelar la muestra en el etano líquido mediante la automatización de la máquina de la vitrificación.
- Transferir con cuidado la rejilla EM-hidratado congelado a una de las ranuras en uno de losBotones de almacenamiento de red. Repita el proceso para redes de EM adicionales en los platos. Los botones de EM de almacenamiento de red utilizados en estos experimentos pueden almacenar múltiples redes de EM-congelados hidratado.
4. La colección de imágenes, producción y anotación
- Proceda a recoger micrografías electrónicas en 2-D y / o 3-D serie de inclinación 5 de las neuritas utilizando un microscopio crioelectrónica bajo una condición de baja dosis. Las imágenes 2-D estaban destinadas a evaluar la calidad de la red en términos de espesor de hielo y las áreas posibles para ser útil para 3-D serie de inclinación.
- En este caso, todas las imágenes fueron recolectados a través de una cámara 4k x 4k CCD conectada a un microscopio de 200 kV de electrones equipado con un soporte para la transferencia de nitrógeno criogénico líquido de inclinación única, en 20k microscopio óptico a un blanco underfocus de 7 micras y muestreo de 4,4 Å / píxel.
- Para obtener una tomografía 3D de la muestra, tomar una serie de imágenes de proyección, mientras que de forma incremental al inclinar la muestraOng un eje del microscopio electrónico de transmisión (TEM). Teniendo en cuenta los ángulos de inclinación y otros parámetros experimentales, hay varios programas diferentes disponibles para recopilar automáticamente la serie de inclinación 5. La serie de inclinación 3-D que se muestra aquí se recogieron en el mismo microscopio utilizando el software semi-automáticos de adquisición serie de inclinación 26 en un rango de -60 ° a 60 ° en incrementos de 5 ° con una dosis acumulada de ~ 60 E / A 2.
- Reconstruir la serie de la inclinación de las neuritas utilizando el software de procesamiento de imágenes 21 como se describió anteriormente para otras muestras de 5,29.
- Color-anotar las características 3-D de las neuritas por primera segmentación de la tomografía y la creación de un modelo de superficie usando un software de procesamiento de imagen 3-D como se describe anteriormente 5.
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Representative Results
Antes de la congelación y de imagen a través de la crio-ET, imágenes de microscopio de luz se deben tomar de la red de EM en el que las neuronas están creciendo. Las neuritas deben ser claramente visibles y sin solapamiento significativo entre sí. Un cuadro de color en la Figura 3A representa un área que está ampliada-en para mostrar un aumento mayor en la Figura 3B, en la que las neuritas se extienden a través de la celosía de la red. Cada cuadrícula de cuadrados se compone de una película de carbón perforado que soporta las neuronas y sus axones. Estos agujeros son evidentes una imagen Cryo-EM de baja dosis tomada en 4k aumento, que muestra el cuerpo de la neurona como un objeto relativamente grande, oscuro, denso a los electrones (Figura 3C), de la que sobresalen hacia fuera en las neuritas.
Una parte de la neurita de reposo por encima de un agujero en el carbono se selecciona en un cuadro de color en la Figura 3C, y has-en con un mayor aumento (20k) en la figura 3D. Con este aumento, estructuras celulares internas claras incluyendo los microtúbulos, vesículas, y mitocondrias deben ser claramente evidente (Figura 3D), en particular en el hielo de manera óptima delgada como generados siguiendo este protocolo. Las estructuras de color negro oscuro en el centro de la imagen (Figura 3D) son partículas de hielo hexagonales que se consideran como la contaminación y deben ser evitados normalmente, sin embargo, dado que son muy escasos y fuera de los propios axones, que no interfieran con el reconstrucción y color-anotación de las estructuras internas para el análisis y la interpretación (Figura 4). Otra, la imagen de magnificación de baja dosis baja se muestra en la Figura 5, de la que una de las neuritas puede ser localizado, después de lo cual varias imágenes 2-D se pueden tomar y digitalmente cosen juntos usando software de procesamiento de imagen para generar un montaje (Figura 6).
La inicialconcentración de recubrimiento bajo (50.000 células / ml por placa) de las neuronas en las redes de EM permite neuronas que están separados una distancia suficiente para garantizar una visualización clara de sus neuritas (Figura 3C); concentraciones superiores a las recomendadas (> 50.000 células / ml por placa ) pueden dar lugar a imágenes subóptimas de neuritas concurridas que son difíciles de localizar o atributo componentes celulares (Figuras 7B y 7C).
Figura 1. Esquema para el crecimiento de neuronas en redes de EM en los platos con fondo de cristal. (A) platos con fondo de cristal se muestran, parcialmente lleno de medios de comunicación celular (rosa). (B) Cada plato contiene una rejilla EM de oro, como una vista más cercana revela. (C) Recubrimiento de la ERejilla M con poli-lisina se muestra como un lado de dibujos animados-corte. El plato de fondo de cristal se compone de un cubreobjetos de vidrio cuadrado que está unido a la parte inferior de una placa de cultivo de plástico, que cubre una abertura circular que se cortó originalmente fuera de la parte inferior. Estos platos con fondo de cristal son gamma esterilizada y comercialmente comprar de premade. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Esquema para la transferencia manual de los EM rejillas con las neuronas adheridas. (A) Primer plano de la ranura de entrada de deslizamiento de la máquina de la vitrificación (flecha negro) a la / cámara secante humedad, en la que se insertarán las pinzas para secar la muestra manualmente. (B)Esquema de dibujos animados que muestra cómo el papel de filtro libre de calcio (0,5 cm x 0,5 cm cara) debe manejarse con las pinzas de punto plana y se inserta a través de la ranura de entrada en la cámara de humedad de la máquina de la vitrificación para secar la rejilla EM en el que las neuronas se adhieren (gota de medio celular de color rosa se muestra). La rejilla EM está en manos de unas pinzas de punta fina especializados dentro de la cámara de humedad. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Visualizar, neuronas hidratadas congeladas en microscopía electrónica de oro (EM) rejillas. (A) Imagen de microscopio de luz a 10 aumentos de la parte central de una red de EM en el que las neuronas primarias de ratas han sido groala durante 2 semanas. (B) zoom en la vista de la caja de aqua se muestra en (A), en el que las neuronas y sus proyecciones neuritas son visibles (flechas de color rosa). (C) Micrografía electrónica en 4K ampliación de una de las neuritas se proyecta hacia fuera desde el cuerpo de la neurona (flecha roja). Esquemáticamente se corresponde con una zona (es decir, el cuadro rojo) dentro de una de las cuadrículas se muestran en (B). Cuadro azul es visto de cerca en (D), donde las características internas de la neuritas son claramente visibles en 20k magnificación (flecha verde mitocondrias; naranja microtúbulos de flecha; vesícula flecha azul). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. La reconstrucción 3-D y la anotación de un axón tomografía de DRG de rata. (A) corte tomográfico de una pila reconstruida de imágenes tomadas en diferentes ángulos de inclinación de un axón DRG. (B) correspondiente anotación en 3-D de la misma axón. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 5. 2-D la imagen de crio-EM de una neurona DRG de rata (centro-izquierda) con proyecciones axonales (recuadro rojo) en 4k ampliación. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 6. Montaje de cuatro 2-D imágenes de crio-EM de un solo axón DRG de rata. Cada imagen fue tomada en 20k ampliación. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 7. Imágenes 2-D crio-EM de neuritas. (A) Un axón DRG de rata reflejados más cerca en la proximidad del soma celular. (B, C) Ejemplos de hacinamiento de las neuritas, debido a la alta concentración de recubrimiento de las neuronas en redes de EM. Todas las neuritas se congelaron rápidamente dos semanas después de siembra en redes de EM oro. Todas las imágenes fueron tomadas en 20k;. Magnificación Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 8. La reconstrucción 3-D y la anotación de un tomograma de neuritas del hipocampo de rata. (A) corte tomográfico de una pila reconstruida de imágenes tomadas en diferentes ángulos de inclinación de una de las neuritas del hipocampo. (B) correspondiente anotación en 3-D de la misma neuritas. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
Se demuestra que las neuronas embrionarias de rata (ganglio de la raíz dorsal y del hipocampo) que se puede cultivar en el microscopio electrónico de oro (EM) rejillas y congelado en hielo vítreo lo suficientemente delgada como para sus neuritas para ser fotografiados utilizando 2-D crio-EM y 3-D de la crio- ET. Mientras neuritas hipocampo previamente han sido fotografiadas usando crio-ET 8,10,18,23, un protocolo lo suficientemente detallada para la replicación exitosa utilizando dispositivos disponibles en el mercado que ha faltado. Por otra parte, mientras que su investigación ha sido pionero en el uso de la crio-ET para la visualización de las neuritas hipocampo, nuestros estudios exploran la aplicabilidad de la crio-ET a más de un tipo de muestra neuronales.
