Kvantitativ vurdering af human neutrofil migration over en Kulturperler Blære epitel

Summary

Vi har udviklet en in vitro-model, der efterligner en vigtig komponent i den akutte inflammatoriske respons under infektion af blæren med uropatogen Escherichia coli. Den transuroepithelial neutrofil migration assay muliggør kvantitativ vurdering af human neutrofil migration over blæren epitel, dyrket på permeable understøtninger, som reaktion på bakteriel infektion eller kemotiltrækkende stoffer.

Abstract

Rekrutteringen af ​​immunceller fra periferien til stedet for inflammation er et vigtigt skridt i indsatsen på enhver slimhindeoverflade medfødte immunforsvar. Under infektion af urinblæren, polymorfkernede leukocytter (PMN; neutrofiler) migrere fra blodbanen og krydse blæren epitel. Manglende løse infektion i fravær af en neutrofile respons viser betydningen af ​​PMN i blæren forsvar. For at lette kolonisering af blæren epitel, uropatogen Escherichia coli (UPEC), det kausative middel for hovedparten af urinvejsinfektioner (UVI), dæmpe akut inflammatorisk reaktion ved hjælp af en række delvist definerede mekanismer. For yderligere at undersøge samspillet mellem vært og bakterielt patogen, udviklede vi en in vitro model for dette aspekt af reaktionen på UPEC medfødte immunreaktion. I transuroepithelial neutrofilmigration assay, en variation på Boydenkammer, kulturperler blære epithelial Cellerne dyrkes til konfluens på undersiden af ​​en permeabel støtte. PMN isoleres fra humant veneblod og er anbragt på den basolaterale side af blæren epitelcelle lag. PMN migration repræsenterer fysiologisk relevant basolaterale-til-apikale retning som reaktion på bakteriel infektion eller kemotiltrækkende molekyler optælles ved hjælp af et hæmocytometer. Denne model kan anvendes til at undersøge interaktionen mellem UPEC og eukaryote celler, såvel som at forespørge de molekylære krav til traversal blære epithel af PMN. Den transuroepithelial neutrofilmigration model vil fremme vores forståelse af den oprindelige inflammatoriske respons på UPEC i blæren.

Introduction

Bevægelsen af ​​celler i hele kroppen, ofte over store afstande, der kræves for vækst og udvikling, sårheling og immunrespons. Cellemigrering er kompleks og kræver koordinering af mange forskellige processer, herunder signaleringskaskader og omlejring af cytoskeletale komponenter. Celler kan bevæge sig tilfældigt (kemokinese) samt mod definerede kemiske gradienter (chemotaxis). Mange teknikker er blevet udviklet til at studere celle-migration in vitro. Den ældste og mest almindelige teknik, den Boydenkammer, består af en lodret to-kammer-system, hvor en chemoattractant Stoffet anbringes i den nederste kammer og celler af interesse er placeret i den øverste kammer ^1.. Overvåges Bevægelsen af ​​celler på tværs af gennemtrængelige filter med porer med defineret størrelse, der adskiller de to kamre. Yderligere teknikker er blevet udviklet for at undersøge cellemigration herunder Zigmond kammeret ² og Dunn kammer^3. Disse kollektive tilgange har givet betydelig indsigt i bevægelsen af ​​mange forskellige celletyper.

Ud over at udspørgende de grundlæggende principper for kemokinese og kemotaxi, har to-kammer assays lettet undersøgelsen af ​​cellemigrering gennem ekstracellulære matrixkomponenter og både endotelceller og epitelceller lag. En fordel ved to-kammer-systemer i forhold til andre teknikker er, at den porøse membran kan overtrækkes med proteiner, såsom collagen eller fibrinogen, og cellemigration over en ekstracellulær matrix-lignende barriere kan vurderes. Derudover kan dyrkede cellelinier dyrkes og differentieres på de gennemtrængelige understøtninger. For at undersøge bevægelsen af ​​celler på tværs af en endotel barriere er dyrkede endotelceller podes og dyrkes i det øvre reservoir af gennemtrængelige understøtninger. Motile celler, såsom immunceller, tilsættes til den øvre reservoir og migration ind i det nedre reservoir over enobserveres dothelial barriere i fysiologisk apikal-til-basolateral retning. Denne model har været uvurderlig i forståelsen ekstravasation af immunceller ud af blodet. I modsætning til transendothelial migration, forekommer typisk flytning af celler på tværs af en epitelbarriere i den basolaterale-til-apikal retning. For at modellere disse begivenheder in vitro forskere frø og vokse dyrkede epitelceller på undersiden af de gennemtrængelige understøtninger. Motile celler tilsættes til det øvre reservoir og migration over epitelbarrieren, repræsenterer den basolaterale-til-apikale retning, overvåges. Sådanne modeller af transepithelial migration har bidraget betydeligt til vores forståelse af inflammatoriske reaktioner på slimhindeoverflader, især i lungerne og gut ^4,5.

I modsætning hertil har immuncelle handel gennem epitel urinvejene fået meget mindre opmærksomhed. For at fremme vores understanding medfødte immunresponser i urinvejene under infektion med uropatogen Escherichia coli (UPEC), har vi udviklet et in vitro assay transuroepithelial neutrofil migration assay, der muliggør undersøgelse af polymorfkernede leukocyt (PMN; neutrofiler) bevægelse på tværs af en blære epitelbarrieren ^{6 -8.} Som med andre to-kammer modeller af transepithelial migration, er dyrkede humane blære epitelceller dyrket på undersiden af ​​en permeabel støtte og danner konfluerende epiteliale lag. Humane neutrofiler, isoleret fra venøst ​​blod, der anvendes til den basolaterale side af epithellaget og migration over epitelet i fysiologisk relevant basolaterale-til-apikale retning kvantificeres som reaktion på infektion med forskellige stammer af E. coli eller tilstedeværelsen af kemotiltrækkende molekyler. Meget forskning havde fokuseret på neutrofil bevægelse, både kemokinese og kemotaksi i fravær af yderligere celletyper. Den transuroepithelial neutrofilmigration analysen er fordelagtig, da det tager hensyn til komplekse vekselvirkninger mellem blære epitelceller og immunceller under infektion. Dette medgørlig in vitro-model har potentiale til at tillade detaljeret undersøgelse af immunreaktioner på uroepitele overflader.

Protocol

1.. Dyrkning 5637 Blære epithelialceller

Udfør følgende trin i en laminar strømning cellekultur hætte tilberedt med UV-bestråling og tørres af med 70% ethanol.

1. Forbered RPMI-1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) [betegnes RPMI +], filter steriliseres under anvendelse af en 0,22 um porestørrelse, og opvarmes til 37 ° C i et vandbad.
2. Optø en cryovial af 5637-celler (American Type Culture Collection HTB-9, stammer fra blærecarcinom) i et 37 ° C vandbad. Hurtigt overføre de optøede celler i en 75 ^cm2 vævskultur-kolbe indeholdende 20 ml RPMI +.
3. Inkubér kolbe ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% _CO2, indtil cellerne er omtrent 95% sammenflydende (~ 6 x 10 ⁶ celler pr kolbe), omkring 4 dage.
4. At videredyrke de 5637 celler:
   1. Fjern mediet fra kolben. Vask cellerne med 10 ml Dulbeccos phosphatbufret Saline (DPBS) ved stuetemperatur.
   2. Tilsæt 6 ml varm (37 ° C) 0,05% trypsin, 0,02% EDTA-opløsning i kolben, og der inkuberes ved 37 ° C med 5% _CO2 i 15 minutter.
   3. Overfør cellerne til et 15 ml konisk rør, og pelleten ved centrifugering ved 300 xg i 5 min. Fjern trypsin / EDTA-opløsning.
   4. Resuspender cellerne i 6 ml RPMI + (10 ⁶ celler / ml), og overføre 1 ml (10 ⁶ celler) til en ny 75 cm ^2-kolbe indeholdende 20 ml RPMI +.
5. Gentag trin 1,4 til videredyrke celler hver 4 dage, eller når cellerne når 95% konfluens.

2. Såning og Voksende 5637 Celler Permeable Understøtter

Udfør følgende trin i en vævskultur hætte ved hjælp af aseptisk teknik. For at opnå optimale resultater ved at bruge 5637 celler, der har undergået færre end 10 subkulturer.

1. Ved hjælp af steril pincet, vendes de gennemtrængelige understøtninger i en steril 25 mm dyb vævskulturskål.
2 kolbe på 5637 celler ved 95% konfluens i henhold til trin 1.4.1-1.4.3.
2. Ved hjælp af en 1.000 gl pipette forsigtigt opblande cellerne i ~ 2 ml RPMI + til en koncentration på 3 x 10 ⁶ celler / ml, bestemt ved celletælling ved hjælp af et hæmocytometer.
3. Anvend 50 pi af cellesuspensionen (1,5 x 10 ⁵ celler) til hver permeable støtte uden at røre membranen. Placer låget på skålen, og anbring forsigtigt fadet ved 37 ° C med 5% CO ₂ for ikke mere end 16 timer.
4. Brug steril pincet, højre gennemtrængelige understøtninger i en plade med 24 brønde indeholdende 0,6 ml RPMI + pr godt. Tilføj 0,1 ml RPMI + til øvre reservoir af hvert permeable support. Inkuberes ved 37 ° C med 5% _CO2.
5. Udskift mediet hver 2 dage. Først aspireres mediet fra den øvre reservoir, efterfulgt af den nedre reservoir, og derefter anvende frisk RPMI + i omvendt rækkefølge, til den nedre reservoir (0,6 ml) og derefter den øverste reservoir (0,1 ml).
6. Syv dage efter podning af gennemtrængelige understøtninger med 5637 celler vurdere sammenløbet af cellerne. Fyld øvre reservoir med RPMI + (~ 0,35 ml). Cellerne er tilstrækkeligt sammenflydende når mediet ikke ligevægt mellem de øvre og nedre reservoirer.

3. Forberedelse af bakteriel Inokulum

1. Brug aseptisk teknik, tilsættes 20 ml passende kultur bouillon til en 250 ml kolbe med en hætte. Brug Luria-Bertani (LB) bouillon til E. coli-kulturer og tilsætte antibiotika til bouillon, hvor det er hensigtsmæssigt.
2. Ved hjælp af en steril podning loop, pode bouillon med bakterier fra en glycerolstamopløsning eller en stribe plade. For UPEC stammer inkuberes bakteriekulturen ved 37 ° C i ca 16 timer, uden at ryste (for at fremme produktionen af ​​type 1-pili).
3. Overfør bakteriekultur til et centrifugerør. Pelletere bakterierne ved centrifugering ved 8.000 x g i 10 min.
4. Dekanteres supernatantenOg resuspendere bakterierne i PBS til _OD600 = 1,000, svarende til ~ 10 ⁹ CFU / ml.
   1. For at generere en varmedræbt bakteriel stimulus inkuberes en alikvot (f.eks ~ 1,5 x 10 ⁸ CFU i 150 ul) af de resuspenderede bakterier ved 55 ° C i 30 minutter. Plate en alikvot af varmedræbt suspension at bekræfte bakteriel død.
5. Umiddelbart før brugen fortyndes de resuspenderede bakterier (levende eller varme-dræbt) 10 gange til 10 ⁸ CFU / ml i varmt serum-frit RPMI [betegnet RPMI-] i et mikrofugerør.

4.. Isolering af humane neutrofiler fra perifert blod

Indsamlingen af ​​blod fra frivillige voksne kræver forudgående gennemgang og godkendelse fra en institutionel gennemgang bord. Bær passende personlige værnemidler og korrekt bortskaffelse af farlige materialer for at undgå udsættelse for menneskeblod.

1. Ca. 25 ml venøst ​​blod fra en sund voksen volunteer bør udarbejdes i 3 sterile natriumheparin-holdige blodtagningsglas af personale uddannet i tapning.
   1. Stramt wrap en gummi årepresse om overarmen, over albuen.
   2. Desinficer posten site, antecubital fossa, ved hjælp af en steril 70% spritserviet.
   3. Vedhæft et plastikrør holder til en vinget sommerfugl nål system.
   4. Stik nålen ind et antecubital vene ved en vinkel på 30 ° eller mindre, facet opad. Nålen har punkteret venen når en slutspurt af blod vises i plastslanger.
   5. Indsæt en blodopsamlingsrør i holderen plastrøret. Når den første opsamlingsrør er fuld, udskiftes med det andet opsamlingsrør. Gentag med det tredje rør.
   6. Når den tredje samling røret er ca halv fuld, fjernes årepresse.
   7. Dæk indstiksstedet med en steril vat og langsomt trække kanylen fra venen. Skub beskyttende skjold over kanylen og sted jegna af laboratoriet.
   8. Lægge pres på indstiksstedet. Dæk punkturstedet og vat med et plaster.
   9. Vend forsigtigt blodopsamlingsrør at sprede heparin.

Udfør følgende trin i en vævskultur hætte ved hjælp af aseptisk teknik.

2. Ved hjælp af en 10 ml pipette forsigtigt overføre blodet til en frisk, sterile 50 ml konisk rør. Tilføj en tilsvarende mængde på 3% (w / v) dextran i 0,9% NaCl og bland ved inversion. Inkubér glasset opretstående ved stuetemperatur i 20 minutter.
3. Uden at forstyrre det nederste lag, forsigtigt aspireres det øverste lag og overføre det til en ny 50 ml konisk rør. Pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 10 min. Supernatanten.
4. Resuspender cellepelleten i et volumen på 0,9% NaCl svarende til startvolumen af ​​blod.
5. Lag 10 ml densitetscentrifugering opløsning under cellesuspensionen, s.forbeholde grænsefladen mellem de to faser. Centrifuger ved 400 x g i 30 min uden bremse. Supernatanten.
6. At lysere de resterende røde blodlegemer, resuspenderes cellepellet i 10 ml koldt 0,2% NaCl. Inkuber i 30 sek, og derefter straks tilsættes 10 ml kold 1,6% NaCl til at genoprette isotoni.
7. Pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 6 min. Supernatanten.
8. Gentag trin 4,6-4,7 indtil cellepelleten synes at være fri for røde blodlegemer, typisk 3 runder lysis.
9. Ved hjælp af en 1.000 pi pipette resuspender cellepelleten primært PMN i varmt (37 ° C) RPMI-til en koncentration på 10 ⁷ celler / ml, bestemt ved celletælling under anvendelse af et hæmocytometer. Hold cellerne ved 37 ° C indtil anvendelse. Typisk PMN levedygtighed og renhed er> 99% som vurderet ved trypanblåteksklusion og visualisering af kernemorfologi efter farvning, hhv.

5.. Transuroepithelial neutrofilmigration Somsige

Udfør følgende trin i en vævskultur hætte ved hjælp af aseptisk teknik. Brug kun gennemtrængelige understøtninger bærer sammenflydende 5637 cellelag, som bestemt i trin 2.7. 24-brønds plader indeholdende RPMI-, kan fremstilles på forhånd og opbevares ved 37 ° C med 5% CO ₂ indtil anvendelse.

