Beredning av primär nervceller för Visualisering neuriter i en Frozen-hydrerad stat Använda Cryo-elektrontomografi
Summary
För att bevara neuronala processer för ultra analys, beskriver vi ett protokoll för plätering av primära neuroner elektronmikroskopi nät följt av flash frysning, vilket ger prov suspenderade i ett lager av glaskroppen is. Dessa prover kan undersökas med en Cryo-elektronmikroskop för att visualisera strukturer på nanometerskala.
Abstract
Neurites, både dendriter och axoner, är neuronala cellulära processer som möjliggör ledning av elektriska impulser mellan nervceller. Definiera strukturen på neuriter är avgörande för att förstå hur dessa processer flytta material och signaler som stöder synaptisk kommunikation. Elektronmikroskop (EM) har traditionellt använts för att bedöma de ultrastrukturella funktioner inom neuriter, men kan exponering för organiska lösningsmedel under uttorkning och harts inbäddning snedvrida strukturer. En viktig otillfredsställda mål är utformningen av förfaranden som möjliggör strukturella utvärderingar som inte påverkas av dessa artefakter. Här har vi etablerat en detaljerad och reproducerbar protokoll för att odla och flash-frysa hela neuriter av olika primära nervceller elektronmikroskopi nät följt av deras granskning med kryo-elektron tomografi (kryo-ET). Denna teknik gör det möjligt att 3-D visualisering av frysta, hydratiserade neuriter på nanometer upplösning, underlättar Assessment av deras morfologiska skillnader. Vår protokoll ger en helt ny bild av dorsala ganglion (DRG) neurites, och en visualisering av hippocampus neuriter i sin nästan infödda tillstånd. Som sådana dessa metoder skapar en grund för framtida studier på neuriter på både normala nervceller och de som påverkas av neurologiska sjukdomar.
Introduction
Nervceller fastställa komplexa kretsar avgörande för funktionen av de centrala och perifera nervsystemen genom att utarbeta dendriter för att få information och axoner, ofta ganska långa, för att kommunicera med nervceller nedströms. Neuritutväxt spelar en grundläggande roll under fosterutvecklingen och neuronal differentiering och underhåll av neuriter stöder kritiskt funktionen av nervsystemet. Neuritic processer har också kritiskt i neuronal skada och förnyelse, samt nervsystemet. Studien av neuronal arkitektur är avgörande för att förstå både normal och sjuk hjärna. Lyckligtvis fysiologiskt relevanta neuronala cellodlingssystem finns som kan rekapitulera komplexa och heterogena cellstrukturer. Behövs Utifrån klarlägga solida experimentella plattformar, effektiva visualiseringsstrategier som möjliggör kvalitativa och kvantitativa analyser av neuronal morfologi. Speciellt användbar skullevara en detaljerad metod som ger en enhetlig plattform för visualisering neuriter, både axoner och dendriter på nanometerskala.
Traditionell elektronmikroskopi kräver användning av organiska lösningsmedel under uttorkning och harts inbäddning, vilket kan framkalla snedvridningar i proverna från sitt sanna tillstånd. Hittills är de flesta strukturella karakteriseringar på nanometerskala baserad på större celler eller vävnader som utsätts för sådana starka kemikalier – vilket begränsar tolkningen av resultaten 4,9,25. Dessutom för elektronstrålepenetration är sektione krävs för organismer eller cellulära utsprång som uppvisar en tjocklek som är större än 1 | im 12. Slutligen sektionerad eller slipat vävnad resulterar i samling av diskreta segmentspecifika datamängder, vilket gör besvärlig definitionen av den långsträckta egenskap hos neuriter. Även för Cryo-EM, där snitt en frusen hydrerad exemplar är möjligt, introducerar metoden komprimerings artiffungerar 1.
Under senare år har forskarna lärt sig hur man odlar hippocampus nervceller direkt på EM-nät och flash-frysa dem i flytande etan att sedan visualisera neuriter använder kryo-ET 8,10,18,23. Men sådana studier antingen använda en specialanpassad produkt 10,23, eller saknar information om läsk steg för att generera tillräckligt tunn glaskroppen is för rutin visualisering 8,18. Rekommenderas till exempel en studie av användningen av 30 till 40 sek för läsk EM-galler 10, dock är det här värdet inte optimerade för allmänt bruk men är specifikt för att skräddarsydd plunge frysning enhet. Med hjälp av en specialanpassad produkt snarare än ett kommersiellt tillgängligt en 17 för att bibehålla fuktigheten innan störta-frysa provet skulle kunna utgöra ett hinder för utbredd reproducerbarhet.
Även om dessa studier har varit banbrytande i att visualisera neuriter med Cryo-ET, har vi tagit ett steg längre för att utforska applicability av kryo-ET till en mängd olika neuronala prover (hippocampus och dorsal root ganglion neurons). Dessutom diskuterar vi både optimala och suboptimala resultat, samt de potentiella artefakter som man kan stöta på med hjälp av Cryo-ET för sådana exemplar.
Definiera en detaljerad teknik för att bevara och visualisera hela neuriter på nanometerskala i en nära-naturliga tillstånd skulle öka möjligheten för fler forskare att utföra ultrastrukturella studier. För detta ändamål beskriver vi ett effektivt och detaljerat protokoll med användning av kommersiellt tillgänglig utrustning för framställning av icke-fixerade, ofärgade neuroner att visualisera neuriter. Detta är ett viktigt första steg mot att uppgifter om ultra friska neuriter och att lägga grunden för att förstå vilka strukturella skillnader finns i nervösa modeller systemet sjukdom. Eftersom kryo-ET kan lösa ofixerade, ofärgade neurite funktioner i 3-D på nanometerskala, kommer metoden att göra det möjligt att aldrig varadärför att definiera neuritic arkitektur 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visar att rått embryonala nervceller (dorsala ganglion och hippocampus) kan odlas på guld elektronmikroskopi (EM) nät och fryst i glaskroppen is tunt nog för sina neuriter som ska avbildas med Cryo-EM 2-D och 3-D-kryo- ET. Medan hippocampus neuriter har tidigare avbildas med Cryo-ET 8,10,18,23, ett protokoll tillräckligt detaljerade för framgångsrik replikering med hjälp av kommersiellt tillgängliga enheter har saknats. Dessutom, medan deras forskning har börjat använda sig av kryo-ET för att v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har fått stöd av NIH bidrag (PN2EY016525 och P41GM103832). SHS fick stöd av ett stipendium från nanobiology Interdisciplinary Graduate träningsprogram för WM Keck Centrum för Tvärvetenskaplig Bioscience Utbildning av Gulf Coast konsortierna (NIH Grant No T32EB009379).
SHS dissekerade, växte och förglasat DRG och hippocampus celler, samlas Cryo-EM och Cryo-ET data för DRG och hippocampus axoner, rekonstrueras och färg-kommenterad tilt serien. MRG dissekerade och förutsatt hippocampus celler i MNR labb. SC hjälp med lutning serien anteckning. SHS var utbildad av CW om hur man dissekera och odla nervceller. SHS, WCM och WC tänkt experimenten. SHS förberett manuskriptet med input från andra författare.
Den här videon filmades vid Centrum för Cellular Imaging och NanoAnalytics (C-CINA) i Biozentrum av tHan University Basel. C-CINA är integrerad i avdelningen för Biosystems och informationsteknik (D-BSSE) av ETH Zürich, som ligger i Basel, Schweiz.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
