Aquí detallamos un método de cultivo de gérmenes dentales en rodajas mandíbula usando un cortador de tejidos. Este método permite un acceso único a los dientes durante el desarrollo, que proporciona una excelente oportunidad para la manipulación y el linaje de rastreo, no está disponible utilizando métodos de cultivo más tradicionales.
Cultura explante permite, por tanto, la manipulación de desarrollar órganos en puntos específicos de tiempo y es un método importante para el biólogo del desarrollo. Para muchos órganos es difícil acceder a los tejidos en desarrollo para permitir el monitoreo durante el cultivo ex vivo. El método de cultivo de cortes permite el acceso a los tejidos para que los movimientos morfogenéticos pueden ser seguidos y poblaciones específicas de células pueden ser objeto de manipulación o rastreo de linaje.
En este trabajo se describe un método de cultivo de cortes que ha sido muy exitoso para el cultivo de los gérmenes de los dientes en una amplia gama de especies. El método proporciona un excelente acceso a los gérmenes de los dientes, que se desarrollan a un ritmo similar al observado in vivo, rodeado de los otros tejidos de la mandíbula. Esto permite interacciones de tejido entre el diente y el tejido circundante a controlar. Aunque este documento se concentra en los gérmenes de los dientes, el mismo protocolo se puede aplicar a seguir el desarrollo de un númerode otros órganos, como las glándulas salivales, el cartílago de Meckel, glándulas nasales, lengua y orejas.
Para un número de experimentos es importante ser capaz de cultivo de tejidos ex vivo para seguir el desarrollo. Cultura de desarrollar tejido proporciona acceso a determinados períodos de desarrollo y permite la manipulación de los genes por la adición de factores al medio de cultivo, o en perlas cargadas, y por el uso de la transfección y la electroporación 1. Para muchos experimentos es importante ser capaz de visualizar el tejido a medida que crece, por ejemplo, para seguir el destino de las células de linaje etiquetado como el tejido se somete a la morfogénesis. Esto puede ser particularmente problemático para los tejidos que se desarrollan profunda dentro del embrión, que no son evidentes cuando un bloque de tejido del embrión se cultiva. Los dientes son buenos ejemplos de esto, a medida que se desarrollan dentro del proceso nasal mandíbula, maxilar y frontal. Cuando se cultiva toda la mandíbula las estructuras superficiales de los dientes se pueden ver pero los cambios en la morfología sólo pueden ser analizados después de la sección de tejido fijado <shasta> 2. Hemos adaptado una técnica de cultivo de cortes en directo lo que nos permite seguir el desarrollo de gérmenes del diente y el acceso a las diferentes partes del diente durante el desarrollo. Las culturas técnica de las rodajas de germen del diente en la interfase gas-líquido, utilizando un método modificado Trowell 3. Estos cultivos de cortes han sido muy útiles en directamente después de la morfogénesis del diente, y permitiendo linaje rastreo de componentes distintos, tales como el nudo del esmalte y la papila dental y el folículo 1,4-7. La técnica no se limita a los embriones de ratón y con éxito se ha utilizado para la cultura en vivo rebanadas de cerdo y la serpiente 8,9 tejido dental. Además de la ventaja de ser capaces de visualizar el desarrollo del diente, el método rebanada también tiene la ventaja de que las rodajas delgadas de tejido han aumentado el acceso a los nutrientes del medio y el aire de la incubadora. Esto se traduce en un mejor crecimiento de los gérmenes de los dientes, que coinciden con el desarrollo in vivo y espectáculo La invasión masde iones de las células endoteliales en la papila 7. En contraste, los gérmenes de los dientes en la mandíbula culturas enteros desarrollan más lento que los in vivo y el centro de la cultura es a menudo necrótico en cultivos a largo plazo. En la cultura rebanada, el diente se desarrolla dentro de un trozo de la mandíbula, y su interacción con el hueso circundante y el desarrollo de otros tejidos puede ser monitoreado. En nuestro método, el tejido se corta recta después de la disección sin necesidad de integrar en un medio de soporte 10,11 y no hay necesidad para cualquier sistema para sujetar el tejido a la guillotina. El método es, por tanto, no invasiva y rápida, permitiendo que muchos mandíbulas que se seccionaron en una sesión.
Este método de la cultura de los dientes tiene la ventaja de que el acceso a la germen del diente es excelente, lo que permite linaje precisa la localización y la colocación de los granos en el epitelio o el mesénquima. Por lo tanto, las regiones definidas del germen dentario en desarrollo pueden ser dirigidos específicamente. Durante el cultivo de la morfología cambiante de la germen del diente se puede seguir, y el efecto de las manipulaciones evaluarse rápidamente.
El método, sin …
The authors have nothing to disclose.
Sarah A. Alfaqeeh es financiado por Kind Saud University College de Odontología, Ministerio de Educación Superior, Reino de Arabia Saudita.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
Invitrogen | |||
Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
Invitrogen | |||
Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |