La valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili Umana Attraverso una coltivate vescica Epitelio

Summary

Abbiamo sviluppato un modello in vitro che imita un componente importante della risposta infiammatoria acuta durante l'infezione della vescica con uropatogeni Escherichia coli. Il transuroepithelial test di migrazione dei neutrofili consente la valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili umana attraverso vescica epiteli, coltivate su supporti permeabili, in risposta a infezioni batteriche o di sostanze chemoattractant.

Abstract

Il reclutamento di cellule immuni dalla periferia al sito di infiammazione è un passo essenziale nella risposta immunitaria innata in qualsiasi superficie mucosa. Durante l'infezione della vescica urinaria, leucociti polimorfonucleati (PMN; neutrofili) migrano dal sangue e attraversano l'epitelio vescicale. Mancata soluzione infezione in assenza di una risposta neutrofila dimostra l'importanza di PMN in difesa vescica. Per facilitare la colonizzazione dell'epitelio vescicale, uropatogeni Escherichia coli (UPEC), l'agente eziologico della maggior parte delle infezioni delle vie urinarie (IVU), smorzare la risposta infiammatoria acuta utilizzando una varietà di meccanismi parzialmente definiti. Per approfondire l'interazione tra ospite e patogeno batterico, abbiamo sviluppato un modello in vitro di questo aspetto della risposta immunitaria innata di UPEC. Nel transuroepithelial saggio migrazione dei neutrofili, una variazione sul camera di Boyden, epith vescica coltaElial cellule sono coltivate a confluenza sul lato inferiore di un supporto permeabile. PMN sono isolate da sangue venoso umano e vengono applicati al lato basolaterale degli strati di cellule epiteliali della vescica. Migrazione PMN rappresenta la direzione basolaterale-to-apicale fisiologicamente pertinente in seguito a infezione batterica o molecole chemiotattici viene enumerato con un emocitometro. Questo modello può essere utilizzato per analizzare le interazioni tra UPEC e cellule eucariotiche nonché per interrogare i requisiti molecolari per l'attraversamento di vescica epiteli da PMN. Il modello di migrazione dei neutrofili transuroepithelial sarà ulteriormente la nostra comprensione della risposta infiammatoria iniziale UPEC nella vescica.

Introduction

Il movimento delle cellule in tutto il corpo, spesso su lunghe distanze, è necessaria per la crescita e lo sviluppo, la guarigione della ferita, e la risposta immunitaria. La migrazione cellulare è complesso e richiede il coordinamento di molti processi diversi, tra cascate di segnalazione e il riassetto dei componenti del citoscheletro. Le cellule possono muoversi in modo casuale (chemochinesi) così come verso gradienti chimici definiti (chemiotassi). Molte tecniche sono state sviluppate per studiare la migrazione delle cellule in vitro. La più antica e più comune tecnica, la camera di Boyden, costituito da un sistema a due camera verticale quando una sostanza chemiotattico viene posta nella camera inferiore e cellule di interesse vengono inseriti nella camera superiore ^1. Il movimento delle cellule attraverso il filtro permeabile, con pori di dimensioni definite, che separa le due camere è monitorato. Altre tecniche sono state sviluppate per studiare la migrazione cellulare, compresa la camera Zigmond ² e la camera di Dunn^3. Questi approcci collettivi hanno dato una visione significativa nel movimento di molti tipi cellulari diversi.

