Clostridium difficile er en patogen bakterie, der er en streng anaerob og forårsager antibiotika associeret diarré (AAD). Her, fremgangsmåder til isolering, dyrkning og vedligeholdelse C. difficile vegetative celler og sporer er beskrevet. Disse teknikker kræver en anaerob kammer, der kræver regelmæssig vedligeholdelse for at sikre ordentlige forhold for optimal C. difficile dyrkning.
Clostridium difficile er en Gram-positiv, anaerob, sporogenic bakterie, der er hovedansvarlig for antibiotika associeret diaré (AAD) og er en betydelig nosokomiel patogen. C. difficile er notorisk vanskeligt at isolere og dyrke og er yderst følsom over for selv lave niveauer af ilt i miljøet. Her metoder til isolering C. difficile fra fækale prøver og efterfølgende dyrkning af C. difficile til forberedelse af glycerolstamopløsninger til langtidsopbevaring præsenteres. Teknikker til at forberede og optælle Spore lagre i laboratoriet til en række downstream-applikationer, herunder mikroskopi og dyreforsøg er også beskrevet. Disse teknikker kræver en anaerob kammer, som opretholder en konsekvent anaerobt miljø for at sikre ordentlige forhold for optimal C. difficile vækst. Vi giver protokoller til overførsel af materialer ind og ud af kammeret uden CAhjælp betydelig forurening ilt sammen med forslag til regelmæssig vedligeholdelse kræves for at opretholde den rette anaerobt miljø for effektiv og konsekvent C. difficile dyrkning.
Clostridium difficile er en Gram-positiv, sporedannende bakterie, der er en obligat anaerob og en potentielt fatal gastrointestinal patogen for mennesker og dyr. Oprindeligt beskrevet i 1935 som en kommensal organisme findes i fækale prøver fra nyfødte 1 C. difficile blev senere påvist at være det agens af pseudomembranøs colitis forbundet med antibiotisk behandling 2. C. difficile infektioner (CDI) er kendetegnet typisk ved antibiotisk behandling, der resulterer i forstyrrelse af normale colonflora, at skabe en niche for C. difficile at trives 2. C. difficile sendes som en hvilende spore via fækal-orale vej og derefter spirer i mave-tarmkanalen, der producerer vegetative celler i stand til at generere flere toksiner og forårsage alvorlig sygdom og colitis 3. CDI er ofte resistente over for konventionelle behandlinger, og disse iinfektioner er ofte gentaget 4. Som et resultat, CDI er ansvarlige for op til 4,8 milliarder dollar i udgifterne til sundhedsvæsenet i USA 5-7.
C. difficile er meget følsomt over for selv lave niveauer af oxygen i miljøet. For C. difficile at forblive i miljøet og effektivt overføres fra vært til vært, dannelsen af en metabolisk inaktive spore er kritisk 8. Fordi laboratoriet vedligeholdelse og manipulation af C. difficile kræver en kontrolleret anaerobt miljø, disse teknikker kræver anvendelse af et anaerobt kammer. Brug af anaerobe kamre har resulteret i øget nyttiggørelse og isolering af obligate anaerober 9-11, og har givet en række molekylære teknikker, der skal udføres i en anaerob atmosfære.
Ud over C. difficile, den anaerobe kammer brug og vedligeholdelse beskrevet her gældertil andre obligate anaerobe såsom andre Clostridium arter (f.eks C. perfringens), andre gastrointestinale arter (f.eks Bacteroides arter 12) og parodontale patogener (f.eks Peptostreptococcus arter 13).
De her beskrevne metoder giver mulighed for enkel og hurtig genopretning af C. difficile fra en række fækale prøver, herunder mennesker, mus og hamstere, samt langtidsopbevaring C. difficile glycerol eller spore bestande. C. difficile kan være en vanskelig organisme at dyrke, men omhyggelig vedligeholdelse af et anaerobt miljø og anvendelse af aseptiske teknikker kan give for robust vækst og en reduktion i forurening.
Anaerobe kamre: Overvejelser og vedligeholde…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Coy Laboratories for venligt at levere billeder af den anaerobe kammer. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud DK087763 (SMM) og en STEP / HHMI Curriculum Development Fellowship (ANE).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
NaCl | Fisher | S27 | |
MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
ᴅ-Fructose | Fisher | L96 | |
Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
ᴅ-cycloserine | Sigma | C6880 | |
Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
Proteose Peptone | BD | 211684 | |
(NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
Tris base | Fisher | BP152 | |
Agar | BD | 214010 | |
L-cysteine | Sigma | C7755 | |
BactoPeptone | BD | 211684 | |
Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
NaCl | Fisher | S27 | |
KCl | Fisher | P217 | |
Glycerol | Fisher | BP2291 | |
Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
Materials | |||
TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |