Kvantitativ bedömning av Human neutrofilmigrationen över en Odlade blåsans epitel

Summary

Vi utvecklade en in vitro-modell som efterliknar en viktig komponent i den akuta inflammatoriska svaret vid infektion i urinblåsan med uropatogena Escherichia coli. Den transuroepithelial neutrofil migration assay möjliggör kvantitativ bedömning av human neutrofil migration över blåsan epitel, odlades på permeabla bärare, som svar på bakterieinfektion eller kemo-attraherande ämnen.

Abstract

Den rekrytering av immunceller från periferin till inflammationsstället är ett viktigt steg i det medfödda immunsvar vid någon slemhinneyta. Vid infektion i urinblåsan, polymorfonukleära leukocyter (PMN, neutrofiler) migrera från blodet och passera epitelcellerna i urinblåsan. Underlåtenhet att lösa infektion i avsaknad av en neutrofil respons visar vikten av PMN i urinblåsan försvar. För att underlätta koloniseringen av epitelcellerna i urinblåsan, uropatogena Escherichia coli (UPEC), det orsakande medlet av majoriteten av urinvägsinfektioner (UVI), dämpa akuta inflammatoriska svaret med användning av en mängd olika partiellt definierade mekanismer. För att ytterligare undersöka samspelet mellan värd och bakteriell patogen, utvecklade vi en modell av denna aspekt av det medfödda immunsvaret mot UPEC in vitro. I transuroepithelial neutrofil migration assay, en variant av Boyden-kammare, odlad blåsan epithElial celler odlas till sammanflytning på undersidan av ett permeabelt stöd. PMN isolerades från humant venöst blod och matas till den basolaterala sidan av blåsan epiteliala cellskikten. PMN migration representerar fysiologiskt relevant basolaterala-till-apikal riktning som svar på bakteriell infektion eller chemoattractant molekyler är uppräknade med hjälp av en hemocytometer. Denna modell kan användas för att undersöka interaktioner mellan UPEC och eukaryota celler, samt att förhöra de molekylära kraven för korsande av blåsan epitel av PMN. Den transuroepithelial neutrofilmigration modellen kommer öka vår förståelse av den initiala inflammatoriska reaktion på UPEC i urinblåsan.

Introduction

Rörelsen av celler i hela kroppen, ofta över stora avstånd, som krävs för tillväxt och utveckling, sårläkning och immunsvar. Cell migration är komplex och kräver samordning av många olika processer, bland annat signalering kaskader och ombildning av cytoskelettala komponenter. Celler kan röra sig slumpmässigt (kemokines) samt mot definierade kemiska gradienter (kemotaxi). Många tekniker har utvecklats för att studera cellmigration in vitro. Den äldsta och vanligaste tekniken, den Boyden-kammaren består av en vertikal två-kammarsystem, där ett kemoattraherande Ämnet placeras i bottenkammaren och celler av intresse placeras i den övre kammaren ^1. Rörelsen av celler över det permeabla filter med porer med definierad storlek, som skiljer de två kamrarna övervakas. Ytterligare tekniker har utvecklats för att undersöka cell migration, inklusive Zigmond kammare ² och Dunn kammaren^3. Har gett dessa gemensamma strategier betydande insikt i rörelse många olika celltyper.

Förutom att förhöra de grundläggande principerna för kemokines och kemotaxi, har två kammare analyser lättat utredningen av cellmigration genom extracellulära matrixkomponenter och både endotelceller och epitelceller cellager. En fördel med två kammarsystem framför andra tekniker är att det porösa membranet kan beläggas med proteiner såsom kollagen eller fibrinogen, och cellmigrering över en extracellulär matrisliknande barriär kan bedömas. Dessutom kan odlade cellinjer odlas och differentieras på de permeabla bärare. För att undersöka rörelsen av celler över en endotelial barriär, är odlade endotelceller sås och odlas i den övre behållaren av de permeabla bärare. Rörliga celler, såsom immunceller, sätts till den övre behållaren och migration in i den nedre behållaren över endothelial barriär i den fysiologiska apikal till basolateral riktning observeras. Denna modell har varit ovärderliga för att förstå extravasering av immuna celler ut ur blodströmmen. I motsats till transendotelial migrering sker rörelsen av celler över en epitelial barriär typiskt i den basolaterala-till-apikala riktningen. För att modellera dessa händelser in vitro, forskare frö och växa odlade epiteliala celler på undersidan av de permeabla bärare. Rörliga celler sättes till den övre behållaren och migration över den epiteliala barriären, vilket motsvarar den basolaterala-till-apikala riktning, övervakas. Sådana modeller av transepitelial migration har väsentligt bidragit till vår förståelse av inflammatoriska reaktioner på slemhinnor, särskilt de av lungan och gut ^4,5.

Däremot har immunceller människohandel genom epitelet i urinvägarna fått mycket mindre uppmärksamhet. Att främja vårt understanding av medfödda immunsvar i urinvägarna under infektion med uropatogena Escherichia coli (UPEC), utvecklade vi en in vitro-analys, den transuroepithelial neutrofilmigrationen analys, som möjliggör undersökning av polymorfonukleär leukocyt (PMN, neutrofiler) rörelse över en blåsa epitelial barriär ^{6 -8.} Som med andra två-kammar modeller av transepitelial migration, är odlade humana blåsan epitelceller odlades på undersidan av ett permeabelt stöd och bilda konfluenta epiteliala skikt. Humana neutrofiler, som isoleras från venöst blod, skall tillämpas på den basolaterala sidan av epiteliala skikt, och migration över epitelet i fysiologiskt relevant basolaterala-till-apikala riktningen kvantifieras som svar på infektion med olika stammar av E. coli eller förekomsten av chemoattractant molekyler. Mycket forskning har fokuserat på neutrofil rörelse, både kemokines och kemotaxi, i avsaknad av ytterligare celltyper. Den transuroepithelial neutrofilmigration analysen är fördelaktigt eftersom det tar hänsyn till komplexa interaktioner mellan urinblåsan epitelceller och immunceller under infektion. Detta lätthanterlig in vitro-modell har potential att möjliggöra detaljerad undersökning av immunsvar vid uroepithelial ytor.

Protocol

1. Odling 5637 Bladder epitelceller

Utför följande steg i ett laminärt flöde vävnadsodling huva förberedd med UV-bestrålning och torkas av med 70% etanol.

1. Förbered RPMI-1640-medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) [benämnd RPMI +], filter sterilisera med användning av ett 0,22 ^ m porstorlek filter, och värm till 37 ° C i ett vattenbad.
2. Tina en cryovial av 5637-celler (American Type Culture Collection HTB-9, härledd från blåskarcinom) i ett 37 ° C vattenbad. Snabbt överföra de upptinade cellerna till en 75 cm ² vävnadsodling kolv innehållande 20 ml RPMI +.
3. Inkubera kolven vid 37 ° C i en fuktad atmosfär med 5% _CO2 tills cellerna är ungefär 95% konfluenta (~ 6 x 10 ⁶ celler per kolv), ca 4 dagar.
4. Till subkultur de 5637-celler:
   1. Avlägsna mediet från kolven. Tvätta cellerna med 10 ml Dulbeccos fosfatbuffrade Saline (DPBS) vid rumstemperatur.
   2. Lägg 6 ml varm (37 ° C) 0,05% trypsin, 0,02% EDTA-lösning till kolven, och inkubera vid 37 ° C med 5% _CO2 under 15 min.
   3. Överför celler till ett 15 ml koniskt rör och pelleten genom centrifugering vid 300 xg under 5 min. Ta av trypsin / EDTA-lösning.
   4. Resuspendera cellerna i 6 ml RPMI + (10 ⁶ celler / ml), och överförings 1 ml (10 ⁶ celler) till ett nytt 75 cm ^2-kolv innehållande 20 ml RPMI +.
5. Upprepa steg 1,4 till subkultur cellerna var 4 dagar eller när cellerna når 95% sammanflödet.

2. Sådd och Växande 5637 Celler på Permeable Stöder

Utför följande steg i en vävnadsodling huva med aseptisk teknik. För bästa resultat, använd 5637 celler som har genomgått färre än 10 subkulturer.

1. Med hjälp av steril pincett, invertera släppliga stöd i en steril 25 mm djup vävnadsodlingsskål.
2-kolv av 5637 celler vid 95% sammanflödet enligt steg 1.4.1-1.4.3.
2. Med hjälp av en 1000 l pipett försiktigt suspendera cellerna i ~ 2 ml RPMI + till en koncentration av 3 x 10 ⁶ celler / ml, bestäms av cellräkning med hjälp av en hemocytometer.
3. Applicera 50 | il av cellsuspensionen (1,5 x 10 ⁵ celler) till varje permeabelt stöd utan att vidröra membranet. Sätt på locket på skålen och försiktigt placera skålen vid 37 ° C med 5% CO ₂ i högst 16 timmar.
4. Med hjälp av steril pincett, rätta de genomsläppliga stöd i en 24-brunnar innehåller 0,6 ml RPMI + per brunn. Lägg till 0,1 ml RPMI + till den övre behållaren för varje släppligt stöd. Inkubera vid 37 ° C med 5% _CO2.
5. Byt mediet var 2 dagar. Först, aspirera mediet från den övre reservoaren följt av den nedre behållaren, och sedan använda färsk RPMI + i omvänd ordning, att den nedre behållaren (0,6 ml) och därefter den övre reservoir (0,1 ml).
6. Sju dagar efter ympning av de permeabla bärare med 5637 celler, utvärdera flödet av cellerna. Fyll den övre behållaren med RPMI + (~ 0,35 ml). Cellerna är tillräckligt sammanflytande när mediet inte i jämvikt mellan de övre och nedre reservoarerna.

3. Beredning av bakteriell Vaccin

1. Med användning av aseptisk teknik, tillsätt 20 ml av lämpligt odlingsbuljongen till en 250 ml kolv med ett lock. Använd Luria-Bertani (LB)-buljong för E. coli-kulturer och lägga antibiotika till buljongen vid behov.
2. Med hjälp av en steril ympning slinga, ympa buljongen med bakterier från en glycerol lager eller en strimma platta. För UPEC stammar, inkubera den bakteriella kulturen vid 37 ° C under cirka 16 timmar, utan skakning (för att främja produktion av typ 1 pili).
3. Överför den bakteriekultur till ett centrifugrör. Pelletera bakterierna genom centrifugering vid 8000 x g under 10 min.
4. Dekantera supernatanten, Och återsuspendera bakterierna i PBS till OD ₆₀₀ = 1,000, ekvivalent till ~ 10 ⁹ CFU / ml.
   1. För att generera en värmedödade bakterie stimulus, inkubera en alikvot (t.ex. ~ 1,5 x 10 ⁸ CFU i 150 | il) av de resuspenderade bakterierna vid 55 ° C under 30 min. Plåt en alikvot av värmedödade suspensionen att bekräfta bakteriell död.
5. Omedelbart före användning späds de återsuspenderade bakterier (levande eller värmedödade) 10-faldigt till 10 ⁸ CFU / ml i varmt serumfritt RPMI [benämnas RPMI-] i ett mikrofugrör.

4. Isolering av humana neutrofiler från perifert blod

Insamlingen av blod från frivilliga vuxna kräver förhands översyn och godkännande från en institutionell översyn ombord. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kasta farliga material för att undvika exponering för blod.

1. Cirka 25 ml venöst blod från en frisk vuxen volunteer bör dras in i 3 sterila natriumheparininnehållande blodprovsrör av personal utbildad i flebotomi.
   1. Tätt linda en gummi band runt den övre armen, ovanför armbågen.
   2. Desinficera ingångsställe, armvecket, med användning av en steril 70% alkohol torka.
   3. Bifoga ett plaströr innehavaren till en bevingad fjäril nålsystem.
   4. Stick in nålen i en antekubitalvenen vid en 30 ° vinkel eller mindre, avfasning uppåt. Nålen har punkterade venen när en spurt av blod visas i plaströr.
   5. Sätt i en provröret i plaströr innehavaren. När det första provröret är full, ersätt med det andra provröret. Upprepa med det tredje röret.
   6. När den tredje provröret är ungefär halvfull, ta bort förbandet.
   7. Täck punktionsstället med en steril bomullstuss och långsamt ut kanylen ur venen. Skjut skyddande sköld över nålen och plats ina biologiskt avfallsbehållare.
   8. Sätt press på punktionsstället. Täck stickstället och bomullstuss med ett plåster.
   9. Vänd försiktigt blodprovsrör att skingra heparin.

Utför följande steg i en vävnadsodling huva med aseptisk teknik.

2. Med hjälp av en 10 ml pipett försiktigt överföra blodet till en fräsch, sterila 50 ml koniska rör. Lägg till en motsvarande volym av 3% (vikt / volym) dextran i 0,9% NaCl och blanda genom inversion. Inkubera röret upprätt vid rumstemperatur i 20 min.
3. Utan att störa det undre skiktet försiktigt aspirera det övre skiktet och överföra den till en ny 50 ml koniska rör. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 300 x g under 10 min. Kasta bort supernatanten.
4. Resuspendera cellpelleten i en volym av 0,9% NaCl motsvarade startvolymen av blod.
5. Layer 10 ml av densitetscentrifuge lösningen under cellsuspensionen, s.resergränsytan mellan de två faserna. Centrifugera vid 400 x g under 30 min utan någon broms. Kasta bort supernatanten.
6. För att lysera återstående röda blodkroppar, resuspendera cellpelleten i 10 ml kall 0,2% NaCl. Inkubera i 30 sekunder, och sedan snabbt 10 ml kall 1,6% NaCl för att återställa isotoniciteten.
7. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 300 x g under 6 min. Kasta bort supernatanten.
8. Upprepa steg från 4,6 till 4,7 tills cellpelleten verkar vara fria från röda blodceller, typiskt tre rundor av lys.
9. Med användning av en 1000 | il pipett resuspendera cellpelleten, primärt PMN, i varmt (37 ° C) RPMI-till en koncentration av 10 ⁷ celler / ml, bestämt genom cellräkning med användning av en hemocytometer. Håll cellerna vid 37 ° C fram till användning. Normalt PMN livskraft och renhet är> 99% enligt bedömning av trypanblåexklusion och visualisering av kärnmorfologi efter färgning, respektive.

5. Transuroepithelial neutrofilmigrationen Såsomsäga

Utför följande steg i en vävnadsodling huva med aseptisk teknik. Använd endast genomsläppliga stöd som bär sammanflytande 5637 cellager, som bestämdes i steg 2.7. De 24-brunnars plattor innehållande RPMI-, kan framställas i förväg och hölls vid 37 ° C med 5% _CO2 tills de användes.

1. Alikvotera 1 ml varmt RPMI-per brunn i en 24-brunnar, förbereda tre brunnar per släppliga stöd.
2. Aspirera medium från de övre och nedre reservoarerna av de permeabla bärare.
3. Med hjälp av steril pincett, överföra släppliga stöd till den 24-brunnar förberedd i steg 5.1. Tvätta släppliga stöden tre gånger genom att överföra stöden från brunn till brunn.
4. Om ett bakteriellt inokulum skall användas, vänd de permeabla bärare i en steril 25 mm djup vävnadsodlingsskål. Om en kemoattraktant (t.ex. N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) eller IL-8) ska användas, gå vidare till steg 5.6.
5. För experiment med levande eller döda baktErial stimuli ympa den apikala sidan av varje permeabla bäraren med 60 | il RPMI-(mock-infektion) eller med den bakteriella inokulat (6 x 10 ⁶ CFU) som framställts i steg 3,5. Placera locket på skålen och inkubera vid 37 ° C med 5% _CO2 under 1 timme.
6. Lägg till 0,6 ml RPMI-per brunn till en 24-väl låg fästplatta, förbereda en väl per släppliga stöd. Bered 3 brunnar innehållande 0,5 ml RPMI-to enumerate PMN ingång.
   1. Om en kemoattraktant används i stället för bakterier, tillsätt chemoattractant till 0,6 ml RPMI-i 24-brunnar förberedd i steg 5.6.
7. Höger de genomsläppliga stöd till 24-väl låg fästplatta.
8. Lägg till 0,1 ml PMN (10 ⁶ PMN), framställd i steg 4,9, till den övre behållaren (basolaterala sidan) hos varje permeabelt stöd. Tillsätt 100 l PMN direkt till brunnar som innehåller 500 l RPMI-. Inkubera vid 37 ° C med 5% _CO2 under 1 timme.
9. Med hjälp av steril pincett, försiktigt skrapamembran permeabelt stöd mot kanten av brunnen för att avlägsna ytterligare PMN från den apikala sidan och sedan kassera bäraren.
10. Samla PMN genom att försiktigt skrapa botten av varje brunn med 1000 mikroliter pipettspets, och överföra PMN-suspensioner till mikrofugrör.
11. Räkna PMN med användning av en hemocytometer.
12. För att beräkna det totala antalet PMN i den nedre reservoaren, multiplicera antalet PMN i 1 mm ² (100 nl) med 6.000. Data kan redovisas i procent av ingående PMN, eller som PMN tal normaliserad till 10 ⁶ ingång PMN.

Representative Results

Den transuroepithelial neutrofilmigrationen analys möjliggör kvantitativ bedömning av mänsklig PMN migration över odlade blås epitelial cellager som svar på olika stimuli (Figur 1B). Medan protokollet är enkel, det finns ett antal variabler som kan påverka PMN migration och därmed påverka reproducerbarhet av denna analys. Åtgärder bör vidtas samtidigt förbereda de genomsläppliga stöd och PMN att minska variationen mellan tekniska och biologiska replikat. Till exempel bör endast permeabla bärare innehållande tillräckligt konfluenta 5637 cellskikt användas i ett experiment. Sammanflödet av 5637 celler bedöms med hjälp av en funktionell analys som mäter ogenomtränglighet för vätska. Om mediet sattes till den övre behållaren i jämvikt över permeabelt stöd, sedan 5637-celler är inte tillräckligt konfluent för att genomföra experimentet. Om volymen i den övre reservoaren bibehålles, då permeabilitetkompetent stöd kan användas för att bedöma PMN migration. Vi har mätt transepithelial elektriskt motstånd i detta system, som stiger blygsamt vid sammanflödet av cellerna, om denna metod som väljs, bör man inte förorena den annars sterila setup. Flödet av 5637 celler 7 dagar efter sådd kan påverkas av flera faktorer, innefattande passage antalet celler och antalet celler som ympats på permeabelt stöd. Dessutom bör den tid som de 5637 cellerna inkuberas på det permeabla stödet i omvänt läge under ympning inte överstiga 16 tim (Figur 1A). För optimal reproducerbarhet, bör protokollet följas exakt. Slutligen bör genomsläppliga stöd som innehåller sammanflytande 5637 cellager användas inom 1-2 dagar, och membranen i stöden får aldrig vidröras under någon tillväxt av 5637 celler eller under transuroepithelial neutrofilmigrationen analys.