Oltre a interrogare i principi fondamentali della chemochinesi e chemiotassi, saggi a due camere hanno facilitato l'indagine della migrazione cellulare attraverso componenti della matrice extracellulare e di entrambi gli strati di cellule endoteliali ed epiteliali. Un vantaggio dei sistemi a due camere su altre tecniche è che la membrana porosa può essere rivestito con proteine ​​come il collagene o fibrinogeno e migrazione cellulare attraverso una barriera a matrice extracellulare può essere valutata. Inoltre, linee cellulari coltivate possono essere coltivate e differenziati sui supporti permeabili. Per studiare il movimento delle cellule attraverso una barriera endoteliale, cellule endoteliali coltivate vengono seminate e coltivate nel serbatoio superiore dei supporti permeabili. Cellule mobili, come le cellule immunitarie, vengono aggiunti al serbatoio superiore e la migrazione nel serbatoio inferiore di tutti i enbarriera endoteliale in direzione apicale a basolaterale fisiologica viene osservata. Questo modello è stato prezioso per comprendere stravaso di cellule immunitarie dal flusso sanguigno. In contrasto transendoteliale migrazione, il movimento delle cellule attraverso una barriera epiteliale verifica in genere nella direzione basolaterale-to-apicale. Per modellare questi eventi in vitro, i ricercatori seme e crescono cellule epiteliali coltivate sul lato inferiore dei supporti permeabili. Cellule mobili vengono aggiunti al serbatoio superiore e la migrazione attraverso la barriera epiteliale, che rappresenta la direzione basolaterale-to-apicale, viene monitorato. Tali modelli di migrazione transepiteliale hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione delle risposte infiammatorie a superfici mucose, in particolare quelli del polmone e intestino ^4,5.

Al contrario, il traffico delle cellule immunitarie attraverso l'epitelio delle vie urinarie ha ricevuto molta meno attenzione. Per promuovere il nostro understanding delle risposte immunitarie innate nel tratto urinario durante l'infezione con uropatogeni Escherichia coli (UPEC), abbiamo sviluppato un test in vitro, la transuroepithelial test di migrazione dei neutrofili, che consente di indagine di leucociti polimorfonucleati (PMN, neutrofili) movimento attraverso una barriera epiteliale della vescica ^{6 -8.} Come con altri modelli a due camere di migrazione transepiteliale, colture di cellule epiteliali umane della vescica sono coltivate sul lato inferiore di un supporto permeabile e formano strati epiteliali confluenti. Neutrofili umani, isolate da sangue venoso, vengono applicati sul lato basolaterale dello strato epiteliale, e migrazione attraverso l'epitelio nella direzione basolaterale-to-apicale fisiologicamente rilevanti viene quantificato in risposta a infezione con diversi ceppi di E. coli o la presenza di molecole chemiotattici. Molta ricerca era concentrata sul movimento dei neutrofili, sia chemochinesi e chemiotassi, in assenza di altri tipi di cellule. Il transuroepithelial neutrofili test di migrazione è vantaggioso in quanto tiene conto di complesse interazioni fra le cellule epiteliali della vescica e le cellule del sistema immunitario durante l'infezione. Questo trattabili modello in vitro ha il potenziale per consentire l'esame approfondito delle risposte immunitarie a superfici uroepithelial.

Protocol

1. Coltura 5637 Cellule epiteliali della vescica

Effettuare le seguenti operazioni in una cappa di tessuto-cultura flusso laminare preparato con irradiazione UV e spazzato via giù con il 70% di etanolo.

1. Preparare mezzo RPMI-1640 contenente 10% siero bovino fetale (FBS) [definito RPMI +], filtro sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron dimensione dei pori e riscaldare a 37 ° C in un bagno d'acqua.
2. Scongelare una esageratamente di 5637 cellule (American Type Culture Collection HTB-9; derivata da carcinoma della vescica) in un bagno d'acqua a 37 °. Trasferire rapidamente le cellule scongelati per un tessuto pallone 75 centimetri ² di coltura contenente 20 ml di RPMI +.
3. Incubare il matraccio a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO ₂ fino a quando le cellule sono circa il 95% confluenti (~ 6 x 10 ⁶ cellule per pallone), circa 4 giorni.
4. Per sottocultura le cellule 5637:
   1. Rimuovere il terreno dal pallone. Lavare le cellule con 10 ml di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) a temperatura ambiente.
   2. Aggiungere 6 ml calda (37 ° C) 0,05% tripsina, soluzione di EDTA 0,02% al pallone, e incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 15 min.
   3. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, e pellet per centrifugazione a 300 xg per 5 min. Rimuovere la soluzione di tripsina / EDTA.
   4. Risospendere le cellule in 6 ml RPMI + (10 ⁶ cellule / ml), e trasferimento 1 ml (10 ⁶ cellule) in un pallone di 75 centimetri ² contenente 20 ml di RPMI +.
5. Ripetere passo 1.4 al sottocultura cellule ogni 4 giorni o quando le cellule raggiungono il 95% di confluenza.

2. Semina e Growing 5.637 celle su supporti permeabili

Effettuare le seguenti operazioni in una cappa di coltura di tessuti con tecnica asettica. Per risultati ottimali, utilizzare 5.637 cellule che hanno subito meno di 10 sottoculture.

1. Utilizzando pinze sterili, invertire i supporti permeabili in 25 millimetri piatto di coltura dei tessuti profondi sterile.
2 al 95% di confluenza secondo le fasi 1.4.1-1.4.3.
2. Usando una pipetta 1.000 ml, delicatamente risospendere le cellule in ~ 2 ml RPMI + ad una concentrazione di 3 x 10 ⁶ cellule / ml, determinato da cellule contando con un emocitometro.
3. Applicare 50 ml di sospensione cellulare (1,5 x 10 ⁵ cellule) per ciascun supporto permeabile senza toccare la membrana. Mettere il coperchio sul piatto, e posizionare con cura il piatto a 37 ° C con 5% di CO ₂ per non più di 16 ore.
4. Utilizzando pinze sterili, giusti i supporti permeabili in una piastra a 24 pozzetti contenente 0,6 ml di RPMI + per pozzetto. Aggiungere 0,1 ml RPMI + al serbatoio superiore di ciascun supporto permeabile. Incubare a 37 ° C con 5% di CO _2.
5. Sostituire il mezzo ogni 2 giorni. Primo, Piano aspirato dal serbatoio superiore seguito dal serbatoio inferiore, e quindi applicare fresco RPMI + in ordine inverso, per il serbatoio inferiore (0,6 ml) e poi il Rese superiorervoir (0.1 ml).
6. Sette giorni dopo la semina dei supporti permeabili con 5637 celle, valutare confluenza delle cellule. Riempire il serbatoio superiore con RPMI + (~ 0.35 ml). Le cellule sono sufficientemente confluenti quando il mezzo non equilibrare tra i serbatoi superiore ed inferiore.

3. Preparazione del batterica dell'inoculo

1. Utilizzando una tecnica asettica, aggiungere 20 ml di brodo di coltura appropriato per un pallone da 250 ml con tappo. Utilizzare Luria-Bertani (LB) brodo per E. coli culture e aggiungere antibiotici per il brodo all'occorrenza.
2. Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, inoculare il brodo con i batteri provenienti da un glicerolo magazzino o un piatto realizzato. Per i ceppi UPEC, incubare la coltura batterica a 37 ° C per circa 16 ore, senza agitare (per promuovere la produzione di tipo 1 pili).
3. Trasferire la coltura batterica in una provetta da centrifuga. Agglomerare le batteri mediante centrifugazione a 8000 xg per 10 min.
4. Decantare il surnatante, E risospendere i batteri in PBS a OD ₆₀₀ = 1.000, equivalente a ~ 10 ⁹ UFC / ml.
   1. Per generare uno stimolo batterica ucciso al calore, incubare una aliquota (es ~ 1,5 x 10 ⁸ UFC in 150 microlitri) dei batteri risospese a 55 ° C per 30 min. Piatto una aliquota della sospensione calore ucciso per confermare la morte dei batteri.
5. Immediatamente prima dell'uso, diluire i batteri risospeso (vivo o ucciso al calore) di 10 volte a 10 ⁸ CFU / ml nel warm privo di siero RPMI [definito RPMI-] in una provetta per microcentrifuga.

4. Isolamento di neutrofili umani da sangue periferico

La raccolta di sangue da volontari adulti necessita di revisione anticipo e l'approvazione di un comitato di revisione istituzionale. Indossare dispositivi di protezione adeguati e smaltire materiali pericolosi per evitare l'esposizione al sangue umano.

1. Circa 25 ml di sangue venoso da un adulto sano volunteer deve trarre in 3 provette sterili di sodio-eparina contenente la raccolta del sangue da parte del personale qualificato in salasso.
   1. Strettamente avvolgere un laccio emostatico di gomma attorno al braccio, sopra il gomito.
   2. Disinfettare il sito di ingresso, fossa antecubitale, utilizzando una sterile alcool al 70% pulire.
   3. Collegare un supporto di tubo di plastica ad un sistema di ago a farfalla dalle ali.
   4. Inserire l'ago in una vena antecubitale ad un angolo di 30 ° o meno, smusso rivolto verso l'alto. L'ago ha perforato la vena quando un getto di sangue appare nel tubo di plastica.
   5. Inserire un tubo di raccolta di sangue nel supporto tubo di plastica. Quando il primo tubo di raccolta è pieno, sostituirlo con il secondo tubo di raccolta. Ripetere con il terzo tubo.
   6. Quando il terzo tubo di raccolta è di circa mezzo pieno, rimuovere il laccio emostatico.
   7. Coprire il sito di puntura con un batuffolo di cotone sterile e ritirare lentamente l'ago dalla vena. Far scorrere lo schermo protettivo sopra l'ago e il luogo ina rischio biologico sharps container.
   8. Applicare pressione sul sito di puntura. Coprire la palla sito di puntura e cotone con un bendaggio adesivo.
   9. Capovolgere delicatamente le provette per il prelievo del sangue per disperdere l'eparina.

Effettuare le seguenti operazioni in una cappa di coltura di tessuti con tecnica asettica.

2. Usando una pipetta 10 ml, trasferire delicatamente il sangue ad una, 50 ml sterile tubo conico fresca. Aggiungere un volume equivalente di 3% (w / v) destrano in 0.9% NaCl e mescolare per inversione. Incubare la provetta in posizione verticale a temperatura ambiente per 20 min.
3. Senza interrompere lo strato inferiore, aspirare accuratamente lo strato superiore e trasferirlo in una nuova provetta conica da 50 ml. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min. Scartare il surnatante.
4. Risospendere il pellet di cellule in un volume di 0,9% NaCl equivalente al volume iniziale di sangue.
5. Strato 10 ml di soluzione di centrifugazione densità inferiore sospensione cellulare, priservando l'interfaccia tra le due fasi. Centrifugare a 400 xg per 30 min senza freno. Scartare il surnatante.
6. Per lisare restanti globuli rossi, risospendere il pellet cellulare in 10 ml freddo 0,2% NaCl. Incubare per 30 secondi, e poi aggiungere subito 10 ml di freddo 1.6% NaCl per ripristinare isotonicità.
7. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 6 min. Scartare il surnatante.
8. Ripetere i passaggi 4,6-4,7 finché non appare il pellet cellulare per essere liberi di globuli rossi, in genere 3 turni di lisi.
9. Usando una pipetta 1,000 microlitri, risospendere il pellet cellulare, principalmente PMN, in acqua calda (37 ° C) RPMI-ad una concentrazione di 10 ⁷ cellule / ml, determinato per conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Conservare le cellule a 37 ° C fino all'utilizzo. Tipicamente, PMN vitalità e purezza sono> 99% come valutato dal trypan blu e la visualizzazione della morfologia nucleare dopo colorazione, rispettivamente.

5. Transuroepithelial neutrofili migrazionedire

Effettuare le seguenti operazioni in una cappa di coltura di tessuti con tecnica asettica. Utilizzare solo supporti permeabili cuscinetto confluenti 5637 strati di cellule, come determinato al punto 2.7. Le piastre a 24 pozzetti contenenti RPMI-possono essere preparati in anticipo e conservati a 37 ° C con 5% di CO ₂ fino al momento dell'uso.

1. Aliquota 1 ml caldo RPMI-per bene in un 24-pozzetti; preparare 3 pozzetti per il supporto permeabile.
2. Aspirare il mezzo dai serbatoi superiore ed inferiore dei supporti permeabili.
3. Utilizzando pinze sterili, trasferire i supporti permeabili alla piastra 24 pozzetti preparato al punto 5.1. Lavare i supporti permeabili tre volte trasferendo i supporti da pozzetto a pozzetto.
4. Se un inoculo batterico deve essere utilizzato, invertire i supporti permeabili in 25 mm piatto di coltura dei tessuti profondi sterile. Se un chemiotattico (ad esempio, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) o IL-8), deve essere utilizzato, passare al punto 5.6.
5. Per gli esperimenti con bact vivo o uccisostimoli Erial, inoculare la parte apicale di ciascun supporto permeabile con 60 microlitri RPMI-(infezione finto) o con l'inoculo batterico (6 x 10 ⁶ CFU) preparato al punto 3.5. Posizionare il coperchio sul piatto e incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 1 ora.
6. Aggiungere 0,6 ml di RPMI-per bene ad una piastra a 24 pozzetti basso attaccamento; preparare 1 e per il supporto permeabile. Preparare 3 pozzetti contenenti 0,5 ml RPMI-per enumerare ingresso PMN.
   1. Se un fattore chemiotattico viene utilizzato al posto di batteri, aggiungere il fattore chemiotattico per 0,6 ml RPMI-nella piastra a 24 pozzetti preparato al punto 5.6.
7. Destra supporti permeabili nella piastra a 24 pozzetti low-attacco.
8. Aggiungere 0,1 ml PMN (10 ⁶ PMN), preparato nella fase 4.9, al serbatoio superiore (lato basolaterale) di ciascun supporto permeabile. Aggiungere 100 microlitri PMN direttamente nei pozzetti contenenti 500 ml RPMI-. Incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 1 ora.
9. Utilizzando pinze sterili, raschiare delicatamente lamembrana del supporto permeabile contro il bordo del pozzo per rimuovere PMN supplementare dal lato apicale e poi smaltire il supporto.
10. Raccogliere PMN raschiando delicatamente la parte inferiore di ogni bene con la punta della pipetta 1.000 microlitri, e trasferire le sospensioni PMN per microcentrifuga tubi.
11. Enumerare PMN utilizzando un emocitometro.
12. Per calcolare il numero totale di PMN nel serbatoio inferiore, moltiplicare il numero di PMN in 1 mm ² (100 nl) da 6.000. I dati possono essere presentate come percentuale di input di PMN, o come numeri PMN normalizzati 10 ⁶ ingresso PMN.

Representative Results

Il transuroepithelial saggio migrazione dei neutrofili consente la valutazione quantitativa della migrazione PMN umano di tutti gli strati cellulari epiteliali della vescica coltivate in risposta a vari stimoli (Figura 1B). Mentre il protocollo è semplice, ci sono una serie di variabili che possono influenzare la migrazione PMN e conseguentemente influenzare la riproducibilità del saggio. Occorre adottare misure volte durante la preparazione dei supporti permeabili e PMN per ridurre la variabilità tra i replicati tecnici e biologici. Ad esempio, solo i supporti permeabili contenenti sufficientemente confluenti 5637 strati di cellule dovrebbero essere usati in un esperimento. Confluenza delle cellule 5637 viene valutata usando un saggio funzionale che misura impermeabilità ai liquidi. Se medie aggiunto al serbatoio superiore equilibra attraverso il supporto permeabile, allora le cellule 5637 non sono sufficientemente confluenti per condurre l'esperimento. Se il volume nel serbatoio superiore viene mantenuta, poi la permeabilitàSupporto grado può essere utilizzato per valutare la migrazione dei PMN. Abbiamo misurato transepiteliale resistenza elettrica in questo sistema, che sorge modestamente sulla confluenza delle cellule, se si sceglie questo metodo, occorre prestare attenzione a non contaminare il setup altrimenti sterile. Confluenza delle cellule 5637 7 giorni dopo la semina può essere influenzata da molteplici fattori, incluso il numero di passaggi di cellule e il numero di cellule seminate sul supporto permeabile. Inoltre, la quantità di tempo che le cellule vengono incubate 5637 sul supporto permeabile in posizione capovolta durante la semina non deve superare 16 ore (Figura 1A). Per riproducibilità ottimale, il protocollo deve essere rigorosamente. Infine, supporti permeabili contenenti confluenti 5637 strati di cellule devono essere utilizzati entro 1-2 giorni, e le membrane dei supporti non devono mai essere toccate durante sia la crescita delle cellule 5637 o durante la transuroepithelial neutrofili test di migrazione.