1. Afmål 1 ml varme RPMI-per brønd i en 24-brønds plade, forberede tre brønde pr permeable support.
2. Aspirer mediet fra de øvre og nedre reservoirer af de gennemtrængelige understøtninger.
3. Anvendelse af steril pincet overføre gennemtrængelige understøtninger til 24-brønds plade fremstillet i trin 5.1. Vask gennemtrængelige understøtninger tre gange ved at overføre understøtningerne fra brønd til brønd.
4. Hvis en bakteriel podestof skal anvendes, vendes gennemtrængelige understøtninger i en steril 25 mm dyb vævskulturskål. Hvis en chemoattractant (fx N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) eller IL-8) skal anvendes, gå videre til trin 5.6.
5. Til forsøg med levende eller dræbt bactErial stimuli, pode den apikale side af hver gennemtrængelige bærer med 60 pi RPMI-(mock-infektion) eller det bakterielle inokulum (6 x 10 ⁶ CFU) fremstillet i trin 3.5. Låget lægges på skålen, og der inkuberes ved 37 ° C med 5% _CO2 i 1 time.
6. Tilføj 0,6 ml RPMI-per brønd på en 24-brønds lav fastgørelsespladen; forberede en godt pr permeable support. Forbered 3 brønde indeholdende 0,5 ml RPMI-optælle PMN input.
   1. Hvis en kemoattraktant bliver brugt i stedet for bakterier, tilsættes kemoattraktanten til 0,6 ml RPMI-i 24-brønds plade fremstillet i trin 5.6.
7. Højre gennemtrængelige understøtninger ind i 24-godt lavt vedhæftet plade.
8. Tilføj 0,1 ml PMN (10 ⁶ PMN), fremstillet i trin 4.9, til den øvre reservoir (basolaterale side) af hver permeable support. Tilsæt 100 pi PMN direkte til brøndene indeholdende 500 pi RPMI-. Inkuberes ved 37 ° C med 5% _CO2 i 1 time.
9. Ved hjælp af steril pincet, forsigtigt skrabemembran gennemtrængelig støtte mod kanten af ​​brønden for at fjerne yderligere PMN fra den apikale side og derefter bortskaffe støtte.
10. Saml PMN ved forsigtigt at skrabe bunden af ​​hver godt med 1.000 ul pipettespids, og overføre PMN suspensioner til mikrocentrifugerør.
11. Opregne PMN ved hjælp af et hæmocytometer.
12. For at beregne det samlede antal PMN i den nederste reservoir, gange antallet af PMN i 1 mm ² (100 nl) ved 6.000. Data kan rapporteres som en procentdel af input PMN eller som PMN numre normaliseret til 10 ⁶ input PMN.

Representative Results

Den transuroepithelial neutrofil migration assay muliggør kvantitativ vurdering af menneskelige PMN-migration over dyrkede blære epitelcelle lag som reaktion på forskellige stimuli (figur 1B). Mens protokollen er ligetil, er der en række variable, der kan påvirke PMN migration og dermed påvirke reproducerbarheden af ​​denne assay. Der bør træffes foranstaltninger, mens udarbejdelsen af ​​de gennemtrængelige understøtninger og PMN at mindske variationen mellem de tekniske og biologiske gentagelser. For eksempel bør kun gennemtrængelige understøtninger indeholdende tilstrækkeligt konfluerende 5637 cellelag skal anvendes i et forsøg. Sammenløbet af 5637 celler vurderes ved hjælp af en funktionel analyse, der måler uigennemtrængelighed for væske. Hvis medium tilsat til den øvre reservoir ækvilibrerer over den permeable support, derefter 5637 celler ikke er tilstrækkeligt sammenflydende at gennemføre eksperimentet. Hvis lydstyrken i den øvre reservoir opretholdes, så strømledendekan anvendes i stand til støtte til at vurdere PMN migration. Vi har målt transepithelial elektriske modstand i dette system, der stiger beskedent ved sammenløbet af cellerne, hvis denne metode vælges, bør være forsigtig med ikke at forurene ellers sterile setup. Sammenløbet af 5637 celler 7 dage efter podning kan påvirkes af flere faktorer, herunder passagen antallet af celler og antallet af celler podet på det permeable support. Desuden skal mængden af tid, at de 5637 celler inkuberes på den gennemtrængelige støtte i omvendt stilling under såning ikke overstige 16 timer (figur 1A). For optimal reproducerbarhed, bør protokol følges præcist. Endelig bør gennemtrængelige understøtninger indeholdende sammenflydende 5637 cellelag anvendes inden for 1-2 dage, og membraner i støtterne må aldrig røre enten under vækst af 5637 celler eller under transuroepithelial neutrofilmigration assay.

