Vi præsenterer metoder til at undersøge effekten af PSM'er og andre toksiner udskilt af<em> Staphylococcus aureus</em> På neutrofiler ved hjælp af flowcytometri og fluorescens mikroskopi.
Vi præsenterer metoder til at undersøge effekten af phenol opløselige modulins (PSM'er) og andre toksiner produceres og udskilles af Staphylococcus aureus på neutrofiler. At studere virkningerne af PSM'er på neutrofiler vi isolerer friske neutrofiler hjælp densitetsgradientcentrifugering. Disse neutrofiler er fyldt med et farvestof, der fluorescerer ved calciummobilisering. Aktiveringen af neutrofiler ved PSM'er indleder en hurtig og forbigående stigning i den frie intracellulære calciumkoncentration. I en flowcytometri eksperiment denne hurtig mobilisering kan måles ved overvågning af fluorescensen af et præ-loadet farvestof, der reagerer på den forøgede koncentration af frit Ca2 +. Med denne metode kan vi bestemme PSM nødvendige koncentration for at aktivere neutrofile, og måle effekten af specifikke og generelle inhibitorer af neutrofil aktivering.
For at undersøge ekspressionen af PSM'erne i intracellulære rum, we har konstrueret reporter fusioner af initiativtagerne til PSMα operon til GFP. Når disse reporter stammer af S. aureus er fagocyteret af neutrofiler, kan induktionen af ekspression observeret ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
Neutrofile (PMN'er) er professionelle fagocytter, der spiller en central rolle i det medfødte immunforsvar mod Staphylococcus aureus 1.. Den konstante kamp mellem vært og mikrobe har ført til et våbenkapløb af begge. Senest EF-associerede (CA) stammer af meticillin resistente S. aureus (MRSA) er dukket op, synes at være meget effektive i omgåelse af neutrofile drab 2,3. Overdreven phenol opløselig modulin (PSM'erne) fremstilling af CA-MRSA er blevet forbundet med højere virulens 4,5. Humane neutrofiler kan genkende disse PSM'er via FPR2 som fører til aktivering af denne G-protein koblet receptor 6.. En af de tidligste begivenheder mobilisering af intracellulære lagre af calcium (Ca 2 +). Ca2 + virker som en sekundær budbringer for en række effektorfunktioner PMN'er herunder degranulering og fagocytose 7.. Derfor Ca 2 + er en meget følsom indikator forfunktionsevne af PSM'er at aktivere PMN'er. At undersøge virkningerne af PSM'er på neutrofiler, er friske neutrofiler isoleres og fyldt med et farvestof, som fluorescerer ved calciummobilisering. I et flowcytometri eksperiment denne hurtig mobilisering kan måles. Ved hjælp af denne metode, er det muligt at studere de direkte virkninger af toksiske og andre komponenter på neutrofiler, og bestemme den laveste koncentration, hvor disse er aktive. For os er det et meget nyttigt redskab til at undersøge effekten af mange proteiner produceret af S. aureus er involveret i immun unddragelse, såsom FPR2 inhiberende protein (FLIPR) 8, FLIPR-lignende 7, og Kemotaksi hæmmende protein af Staphylococcus aureus (spåner) 9.. Alle disse proteiner har vist sig at hæmme calciummobilisering i neutrofiler ved binding til receptoren anerkende agonist.
For nylig har vores gruppe beskrevet, at PSM'er funktionelt hæmmes af serumlipoproteiner 10 </ Sup>. Disse lipoproteiner er rigeligt til stede i blod og humant væv, hvilket indikerer, at PSM'er udøve deres funktion primært i det intracellulære miljø. Tilgængeligheden af calciummobilisering assayet tilladt os at præcist at måle effekten af serumlipoproteiner på aktivering af neutrofiler af PSM'er angivet ved betydelig hæmning af meget lave koncentrationer af serum.
Eftersom PSM'er funktionelt inhiberes af serum, vi antager, at der er en vigtig funktion for PSM'er som intracellulære toksiner. Vi har derfor forsøgt at fastlægge den rolle PSM'er efter fagocytose. For at undersøge ekspressionen af PSM'erne i intercellulære rum, vi har opbygget reporter fusioner af initiativtagerne til psmα operon til GFP. Når disse reporter stammer af S. aureus blev fagocyteret af neutrofiler, blev induktionen af udtrykket observerbare hjælp fluorescensmikroskopi 10.. Naturligvis er denne technique tillader undersøgelse af ekspressionen af et stort antal gener i S. aureus eller andre patogener efter fagocytose. Eftersom for S. aureus overleve i intercellulære niche er meget vigtigt at overvinde det medfødte immunsystem 11 10 12, studere rollen af gener aktiveres i denne niche er yderst relevant for forståelsen af virulens.
I de her beskrevne metoder nogle trin er meget kritisk. Vi vil fremhæve disse her.
Til isolering af neutrofiler ved densitetsgradientcentrifugering er det vigtigt ikke at forstyrre lagene under eller efter centrifugeringstrin. Når sugning neutrofilerne hjælp af en plastic pipette, så sørg for ikke at presse ballonen, mens i det lag af celler, vil så skubbe væske forstyrre lag. Også visuelt inspicere pelleten af neutrofiler efter osmotisk chok og centrifugeringstrin. Hvis pellet…
The authors have nothing to disclose.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Fluo-3, AM | Molecular Probes / Life Technologies | F-1241 | |
Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | density 1.077 g/ml |
Histopaque | Sigma | 11191 | density 1.119 g/ml |
RPMI 1640 | Gibco, Life Technologies | 52400-025 | contains 25 mM HEPES and L-glutamine |
Leica TCS SP5 microscope | Leica Microsystems, The Netherlands | TCS SP5 | objective: HCX PL APO 40X/0.85 |
FACSCalibur | BD Biosciences | FACSCalibur | Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process |