I enddition till 5637 celler, kan variabilitet även införas under PMN förberedelser. Med hjälp av protokoll som beskrivs ovan för att isolera PMN, 1 ml av blod ger vanligtvis ca 10 ⁶ PMN, men antalet varierar från individ till individ. När typiskt utbyte av en enskild givarens blod är känd kan isoleringsprotokoll skalas upp eller ner i enlighet därmed. PMN från ohälsosamma eller sjuka individer bör undvikas, och olika PMN givare bör användas för biologiska replikat för att se till att resultaten som observerats är reproducerbara. PMN bör hanteras varsamt och aseptiskt för att undvika aktivering under isoleringen. Slutligen är tidpunkten för de experimentella procedurer avgörande, eftersom PMN inte överlever under längre perioder när de avlägsnats från kroppen. Vi använder PMN inom 1 timme för att fylla i isoleringsförfarandet. Mot bakgrund av dessa överväganden bör minst tre tekniska replikat ingå i varje biologisk replikera.

AntaletPMN i den nedre behållaren efter 1 timme visas i (figur 2) normaliserad till 10 ⁶ ingång PMN. Alternativt kan PMN tal jämföras med en intern kontroll efter normalisering till ingångs PMN, vilket kan minska variationen mellan biologiska replikat. Anslutning till det protokoll som beskrivs ovan med känsla för detaljer gör att uppräkningen av PMN migrationen som svar på stimuli inklusive bakterier (Figur 2A) och chemoattractant ämnen (Figur 2B).

Figur 1. Schematisk bild av experimentell design. (A) 5637 blåsan epitelialceller ympas på inverterade permeabla bärare är stöden rättas in i en 24-brunnars platta, och cellerna odlades till sammanflytning. (B) permeabilitetble stöd innehåller sammanflytande 5637 celler inverteras och infekterade med E. coli på den apikala sidan av de epiteliala lagren. Alternativt kan kemoattraherande ämnen placeras i den nedre behållaren. De genomsläppstöden rättas till en låg fästplatta, och nyligen isolerade humana PMN appliceras på den övre reservoaren (som representerar den basolaterala sidan av de epiteliala lagren). PMN migrera över epitelet och numreras från den nedre reservoaren med användning av en hemocytometer.

Figur 2. PMN migrera över blåsan epitel som svar på olika stimuli. (A) Infektion med icke-patogena E. coli stam MG1655, värmedödade MG1655 (HKMG) eller UPEC mutant UTI89 ybcL :: cat framkallar signifikant mer PMN migration än skeninfektion eller infektion med vildtyp UPEC stammen UTI89, en cystit isolera (*, p <0,001). (B) Tillsats av fMLF (100 nM) eller IL-8 (100 ng / ml) till de nedre reservoar ger avsevärt mer PMN-migrering än mock behandling (*, p <0,001). Data representerar medelvärdet och standardavvikelse från minst tre biologiska replikat. Statistiskt signifikanta skillnader bestämdes med användning av ett oparat Student t-test.

Discussion

Med hjälp av en odlad blåsa epitelcellinje och nyligen isolerade humana PMN, etablerade vi en modell av transuroepithelial neutrofilmigrationen in vitro. Denna modell har varit avgörande börjar dissekera komplexiteten i det medfödda immunsvaret vid urinvägsinfektion (UVI), en mycket vanlig bakteriell infektion orsakas vanligtvis av UPEC ^9. Under infektion av urinblåsan, eller cystit, är nödvändig för bakteriell clearance ¹⁰ rekrytering av PMN till blåsan lumen. Att etablera ett fotfäste i ansiktet av en inflammatorisk reaktion, UPEC fördröja ankomsten av PMN till urinblåsan, vilket förlänger den tid under vilken UPEC kan invadera blåsan epitel i avsaknad av immuntryck ^6,11. Denna fenotyp, undertryckande av PMN migrering av UPEC vid tidiga tidpunkter, observeras i vår modell av transuroepithelial PMN migration in vitro. Infektion med icke-patogena E. coli MG1655 framkallarbetydligt mer PMN migration än infektion med uropatogena E. coli UTI89 (Figur 2A), samtidig infektion med MG1655 och UTI89 ger den uropatogena fenotyp (dvs. låga nivåer av PMN migration) ^6. Vidare identifierade vi UPEC protein, YbcL, som bidrar till den undertryckande fenotyp, såsom deletion av ybcL gav signifikant mer PMN i den nedre behållaren i jämförelse med vildtyp UTI89 (Figur 2A) ^7. Höga nivåer av PMN-migrering även framkallas av värmeavdödade MG1655, fMLF och IL-8 (Fig. 2A och B). I jämförelse med infektion med en levande bakterie stimulans, kan användningen av kemoattraktanter förenkla både experimentella protokollet och tolkningen av resultaten. Det är troligt att andra kemoattraktanter (t.ex. bakteriella produkter eller kemokiner) också skulle framkalla PMN i denna modell. Hittills den transuroepithelial neutrofilmigrationen assay har underlättat utredningar undertryckande av den tidiga inflammatoriska svaret genom UPEC, avslöjar fenotyper som har bekräftats i in vivo-modeller ^6-8, och kommer att bli ett ovärderligt verktyg i framtida insatser.

Även denna analys har potential att ta upp ett antal frågor, finns det några begränsningar. Med tanke på antalet variabler inneboende till denna analys, måste man samtidigt förbereda och genomföra experiment för att säkerställa reproducerbarhet mellan replikat. Räkna PMN genom att räkna är risk för fel, som att räkna kan vara tidskrävande och PMN är kortlivade när de avlägsnats från kroppen, särskilt i närvaro av bakterier. Att minska tiden mellan PMN provtagning och PMN uppräkning kommer att resultera i insamlingen exaktare uppgifter. Forskare har beskrivit kolorimetriska analyser som mäter myeloperoxidas (MPO) enzymaktivitet som ett surrogat för PMN ^12,13. Analyser som använder kolorimetriska substrat såsom 3,3 &# 39;, 5,5 ',-tetrametylbensidin (TMB) eller 2,2'-azino-bis (3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra) (ABTS) är inte tillräckligt känsligt för att detektera koncentrationen av PMN närvarande i den lägre reservoarer med hjälp av transuroepithelial neutrofilmigrationen protokoll beskrivs ovan (Lau och Hunstad, opublicerade data). Parametrarna för analysen migration kan manipuleras för att öka PMN densitet i de nedre reservoar prover. Alternativt kan en MPO-analys med större känslighet, eventuellt använda ett fluorescerande substrat, kunde fastställas. Mätning av MPO-aktivitet utgör ett alternativ till PMN räkning och kan möjliggöra mer noggrann räkning av PMN i de nedre reservoar prover. Dessutom kan en sådan analys också att möjliggöra räkning av PMN vidhäftande till de epiteliala skikten och stanna kvar på den övre behållaren. En validerad MPO-baserat protokoll skulle utgöra ett kraftfullt verktyg som kan expandera den mängd och typ av data som kan samlas in från transuroepithelial neutrofil migration assay.