Aquí se describe un protocolo detallado preparar EM rejillas, ya sea con el hipocampo y la raíz dorsal ganglio (GRD) neuronas, borrándolos de lograr hielo óptima delgada, y sumergimos-congelación para obtener imágenes por crio-ET. Tiempo óptimo de transferencia es uno que no resulte en hielo demasiado gruesa para el haz de electrones para penetrar,ni muy delgada que aparece el hielo vítreo con notablemente diferente degradado desde el borde del carbono holey a la más interna del carbono holey. Además, el logro de hielo óptima delgado a través de el uso de una máquina de la vitrificación 17 puede ser ligeramente diferente para cada proyecto, y la congelación sólida usando la máquina de vitrificación requiere una curva de aprendizaje.
Aunque las investigaciones anteriores se ha centrado en las neuronas del hipocampo, también explorados aquí en nuestros estudios, hemos ido más lejos para mostrar imágenes a escala nanométrica de los axones intactos enteros, congelados hidratado del ganglio de la raíz dorsal (DRG), nunca imagen antes de utilizar la crio- EM o crio-ET. Células DRG fueron escogidos ya que (en contraste con las neuronas del hipocampo) dan lugar exclusivamente a los axones 34. Un protocolo para obtener imágenes de ellos por cryo-EM/cryo-ET podría ser útil para los interesados deducir ultraestructura axonal es decir, en las neuronas sensoriales. También nos presentan y discuten los resultados óptimos y subóptimos tanto, asícomo los posibles artefactos que uno podría encontrar utilizando la crio-ET para tales especímenes.
A la concentración apropiada de la célula (50000 células / ml por plato), el espaciamiento de las neuronas es tal que neuritas permiten un excelente acceso usando la luz y microscopía electrónica (Figuras 3A y 3B) con uno o dos neuronas que aparece por la rejilla-cuadrado (Figura 3B) . Permitir suficiente separación entre las neuronas es necesario para la visualización clara de los axones a través de la crio-EM (Figuras 3C y 3D). Las neuronas y sus axones son compatibles con una película de carbono holey de la parrilla de oro, como se ve claramente en las imágenes de crio-EM (Figuras 3C y 3D). Los cuerpos de las neuronas, que pueden variar de un ~ 15-50 m para las neuronas del hipocampo y de la raíz dorsal ganglio (GRD) neuronas 30,33 son demasiado grueso para la imagen utilizando la crio-ME, aparezcan completamente negro, como es típico de los very objetos densos en electrones y muestras gruesas, en comparación con las proyecciones relativamente más delgadas de las neuritas (que no excedan de 1 m de diámetro) que irradian de ellos (figuras 3C y 5).
Tejido cerebral 3-D de la resina-incrustado no revela neuritas que son completamente circular en sección transversal 14, de hecho, su morfología es variable. Por tanto, no se sabe si la forma no circular de neuritas es natural o una preparación artefacto espécimen. El espesor medido de la axón DRG (Figura 4) crecido en la rejilla TEM, borrado y la imagen como se muestra en este estudio fue de 0,32 m en la dirección z (en la profundidad de la hielo vítreo) y una anchura media de 0,53 micras en el plano xy. El espesor medido de la neuritas del hipocampo (Figura 8) crecido en la rejilla TEM, borrado y la imagen como se muestra en este estudio fue de 0,50 m en la dirección z (en la profundidad de la hielo vítreo) y unpromedio de 0,72 m en el plano xy. El proceso de transferencia tal como se describe en el presente documento podría aplanar las neuritas aunque se mantuvieron hidratado en su búfer original durante todo el proceso de transferencia y el proceso de inmersión de congelación.
El ligero aplanamiento de neuritas sobre la rejilla tal como se observa por cryoET no parece afectar a la estructura de sus componentes internos, tales como vesículas como se muestra en el presente documento, que son casi perfectamente circular y no muestran signos de deshidratación. Por el contrario, los procesos químicos comúnmente utilizados en los preparados "tradicionales" EM, en particular la fijación química con glutaraldehído y paraformaldehído seguido de deshidratación en etanol, dan como resultado la contracción del tejido no controlada. El potencial de encontrar un efecto celular tales dañino se elimina en el método que presentamos para cryoET en nuestro manuscrito.
Además, las muestras fueron inmediatamente neuritas hundir-congelados en etano líquido, resultando en inStant 'incorporación' en hielo vítreo. Los tejidos que se congelan en un estado vítreo aparecen mucho más similar al estado fisiológico que otras técnicas. El nivel de detalle ultraestructural no es el único aspecto que hace que la técnica descrita en el protocolo para ser valioso para los investigadores de la neurociencia. La técnica de cultivar neuronas en redes de EM, inmediatamente secante / inmersión congelación para preservar en un estado vítreo para la investigación / formación de imágenes por cryoET es una técnica atractiva porque abre la posibilidad de examinar la ultraestructura de las neuronas bajo diferentes genética, química o ambiental subraya, sin la preocupación de posibles artefactos de deshidratación.
Las condiciones de transferencia antes de la congelación, como se detalla en este protocolo, son importantes para generar hielo lo suficientemente delgada como para la visualización de la crio-ET de las características ultraestructurales, incluidos los componentes internos, tales como mitocondrias, vesículas y los microtúbulos (Figuras 4, 6, 7A). Las mitocondrias, por ejemplo, podría ser identificado en nuestros preparativos, ya que parecen estructuralmente similar a lo que se ha visto en las células (los bordes de fibroblastos embrionarios de ratón) a través de la crio-tomografía electrónica 20. Ellos también muestran crestas, que se puede ver en las imágenes en color-anotada 3-D presentes en este manuscrito. Imágenes subóptimas pueden resultar de la gruesa capa de hielo en el que la imagen de la crio-EM aparece generalmente opaca, la prevención de la identificación con éxito de tales características como las mitocondrias y microtúbulos dentro de la neurita. A falta de datos suficientes para la preparación de tales especímenes, en particular sobre la forma de producir hielo óptima delgada, casi seguro que han contribuido al éxito limitado en la definición de la ultraestructura de las neuritas 8,10,17,23.
Imágenes subóptimas pueden también resultar de chapado demasiadas neuronas en la red (> 50.000 células / ml por placa), lo que resulta en el hacinamiento de las neuritas (Figuras0; 7B y 7C). Las imágenes borrosas pueden ser el resultado de desenfoque incorrecta y debe ser ajustado, el desenfoque en las imágenes que se muestran aquí se tomó con un underfocus dirigida de 7 m. Las imágenes se recogieron en ese desenfoque para asegurar un mayor contraste y la visibilidad de características ultraestructurales, sin embargo, un desenfoque inferior (es decir, 2-3 micras) también se podría utilizar para obtener detalles de mayor resolución de tales características.