I enddition til 5637 celler, variabilitet også indføres i løbet af PMN forberedelse. Under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor for at isolere PMN 1 ml humant blod giver typisk omkring 10 ⁶ PMN, selv om dette antal varierer fra individ til individ. Når den typiske udbytte af en individuel donorens blod er kendt, kan isolation protokollen blive skaleret op eller ned i overensstemmelse hermed. PMN fra usunde eller syge individer bør undgås, og forskellige PMN donorer bør anvendes til biologiske gentagelser for at sikre, at observerede resultater er reproducerbare. PMN skal håndteres forsigtigt og aseptisk for at undgå aktivering under isolation. Endelig, timingen af ​​de eksperimentelle procedurer er afgørende, da PMN ikke overlever i længere tid, når fjernet fra kroppen. Vi udnytter PMN indenfor 1 time at fuldføre det isolation procedure. På baggrund af disse overvejelser bør mindst 3 tekniske replikater indgå i hver biologisk kopiere.

Antallet afPMN i den nedre reservoir efter 1 time er vist i (fig. 2) normaliseret til 10 ⁶ input PMN. Alternativt kan PMN tal sammenlignes med en intern kontrol efter normalisering til input PMN, hvilket kan reducere variation mellem biologiske gentagelser. Overholdelse af protokollen beskrevet ovenfor med sans for detaljer gør det muligt for optælling af PMN migration som reaktion på stimuli herunder bakterier (figur 2a) og kemotiltrækkende stoffer (figur 2b).

Figur 1. Skematisk af eksperimentelle design. (A) 5637 blære epitelceller udsås på inverterede gennemtrængelige understøtninger, er understøtningerne rettede i en plade med 24 brønde, og cellerne dyrkes til konfluens. (B) Permeable understøtninger indeholdende sammenflydende 5637 celler inverteret og inficeret med E. coli på den apikale side af epiteliale lag. Alternativt kan kemoattraktanter placeres i det nederste reservoir. De gennemtrængelige understøtninger er rettede i en lav-vægpladen og frisk isolerede humane PMN anvendes på den øvre reservoir (der repræsenterer den basolaterale side af epiteliale lag). PMN migrere over slimhinder og optælles fra den nedre reservoir ved hjælp af et hæmocytometer.

Figur 2. PMN migrere tværs blære epithel som reaktion på forskellige stimuli. (A) Infektion med patogene E. coli stamme MG1655, varmedræbt MG1655 (HKMG) eller UPEC mutant UTI89 ybcL :: cat fremkalder betydeligt mere PMN migration end fingeret infektion eller infektion med vildtype-UPEC stamme UTI89 en blærebetændelse isolere (*, p <0,001). (B) Tilsætning af fMLF (100 nM) eller IL-8 (100 ng / ml) til de nedre reservoir resulterer i betydeligt mere PMN migration end fingeret behandling (*, p <0,001). Data repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen fra mindst 3 biologiske replikater. Statistisk signifikante forskelle blev bestemt ved anvendelse af en uparret Students t-test.

Discussion

Ved hjælp af en dyrket blære epitelcellelinie og frisk isolerede humane PMN etablerede vi en in vitro model af transuroepithelial neutrofil migration. Denne model har været medvirkende begynder at dissekere kompleksiteten i respons det medfødte immunforsvar i løbet af urinvejsinfektion (UTI), en yderst almindelig bakteriel infektion typisk forårsaget af UPEC ^9.. Under infektion af blæren eller blærebetændelse, er afgørende for bakteriel clearance ¹⁰ rekruttering af PMN til blæren lumen. At etablere et fodfæste i ansigtet af en inflammatorisk reaktion, UPEC forsinke ankomsten af PMN til blæren, hvilket forlænger den periode, hvor UPEC kan invadere blæren epitel i fravær af immun pres ^6,11. Denne fænotype, undertrykkelse af PMN migration ved UPEC på tidlige tidspunkter, er observeret i vores in vitro-model af transuroepithelial PMN migration. Infektion med patogene E. coli MG1655 fremkalderbetydeligt mere PMN migration end infektion med uropatogen E. coli UTI89 (figur 2A), co-infektion med MG1655 og UTI89 giver den uropatogen fænotype (dvs. lave niveauer af PMN migration) ^6.. Endvidere har vi identificeret en UPEC protein YbcL, der bidrager til den undertrykkende fænotype, som udgår ybcL resulterede i betydeligt mere PMN i den nedre reservoir i forhold til vildtype-UTI89 (figur 2A) ^7. Høje niveauer af PMN migration blev også fremkaldt af varmedræbt MG1655, fMLF og IL-8 (figur 2A og B). I forhold til infektion med en levende bakteriel stimulus, kan brugen af ​​kemoattraktanter forenkle både forsøgsprotokollen og fortolkning af resultater. Det er sandsynligt, at andre kemoattraktanter (fx bakterielle produkter eller chemokiner), ligeledes vil fremkalde PMN i denne model. Hidtil har transuroepithelial neutrofilmigration røvay har lettet undersøgelser undertrykkelse af den tidlige inflammatoriske respons ved UPEC, afslører fænotyper, der er blevet verificeret i in vivo modeller ^6-8, og vil være et uvurderligt redskab i fremtidige bestræbelser.