Transepitelial neutrofil migration analyser modellering det medfödda immunsvaret i mag-tarmkanalen och lungorna är utbredd och är ansvariga för vår nuvarande förståelse av traverse av epithelial hinder genom PMN ^4,5. Däremot har PMN rörlighet över uroepithelial barriärer fått mycket mindre uppmärksamhet. Säve och kollegor har rapporterat en modell som använder en polariserad epitel bestående av differentierade UROtsa celler, en odödlig cellinje som härrör från urinledare vävnad, växt till sammanflytning på släppligt stöd ^14. Agace och kollegor har rapporterat användning av odifferentierade blåsan (J82) och njure (A498) epitelceller i en liknande modell ^15. I transuroepithelial neutrofilmigrationen modell beskrivs häri, även om 5637 cellager är inte skiktad och troligen inte formellt polariserad, är tight junctions bildats, bedöms av ogenomtränglighet för makromolekyläraflux och uttryck och lokalisering av snäva junction proteiner (Lau och Hunstad, opublicerade data). Notera epitelskiktet håller också sådan ogenomtränglighet under infektionsförhållanden som vi har beskrivit. De protokoll som rapporterats av Säve och Agace modellera det inflammatoriska svaret efter infektion med UPEC isolat under 24 timmar. I dessa modeller, UPEC framkalla robust PMN migration. I motsats därtill är de epiteliala skikt i vår modell exponeras för UPEC under en relativt kort tidsperiod, 1 timme, i syfte att undersöka de första interaktioner mellan värd och patogen. Vidare har användningen av en blåsa epitelial cellinje och en cystit härledda UPEC isolera möjliggör potentiell translation av in vitro-resultat till den murina cystit modell ^16. Slutligen, de studier som nämns ovan utnyttjade stora släppliga stöd som kräver 6 såväl vävnadsodlingsskålar. Användningen av mindre permeabla bärare, såsom i vår modell, minskar reagensanvändning och ökar antalet inserts som kan manipuleras per experiment. Även om var och en av dessa modellsystem har fördelar och nackdelar, för att den kollektiva potentialen hos dessa modeller definiera händelser som krävs för PMN migration i urinvägarna vävnader är betydande.

Även mindre väl förstått än migration över endothelial barriärer, har passagen av PMN över mag-och lung epiteliala barriärer fått mycket studie ^4,5. Transepitelial neutrofil migration modeller som använder släppliga stöd och odlade epitelceller har avslöjat några av de signaleringshändelser och adhesionsmolekyler som är involverade i förflyttning av PMN genom dessa epitel. Preliminära studier med odlade urin epitelceller föreslår medverkan av intercellulära adhesionsmolekyl-1 (ICAM-1) och β-integrin CD11b/CD18 (Mac-1) i PMN migration över urin vävnader ^15. Det är oklart vilka ytterligare signalvägar och självhäftande molekyler är inblandadei dessa komplexa processer i urinvägarna. Använda transuroepithelial neutrofilmigrationen modell som beskrivs här, kanske förstärkt med mikroskopisk undersökning ^14,15, kan dessa grundläggande frågor och många andra att förhöras. Dessutom, i samband med bakteriella genetik, denna modell kan användas för att ytterligare utvärdera patogenspecifika fenotyper såsom dämpning av PMN migration av UPEC. Det är oklart vid vilken punkt i flera steg av PMN migration UPEC utövar sin hämmande effekt. Även den mekanism genom vilken YbcL påverkar PMN migrationen har ännu inte klarlagts. Genom att först förstå de grundläggande kraven för passage av PMN över epitelcellerna i urinblåsan, kan vi sedan börja sondera hur UPEC manipulerar dessa processer för att underlätta sjukdomen.

I sammanfattning, medan ett flertal tekniker finns för att studera rörligheten för celler, färre metoder finns tillgängliga för att förhöra cell migration över cellulära barriärer. Modifications till Boyden kammare har varit en integrerad del undersöka cell migration över endotelceller och epitelceller barriärer. En lätthanterlig modell av akut inflammatorisk reaktion i urinvägarna, såsom transuroepithelial neutrofilmigrationen analys beskrivs häri in vitro, är ett värdefullt verktyg för att förhöra dessa komplexa processer. Slutligen, modifieringar av denna analys kan underlätta utredningar av andra sjukdomstillstånd i urinvägarna.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell Inserts (i.e. permeable supports)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution	GE Healthcare	17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates	Corning	3473	24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8	R&D Systems	208-IL	Reconstituted in PBS to 100 μg/ml