Otros factores pueden contribuir a imágenes subóptimas. Por ejemplo, aunque puede ser tentador usar otras funciones de la máquina de la vitrificación, en particular la función secante semi-automatizado, en lugar de transferencia manual descrito en el presente documento, esto dio resultados no deseados. Transferencia de doble cara se intentó inicialmente utilizando esta característica semi-automatizado, en el que la máquina de vitrificación (en lugar del usuario) borra la muestra directamente usando parámetros tales como el tiempo y el número de manchas de secante tal como se especifica por el usuario. Sin embargo, AFimágenes ter dichas muestras, se encontró que todas las neuronas habían lisado abierta, derramando su contenido (cuerpos multivesiculares, etc.) Por lo tanto, la máquina de vitrificación se utiliza mejor en este caso para su cámara de humedad a la temperatura controlable en el que la muestra se borró antes de sumergirse-congelación. El mantenimiento de la muestra en un estado tal (con humedad establecido cerca de 100%), se reduce la pérdida de agua durante la preparación y ayuda a asegurar hielo vítreo óptima post-congelación 3,7.
Idealmente, para minimizar la exposición de las neuronas a las perturbaciones externas, que deben ser cultivadas en una incubadora de CO2 (temperatura ajustada a 37 ° C) en estrecha proximidad a la habitación con la máquina de la vitrificación, y la temperatura para este aparato debe establecerse en 37 ° C antes de parpadear-congelación de las neuronas en las redes de EM. Se debe evitar la exposición de las neuronas a las grandes fluctuaciones de temperatura antes de la secante. En este informe, la temperatura se fijó a 32 ° Cpara fines secante; neuronas se cultivaron en un edificio diferente y un lapso de tiempo de ~ 10 min ocurrieron entre llevar las placas de las neuronas de una habitación a otra. Se tuvo cuidado para proteger las muestras en un recipiente semi-aislante resistente al agua durante el proceso de transporte. Un cambio similar en la temperatura y la concentración de CO 2 (como la experimentada por las neuronas antes de la transferencia / inmersión de congelación) se producen en las neuronas cada ~ 2 días cuando se toman las neuronas fuera de la cámara de incubación de sus medios de comunicación para ser cambiadas en virtud de la seguridad de la biotecnología capó, como se hace normalmente para cultivos neuronales. Esto no se ve a resultar en efectos tóxicos para la célula.
En cuanto a la presencia de lo que parecen ser los gránulos dentro de las mitocondrias de las neuritas «electrón-denso, existen varios informes contradictorios. Tales gránulos se encuentran en una variedad de diferentes tejidos, células no neuronales específicamente. Son percibidos como sumidero de cationes que regulan la iónica interna enentorno de la mitocondria. Al parecer, también para crear sitios de contacto entre las membranas mitocondriales interna y externa en la que las enzimas pueden funcionar de manera eficiente 16.
Los estudios experimentales indican que el calcio y otros cationes divalentes se acumulan en las mitocondrias cuando estos iones están presentes en el baño de fluido, ya sea mitocondrias aisladas o células intactas. Parece probable que los iones están unidos orgánicamente a los gránulos intra-mitocondriales pre-existentes. Se sugiere, por lo tanto, que estos gránulos están vinculadas a la regulación del ambiente iónico interna de la mitocondria 31.
Además, las neuronas en nuestra preparación se cultivaron en redes de EM durante 14 días, el tiempo de lo que es típico para los propósitos de crecimiento de neuritas 15,36, antes de la formación de imágenes por cryoEM / ET. Se ha informado de que hay un dramático incremento en la concentración de calcio intracelular en las neuronas de edad en comparación con Youn g neuronas 32. Por lo tanto, es plausible que las mitocondrias en las neuritas de estas neuronas de edades comprendidas serían mostrar gránulos mitocondriales no necesariamente como una señal de estrés, sino más bien debido a que poseen una mayor presencia de calcio intracelular.