In unddition alle cellule 5637, la variabilità può essere introdotta anche durante la preparazione PMN. Utilizzando il protocollo sopra descritto per isolare PMN, 1 ml di sangue umano tipicamente produce circa 10 ⁶ PMN, anche se questo numero varia da individuo a individuo. Una volta che la resa tipica di sangue di un singolo donatore è noto, il protocollo di isolamento può essere scalata verso l'alto o verso il basso di conseguenza. PMN da individui non sani o malati dovrebbe essere evitata, e diversi donatori PMN deve essere utilizzato per repliche biologiche al fine di garantire che i risultati osservati sono riproducibili. PMN deve essere maneggiato con delicatezza e asettico per evitare l'attivazione durante l'isolamento. Infine, la tempistica delle procedure sperimentali è fondamentale, in quanto PMN non sopravvive per lunghi periodi di tempo, una volta rimosso dal corpo. Utilizziamo PMN entro 1 ora di portare a termine la procedura di isolamento. Alla luce di queste considerazioni, almeno 3 repliche tecniche dovrebbero essere inclusi in ogni replica biologico.

Il numero diPMN nel serbatoio inferiore dopo 1 ora è mostrato in (figura 2) normalizzata a 10 ⁶ ingresso PMN. In alternativa, i numeri PMN può essere paragonato a un controllo interno dopo la normalizzazione di PMN ingresso, che può ridurre le variazioni tra le repliche biologiche. L'adesione al protocollo di cui sopra con attenzione ai dettagli consente l'enumerazione delle migrazioni PMN in risposta a stimoli compresi i batteri (Figura 2A) e sostanze chemoattractant (Figura 2b).

Figura 1. Schema di disegno sperimentale. (A) cellule epiteliali 5637 vescica vengono seminate su supporti permeabili invertiti, i supporti sono raddrizzati in una piastra da 24 pozzetti e le cellule sono cresciute a confluenza. (B) Permeabili supporti contenenti confluenti 5637 cellule sono invertiti e infettati con E. coli sul lato apicale degli strati epiteliali. In alternativa, fattori chemiotattici possono essere collocati nel serbatoio inferiore. I supporti permeabili sono raddrizzati in una piastra a basso attaccamento, e appena isolato PMN umano sono applicati al serbatoio superiore (che rappresenta il lato basolaterale degli strati epiteliali). PMN migrano attraverso l'epitelio e sono enumerate dal serbatoio inferiore utilizzando un emocitometro.

Figura 2. PMN migrano attraverso vescica epiteli in risposta a vari stimoli. (A) Infezione da non patogeno E. coli ceppo MG1655, MG1655 ucciso al calore (HKMG) o UPEC mutante UTI89 ybcL :: cat suscita significativamente più PMN migration che l'infezione finta o infezione con ceppo selvatico UPEC UTI89, una cistite isolare (*, p <0.001). (B) L'aggiunta di fMLF (100 nM) o IL-8 (100 ng / ml) per i risultati serbatoio inferiore in significativamente più migrazione di PMN trattamento finto (*, p <0.001). I dati rappresentano la media e la deviazione standard di almeno 3 repliche biologiche. Differenze statisticamente significative sono state determinate utilizzando il test t di Student un spaiato.

