Vi presenterar metoder för att studera effekten av PSM och andra gifter som utsöndras av<em> Staphylococcus aureus</em> På neutrofiler med hjälp av flödescytometri och fluorescensmikroskopi.
Vi presenterar metoder för för att studera effekten av fenol lösliga modulins (PSM) och andra gifter som produceras och utsöndras av Staphylococcus aureus på neutrofiler. För att studera effekterna av de PSM om neutrofiler vi isolerar färska neutrofiler som använder centrifugering density gradient. Dessa neutrofiler är laddade med ett färgämne som fluorescerar upon calcium mobilisering. Den aktiveringen av neutrofiler genom PSM initierar en snabb och övergående ökning av den fria intracellulära kalcium koncentration. I ett flödescytometri experiment denna snabb mobilisering kan mätas genom övervakning av fluorescensen av en förladdad färgämne som reagerar på den ökade koncentrationen av fri Ca 2 +. Använda denna metod vi kan bestämma den PSM koncentration som är nödvändig för att aktivera neutrofila, och mäta effekterna av specifika och allmänna inhibitorer av den neutrofil aktiveringen.
För att undersöka uttrycket av de PSM i den intracellulära utrymmet, we har konstruerat reporter fusioner av den promotorn av den PSMα operonet till GFP. När dessa reporter stammar av S. aureus är fagocyteras genom neutrophils, kan den induktion av expression observeras användning av fluorescens mikroskopi.
Neutrofiler (PMNs) är professionella fagocyter som spelar en nyckelroll i den innate immunsvar mot Staphylococcus aureus 1. Den ständig kamp mellan värd och mikrob har lett till en kapprustning av båda. Som nyligen fått, community-associerade (CA) stammar av meticillin resistenta S. aureus (MRSA) har framkommit att verkar vara mycket effektiva i kringgående av neutrofil dödande 2,3. Överdriven fenol lösligt modulin (PSM) produktion av CA-MRSA har associerats med högre virulens 4,5. Humana neutrofiler kan känna igen dessa PSM via FPR2 som leder till aktivering av denna G-kopplad receptor för sex. En av de tidigaste händelserna är den mobilisering av intracellulära butiker av kalcium (Ca 2 +). Ca 2 + fungerar som en sekundär budbärare för en mängd olika effektorfunktionerna hos PMN: er inklusive degranulering och fagocytos syv. Därför Ca två + är en mycket känslig indikator på denfunktionell kapacitet av PSM för att aktivera PMN: er. För att studera effekterna av PSM på neutrofiler, är färska neutrofiler isoleras och laddad med ett färgämne som fluorescerar upon calcium mobilisering. I en flödescytometri experiment denna snabba mobilisering kan mätas. Använda denna metod, är det möjligt att studera de direkta effekterna av toxiska-och andra komponenter på neutrofiler, och bestämma den lägsta koncentration vid vilken dessa är aktiva. För oss, är det ett mycket användbart verktyg för att studera effekten av många proteiner producerade av S. aureus involverad i immun skatteflykt, såsom FPR2 inhiberande protein (FLIPR) 8, FLIPR-liknande 7, och Chemotaxis inhiberande protein av Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Alla dessa proteiner har visat sig inhibera kalciummobilisering i neutrofiler genom att binda till receptorn erkänna agonisten.
Nyligen, har vår grupp beskriven att PSM funktionellt är inhiberas av serumlipoproteiner 10 </ Sup>. Dessa lipoproteiner är högst närvarande i blodet och mänsklig vävnad, vilket indikerar att PSM utövar sin funktion främst i den intracellulära miljön. Tillgängligheten av kalciummobiliseringen analysen tillät oss att exakt mäta effekten av serumlipoproteiner på aktivering av neutrofiler av PSM, indikeras av den betydande hämning av mycket låga koncentrationer av serum.
Eftersom PSM är funktionellt hämmas av serum, hypotes vi att det är en viktig funktion för PSM som intracellulära toxiner. Vi försökte därför att bestämma rollen av PSM efter fagocytos. För att undersöka uttrycket av PSM i det intercellulära utrymmet, har vi konstruerat reporter fusioner av promotorn för psmα operonet till GFP. När dessa reporter stammar av S. aureus var fagocyteras av neutrofiler, var induktion av expression observeras med fluorescens mikroskopi 10. Uppenbarligen denna technique tillåter studiet av expression av ett stort antal gener i S. aureus eller andra patogener efter fagocytos. Eftersom för S. aureus överleva i intercellulära nisch är mycket viktigt att övervinna det medfödda immunförsvaret 11 10 12, studera rollen av gener aktiveras i denna nisch är mycket relevant för att förstå dess virulens.
I de metoder som beskrivs här några steg är mycket kritisk. Vi kommer att belysa dessa här.
För isolering av neutrofiler genom densitetsgradientcentrifugering är det viktigt att inte störa skikten under eller efter centrifugeringssteg. När aspirera neutrofiler med hjälp av en plast pipett, se till att inte pressa ballongen medan i lager av celler, kommer så mata vätska stör skikten. Också, visuellt inspektera pelleten av neutrofiler efter osmotisk chock och centrifugeringssteg. …
The authors have nothing to disclose.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Fluo-3, AM | Molecular Probes / Life Technologies | F-1241 | |
Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | density 1.077 g/ml |
Histopaque | Sigma | 11191 | density 1.119 g/ml |
RPMI 1640 | Gibco, Life Technologies | 52400-025 | contains 25 mM HEPES and L-glutamine |
Leica TCS SP5 microscope | Leica Microsystems, The Netherlands | TCS SP5 | objective: HCX PL APO 40X/0.85 |
FACSCalibur | BD Biosciences | FACSCalibur | Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process |