Summary

Изучение взаимодействий<em> Золотистый стафилококк</em> С нейтрофилами с помощью проточной цитометрии и микроскопии Длительная

Published: July 17, 2013
doi:

Summary

Мы представляем методы для изучения эффект PSMs и других токсинов выделяемый<em> Золотистый стафилококк</em> На нейтрофилах использованием проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии.

Abstract

Мы представляем методы для изучения влияния фенола растворимые модулинов (PSMs) и другие токсины, вырабатываемые и выделяемые золотистый стафилококк на нейтрофилы. Для изучения влияния PSMs на нейтрофилы мы изолируем свежих нейтрофилов использованием центрифугирования в градиенте плотности. Эти нейтрофилы загружаются с красителем, который флуоресцирует при мобилизации кальция. Активацию нейтрофилов PSMs инициирует быстрое и кратковременное повышение в свободном внутриклеточной концентрации кальция. В эксперименте проточной цитометрии этой быстрой мобилизации может быть измерена путем мониторинга флуоресценции предварительно загруженных краситель, который реагирует на повышение концентрации свободного Ca2 +. С помощью этого метода можно определить PSM концентрации, необходимой для активации нейтрофилов и измерить эффекты конкретные и общие ингибиторы активации нейтрофилов.

Чтобы исследовать экспрессию PSMs в межклеточном пространстве, шэлектронной построили репортер слитых от промотора из PSMα оперон, чтобы GFP. Когда эти репортером штаммы S. стафилококк фагоцитированы нейтрофилах, индукция выражение может быть, наблюдаемые с помощью флуоресцентной микроскопии.

Introduction

Нейтрофилы (PMNs) профессиональные фагоциты, которые играют ключевую роль в врожденную иммунную ответ против золотистый стафилококк 1. Постоянном битве между хоста и микроба привела к гонки вооружений того и другого. В последнее время сообществу-связанного (CA) штаммов Meticillin устойчивыми штаммами S. стафилококк (MRSA) появились, которые, кажется, очень эффективным в обход Совета нейтрофилом убийству 2,3. Чрезмерные фенолом растворимые модулин (PSMs) производство CA-MRSA была связана с более высокими вирулентности 4,5. Человека нейтрофилах могут распознать эти PSMs через FPR2, которые приводят к активация этого G-белком рецептор 6. Один из самых ранних событий является мобилизацией внутриклеточного МАГАЗИНЫ кальция (Ca 2 +). Са 2 + выступает в качестве вторичного посланник для разнообразие эффекторных функций из PMNs в том числе дегрануляции и фагоцитоз 7. Поэтому Ca 2 + является очень чувствительным индикаторомфункциональную способность PSMs, чтобы активировать PMNs. Для изучения эффекты из PSMs на нейтрофилах, свежий нейтрофилы изолированы и загружается с краситель, который флуоресцирует на мобилизации кальция. В эксперименте по проточную цитометрию эту быстрой мобилизации может быть измерена. Используя этот метод, оно является возможным изучать прямые эффекты из токсичные и с другими компонентами на нейтрофилы, и определить самую низкую концентрация, при которой эти являются активными. Для нас это является очень полезный инструмент, чтобы изучения влияния многих белки, продуцируемые S. стафилококк, участвующих в иммунном уклонением, такие, как FPR2 ингибиторного белка (FLIPR) 8, FLIPR-подобный +7, и Хемотаксис ингибиторного белка из золотистый стафилококк (CHIPS) 9. Все эти белки, были показанный, чтобы ингибировать кальций мобилизация в нейтрофилах путем связывания с рецептор признавая агонистом.

В последнее время наша группа описано, что PSMs являются функционально ингибируются сывороточные липопротеины +10 </ Вир>. Эти липопротеины в большом количестве присутствуют в пределах в кровь и человеческой ткани, указывая, что PSMs оказывают свое функция в первую очередь в внутриклеточный окружающую среду. Доступность из анализе мобилизацию кальция позволила нам точно измерить эффект из сывороточные липопротеины на активации нейтрофилах по PSMs, на что указывает значительный ингибирование с помощью очень низких концентрациях из сыворотке крови.

Так как PSMs являются функционально ингибируется при добавлении сыворотки к мы предположили, что там является важной функцией для PSMs как внутриклеточные токсинов. Поэтому мы стремились, чтобы определить роли PSMs после того, как фагоцитоза. Чтобы исследовать выражением PSMs в межклеточном пространстве, мы построили репортером слияний от промотора из psmα оперон, чтобы GFP. Когда эти репортером штаммы S. стафилококк были фагоцитированы нейтрофилах, индукция выражения мнения было наблюдаемыми с помощью флуоресцентной микроскопии +10. Очевидно, что эта TEChnique позволяет изучением выражение из большого числа из гены в S. стафилококк или других патогенами после того, как фагоцитоза. Так как для S. стафилококк выживших в межклеточном нишу очень важна, чтобы преодолеть врожденная иммунная система 11 10 12, изучая роли генов активированы в этой нише является высоко, важной для понимания его вирулентность.

Protocol

1. Выделение PMNs из крови человека по центрифугирование в градиенте плотности Draw 5 9 мл пробирках из гепаринизированной венозной крови. Подготовьте двойной слой Ficoll градиенты (4 градиентов для +5 пробирки для крови) в качестве следующим образом: заливают 12 мл от плотности, +1,119 г /…

Representative Results

Проточной цитометрии анализе для оценки мобилизации кальция в человеческих PMNs Инкубирующие нейтрофилах с концентрацией серия из синтетический PSMα3 что приводит к быстрому активация как измерено кальций флюс, которая показана по увеличение в сигнале в FL-1. Предварительно…

Discussion

В способах, описанных здесь некоторых шаги очень критическим. Мы будем выделить эти здесь.

Для изоляции нейтрофилах центрифугированием в градиенте плотности оно имеет важное значение, чтобы не потревожить слои, во время или после того, как центрифугирование шагов. Когд?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> RN был частично финансируется за счет Марии Кюри европейские Re-интеграции грантов (ERG) из Седьмая рамочная Европейского Сообщества Программой, номером проекта 268324.</p>

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Fluo-3, AM Molecular Probes / Life Technologies F-1241  
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-5442-03 density 1.077 g/ml
Histopaque Sigma 11191 density 1.119 g/ml
RPMI 1640 Gibco, Life Technologies 52400-025 contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope Leica Microsystems, The Netherlands TCS SP5 objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur BD Biosciences FACSCalibur Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process

References

  1. Rigby, K. M., DeLeo, F. R. Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections. Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).
  2. Voyich, J. M., et al. Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils. The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).
  3. Kobayashi, S. D., et al. Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus. J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).
  4. DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus. The Lancet. 375, 1557 (2010).
  5. David, M. Z., Daum, R. S. Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic. Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).
  6. Kretschmer, D., et al. Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus. Cell Host & Microbe. 7, 463 (2010).
  7. Prat, C., et al. A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR. J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).
  8. Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1. The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).
  9. de Haas, C. J., et al. Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent. The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).
  10. Surewaard, B. G. J., et al. Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles. PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).
  11. Kubica, M., et al. A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages. PLoS ONE. 3, e1409 (2008).
  12. Surewaard, B. G. J., et al. Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis. Cellular Microbiology. , (2013).
  13. Queck, S. Y., et al. RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus. Molecular Cell. 32, 150 (2008).
  14. Baban, C. K., et al. Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo. J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).

Play Video

Cite This Article
Surewaard, B. G., van Strijp, J. A., Nijland, R. Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (77), e50788, doi:10.3791/50788 (2013).

View Video