Gránulos mitocondriales electrón-densos también se han reportado en fibroblastos embrionarios de ratón cultivadas en-cultura y reflejada por la misma tecnología (crio-tomografía de electrones) tal como se utiliza en nuestro manuscrito 20. Estas células no mostraron patrones típicos de cambio ultraestructural asociados con la lesión celular, tales como la interrupción del citoesqueleto y vacuolización del citoplasma. Del mismo modo, dentro de nuestras neuritas como se visualiza por cryoET, no observamos un citoesqueleto perturbado que de otra forma se asocia con la toxicidad celular. Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, llegamos a la conclusión de que las neuronas en nuestra preparación no mostraron gránulos mitocondriales como resultado del estrés o de toxicidad.
contenido "> Para esterilizar la superficie de la rejilla EM para evitar la contaminación de las neuronas, y también para generar una superficie favorable, hidrófilo en la parrilla de EM a la que el poli-L-lisina podría adherirse, en llamas las redes de EM antes de chapado neuronas se encontró que es ventajoso. esterilización UV no se eligió ya que requiere irradiación de la red durante un tiempo más largo (por ejemplo, 20-30 minutos) en la campana de bioseguridad. Entonces, tendrían que ser re-expuestos de nuevo para el medio ambiente de las rejillas cuando siendo resplandor -descargado con fines de hidrofilizando la superficie de la rejilla. Glow-descargando la red asegura que el recubrimiento de poli-lisina posterior efectivamente 'palo' a la red. La técnica de la llama las redes es ventajoso ya que combina tanto el paso hidrofilizante y etapa de esterilización en uno. neuronas primarias son conocidos por ser más sensible que las líneas de células tumorales a base de y es crucial para mantener su entorno (rejilla, placa de Petri) como estéril como sea posible.(figuras 3C y 5), que cubre más del área de la cuadrícula para los propósitos de seleccionar qué neuritas a la imagen . Luego, en 2-D imágenes de crio-EM se pueden tomar a intervalos y digitalmente cosen juntos en un montaje (Figura 6). Esta técnica puede ser útil para las características ultraestructurales, tales como la organización de microtúbulos, sobre un área mayor que la de una única imagen de la crio-EM.
Tomar una dosis baja de, imágenes de baja magnificación (Figuras 3C y 5) también es útil en la identificación de las áreas de la neuritas que sean coherentes de diámetro a través de la película de carbón perforado (tanto en los agujeros y en todo el carbono) y por lo tanto más ideal para la imagen y los análisis posteriores. Ampliación de neuritas sobre los agujeros de la película de carbono se ve típicamente en mayor neurITES (Figura 5) con el material claramente más interna que neuritas más delgadas (Figura 3C). Este fenómeno se cree que ocurre debido a la falta de soporte físico en los agujeros de la película de carbono. Cuando se retira la rejilla EM desde el plato en la que las neuronas estaban creciendo, y posteriormente se transfirió desde la parte trasera, con neuritas más masa interna (Figura 5) que otros (Figura 3C) tienden a ampliar y / o se hunda en los agujeros. Aunque esto parece ser un artefacto, que tiene un beneficio como para mostrar más claramente los componentes internos de la neurita. El uso de una película de carbono continua superpuesto en esta película de carbón perforado puede ayudar a evitar este problema en futuros estudios. Esta configuración se intentó al principio, pero resultó en hielo vítreo demasiado grueso para la imagen. Los ensayos posteriores con diferentes espesores de carbono continua superpuesta en la parrilla de EM pueden necesitar más investigaciones.
Un imporbeneficio tante del método actual es que la organización espacial de los componentes de la célula dentro de la neurita puede ser visualizado en la escala nanométrica mediante la adopción de varias imágenes 2-D de una sola de las neuritas en diferentes ángulos de inclinación, y la reconstrucción de esta pila de imágenes en un tomograma. Características estructurales individuales pueden entonces ser anotado manualmente para cada rebanada 2-D de la pila 3-D en diferentes colores usando el software apropiado (véase la Tabla de Materiales y Reactivos) como se muestra para un axón de una rata E18 dorsal ganglio de la raíz (DRG) neurona (Figura 4) y una de las neuritas de una rata E18 neuronas del hipocampo (Figura 8).
Al elegir a tomar una imagen cada 5 grados durante la serie de posiciones, en lugar de 1 ó 2 °, se recogen menos imágenes, pero una dosis más alta de electrones se pueden utilizar por imagen. Esto se traduce en un mayor contraste y menos ruido en las imágenes en bruto. Esto es mejor para fines de reconstrucción (alineación de correlación cruzada como un pt EP) y la anotación tomografía posterior, que se realiza por mano para cada imagen que comprende la pila de tomografía en la dirección z. La elección de un tamaño de incremento también depende del tamaño de la muestra; entre diferentes ángulos de inclinación, las muestras más grandes no pueden variar como mucho. En este caso, se pensó que el uso de un tamaño de incremento más grande (5 °) a ser más adecuado debido al tamaño relativamente grande de muestras de la neurita.
Por otra parte, la adición de marcadores fiduciales de oro a la red EM ayudaría para la alineación de imagen fina si se desea. Marcadores de referencia no se utilizan debido a que la muestra es relativamente grande en comparación con otras muestras crio-EM (virus o proteínas en el aislamiento) y mostró un alto contraste con una variedad de características estructurales que se podría utilizar para la alineación apropiada de cada una de las imágenes 2-D (que comprende la pila 3-D) por correlación cruzada. La pila de imagen resultante fue bien alineado con este enfoque, y útil para su posterior anotación de color 3-D.
ent "> En estudios futuros, utilizando un microscopio con un filtro de energía podría reducir el ruido causado por los electrones de manera inelástica dispersos pero esta característica puede no estar fácilmente disponibles en la mayoría de las instalaciones de microscopía electrónica. Nuestro procedimiento revela lo que las imágenes pueden ser el resultado de un microscopio estándar de 200 kV sin filtro de la energía, que puede ser más fácil de adquirir para la comunidad de las neurociencias en general.El protocolo descrito aquí se ha optimizado para la preparación y la visualización de ambas ratas axones DRG embrionarias y neuritas de hipocampo utilizando equipos disponibles comercialmente para la crio-EM y la crio-ET. Una de las principales ventajas de esta técnica es que produce información estructural de neuritas enteros, no seccionada, blanqueado o tratada por diversos reactivos químicos con el fin de ver su ultraestructura. Hemos demostrado cómo la crio-ET es un particular método excelente para su uso en los análisis ultraestructurales futuras de las neuronas en un estado de situación próxima al nativo para examinar el impactode enfermedad neurológica en la estructura de las neuritas.
Los números de acceso de Microscopía Electrónica de Banco de datos para las tomografías 3-D como reportados en este trabajo son las siguientes: Para el hipocampo de neuritas de rata como se muestra en la Figura 8 y en el vídeo principal (de 8:45-09:01), la EMDB número de acceso es EMD-5887. Para la rata de la raíz dorsal ganglio de neuritas como se muestra en la Figura 4 y en el vídeo principal (de 09:02-9:15), el número de acceso EMDB es EMD-5885.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta investigación ha sido apoyada por las subvenciones del NIH (PN2EY016525 y P41GM103832). SHS fue apoyado por una beca del Programa de Postgrado de Formación Nanobiología Interdisciplinario del Centro WM Keck Interdisciplinarias Bioscience Formación de la Costa del Golfo de Consorcios (NIH Grant N º T32EB009379).
SHS disecado, creció y DRG y las células del hipocampo vitrificada; recolectó datos crio-ET de DRG y axones del hipocampo crio-EM y, reconstruido y color anotado la serie de inclinación. MRG disecada y proporcionó las células del hipocampo en el laboratorio del MNR. SC asistido en la anotación serie inclinación. SHS fue entrenado por CW sobre la forma de diseccionar y crecer neuronas. SHS, WCM y WC concibieron los experimentos. SHS preparado el manuscrito con el aporte de otros autores.
Este video fue filmado en el Centro de la Imagen y Celular NanoAnalytics (C-CINA) del Biozentrum de tque la Universidad de Basilea. C-CINA se integra en el Departamento de Ciencia e Ingeniería de Biosistemas (D-BSSE) de la ETH Zürich, ubicado en Basilea, Suiza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
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