Discussion

Usando una linea di cellule epiteliali della vescica colta e preparata isolato PMN umani, abbiamo stabilito un modello in vitro di migrazione dei neutrofili transuroepithelial. Questo modello è stato determinante nel cominciare per analizzare la complessità della risposta immunitaria innata durante l'infezione del tratto urinario (UTI), un'infezione batterica molto comune in genere causata da UPEC ^9. Durante l'infezione della vescica o cistite, assunzione di PMN al lume della vescica è essenziale per la clearance batterica ^10. Per stabilire un punto d'appoggio a fronte di una risposta infiammatoria, UPEC ritardare l'arrivo dei PMN alla vescica, che prolunga il periodo durante il quale UPEC può invadere l'epitelio della vescica in assenza di ^6,11 pressione immunitaria. Questo fenotipo, soppressione di migrazione PMN da UPEC in momenti iniziali, si osserva nel nostro modello in vitro di migrazione PMN transuroepithelial. Infezione da non patogeno E. suscita coli MG1655significativamente più migrazione dei PMN di infezione da E. uropatogeni coli UTI89 (Figura 2A); co-infezione con MG1655 e UTI89 produce il fenotipo uropatogeni (cioè bassi livelli di migrazione PMN) ^6. Inoltre, abbiamo identificato una proteina UPEC, YbcL, che contribuisce al fenotipo soppressivo, come l'eliminazione di ybcL provocato significativamente più PMN nel serbatoio inferiore rispetto al wild-type UTI89 (Figura 2A) ^7. Alti livelli di migrazione PMN sono stati suscitato dal calore ucciso MG1655, fMLF e IL-8 (Figure 2A e B). In confronto a infezione con uno stimolo vivo batterico, l'uso di fattori chemiotattici può semplificare il protocollo sperimentale e l'interpretazione dei risultati. E 'probabile che altri fattori chemiotattici (prodotti batterici o chemiochine) sarebbe anche suscitare PMN in questo modello. Finora, la migrazione dei neutrofili transuroepithelial culoay ha facilitato indagini soppressione della risposta infiammatoria anticipato da UPEC, rivelando fenotipi che sono state verificate in modelli in vivo ^6-8, e sarà uno strumento prezioso per sforzi futuri.

Mentre questo saggio ha il potenziale per affrontare una serie di domande, vi sono alcune limitazioni. Dato il numero di variabili inerenti a questa analisi, la cura deve essere presa durante la preparazione e la conduzione di esperimenti per garantire la riproducibilità tra le repliche. L'enumerazione PMN mediante conteggio è soggetta a errore, come conteggio può essere il momento intenso e PMN sono di breve durata una volta rimosso dal corpo, specialmente in presenza di batteri. Ridurre il tempo tra la raccolta del campione PMN e PMN censimento comporta la raccolta di dati più precisi. I ricercatori hanno descritto test colorimetrici che misurano la mieloperossidasi (MPO) attività enzimatica come surrogato per PMN ^12,13. I saggi che utilizzano substrati colorimetrici quali 3,3 &# 39;, 5,5 ',-tetrametilbenzidina (TMB) o 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-solfonico acido) (ABTS) non sono sufficientemente sensibili per rilevare la concentrazione di PMN presenti in basso serbatoi che utilizzano il protocollo migrazione dei neutrofili transuroepithelial sopra descritto (Lau e Hunstad, dati non pubblicati). I parametri del dosaggio migrazione possono essere manipolati per aumentare la densità di PMN nei campioni serbatoio inferiore. In alternativa, un saggio MPO con maggiore sensibilità, potenzialmente utilizzando un substrato fluorescente, potrebbe essere stabilito. Misurazione dell'attività MPO rappresenta un'alternativa al conteggio PMN e può consentire di censimento più accurata PMN nei campioni serbatoio inferiore. Inoltre, un tale test può inoltre consentire l'enumerazione di PMN aderente agli strati epiteliali e rimane nel serbatoio superiore. Un protocollo basato su MPO convalidato rappresenterebbe un potente strumento in grado di espandere la quantità e il tipo di dati che potrebbero essere raccolti dal transuroepithelial neutrofili test di migrazione.

Transepiteliale test di migrazione dei neutrofili modellazione della risposta immunitaria innata nel tratto gastrointestinale e del polmone sono diffusi e sono responsabili della nostra attuale comprensione della attraversamento delle barriere epiteliali da PMN ^4,5. Al contrario, il movimento PMN attraverso le barriere uroepithelial ha ricevuto molta meno attenzione. Salvare e colleghi hanno riportato un modello che utilizza un epitelio polarizzato composto da cellule UROtsa differenziate, una linea cellulare immortalato derivate da tessuti uretere, cresciuta a confluenza su permeabile supporta ^14. Agace e colleghi hanno riportato l'uso di vescica indifferenziata (J82) e del rene (A498), le cellule epiteliali in un modello simile ^15. Nel modello di migrazione dei neutrofili transuroepithelial documento dettagliato, anche se gli strati cellulari 5637 non sono stratificati e probabilmente non formalmente polarizzata, giunzioni strette sono formate, valutata impermeabilità macromolecolareflusso e l'espressione e la localizzazione delle proteine ​​di giunzione stretti (Lau e Hunstad, dati non pubblicati). Di nota, lo strato epiteliale mantiene anche come impermeabilità durante le condizioni di infezione che abbiamo descritto. I protocolli riportati da salvare e Agace modellare la risposta infiammatoria dopo l'infezione con UPEC isolati per 24 ore. In questi modelli, UPEC suscitare migrazione PMN robusto. Al contrario, gli strati epiteliali nel nostro modello sono esposti a UPEC per un periodo relativamente breve di tempo, 1 ora, per esaminare le interazioni iniziali tra ospite e patogeno. Inoltre, l'uso di una linea cellulare epiteliale vescica e un UPEC cistite derivato isolare permette potenziale trasferimento dei risultati in vitro per la cistite modello murino ^16. Infine, gli studi di cui sopra grandi supporti permeabili utilizzati che richiedono 6 e tessuto di coltura piatti. L'utilizzo di piccoli supporti permeabili, come nel nostro modello, riduce l'uso di reagente e aumenta il numero di insertos che può essere manipolato per esperimento. Sebbene ognuno di questi sistemi modello ha vantaggi e svantaggi, il potenziale collettiva di questi modelli per definire gli eventi necessari per la migrazione dei PMN nei tessuti del tratto urinario è sostanziale.

Anche se meno ben compreso di migrazione attraverso le barriere endoteliali, il passaggio di PMN attraverso gastrointestinale e le barriere epiteliali polmonari ha ricevuto molta ^4,5 studio. Modelli di migrazione dei neutrofili transepiteliale che impiegano supporti permeabili e cellule epiteliali in coltura hanno rivelato alcuni degli eventi di segnalazione e molecole di adesione coinvolte nel movimento di PMN attraverso questi epiteli. Studi preliminari utilizzando cellule epiteliali urinarie coltivate suggeriscono il coinvolgimento della molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1) e il β-integrina CD11b/CD18 (Mac-1) in migrazione PMN attraverso tessuti urinari ^15. Non è chiaro che sono coinvolti vie di segnalazione supplementari e molecole adesivein questi processi complessi nel tratto urinario. Utilizzando il modello di migrazione dei neutrofili transuroepithelial qui descritto, forse aumentata con l'esame microscopico ^14,15, queste domande di base e molti altri possono essere interrogati. Inoltre, in collaborazione con la genetica batterica, questo modello può essere utilizzato per valutare ulteriormente fenotipi specifici dell'agente patogeno come la soppressione della migrazione PMN da UPEC. È chiaro a questo punto nel processo multi-step di migrazione PMN UPEC esercita il suo effetto soppressivo. Inoltre, il meccanismo con cui YbcL influenza migrazione PMN è ancora stata chiarita. In primo luogo la comprensione dei requisiti di base per il passaggio del PMN attraverso l'epitelio della vescica, allora possiamo cominciare a sondare come UPEC manipola questi processi per facilitare la malattia.

In sintesi, mentre esistono numerose tecniche per studiare il movimento delle cellule, un minor numero di approcci sono disponibili per interrogare migrazione cellulare attraverso le barriere cellulari. Modifications alla camera di Boyden sono stati parte integrante di indagare la migrazione delle cellule attraverso le barriere endoteliali ed epiteliali. Un trattabile modello in vitro della risposta infiammatoria acuta del tratto urinario, come il saggio transuroepithelial migrazione dei neutrofili qui riportata, è uno strumento prezioso per interrogare questi processi complessi. Infine, modifiche a questa analisi potrebbero agevolare le indagini in altri stati di malattia del tratto urinario.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell Inserts (i.e. permeable supports)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution	GE Healthcare	17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates	Corning	3473	24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8	R&D Systems	208-IL	Reconstituted in PBS to 100 μg/ml