Mens denne analyse har potentiale til at løse en række spørgsmål, der er et par begrænsninger. I betragtning af antallet af variabler iboende denne analyse skal passes, mens forberede og gennemføre eksperimenter til at sikre reproducerbarhed mellem gentagelser. Opremse PMN ved optælling er tilbøjelig til fejl, da optællingen kan være tidskrævende og PMN er kortlivede engang fjernet fra kroppen, især i tilstedeværelsen af ​​bakterier. Reducere tiden mellem PMN prøvetagning og PMN tælling vil resultere i mere nøjagtige dataindsamling. Forskere har beskrevet kolorimetriske assays, der måler myeloperoxidase (MPO) enzymaktivitet som et surrogat for PMN ^12,13. Analyser der anvender kolorimetriske substrater såsom 3,3 &# 39, 5,5 ',-tetramethylbenzidin (TMB) eller 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS) ikke er tilstrækkelig følsom til at påvise koncentrationen af ​​PMN til stede i den nedre reservoirer ved hjælp af transuroepithelial neutrofilmigration protokol beskrevet ovenfor (Lau og Hunstad, upublicerede data). Parametrene for migration assay kan manipuleres til at øge PMN-tætheden i de nedre reservoir prøver. Alternativt kan der etableres en MPO assay med større følsomhed, potentielt udnytte en fluorescerende substrat. Måling af MPO aktivitet udgør et alternativ til PMN tælling og kan muliggøre en mere præcis opregning af PMN i de lavere reservoir prøver. Derudover kan en sådan analyse også give tælling af PMN klæbende til epitel lag og tilbage i den øverste reservoir. En valideret MPO-baseret protokol vil udgøre et kraftfuldt værktøj, der kan udvide mængden og typen af ​​data, der kan indsamles fra transuroepithelial neutrofil migration assay.

Transepithelial neutrofilmigration assays modellerer medfødte immunrespons i mave-tarmkanalen og lunge er udbredt og er ansvarlige for vores nuværende forståelse af traversal af epitelial barrierer ved PMN ^4,5. I modsætning hertil har PMN bevægelse tværs uroepitele barrierer fået langt mindre opmærksomhed. Gem og kolleger har rapporteret om en model, der bruger en polariseret epitel består af differentierede UROtsa celler, en udødeliggjort cellelinie stammer fra ureter væv, vokset til sammenflydning på gennemtrængelig understøtter ^14. Agace og kolleger har rapporteret brug af udifferentierede blære (J82) og nyre (A498) epitelceller i en lignende model ^15.. I transuroepithelial neutrofilmigration model beskrevet heri, selvom 5637 cellelag er ikke stratificeret og sandsynligvis ikke formelt polariseret, dannes stramme vejkryds, vurderet ved uigennemtrængelighed for makromolekylæreflux og udtryk og lokalisering af tight junction proteiner (Lau og Hunstad, upublicerede data). Notatet, også epithellaget opretholder sådan uigennemtrængelighed under infektion betingelser, vi har beskrevet. De protokoller, rapporteret af Säve og Agace modellere inflammatoriske respons efter infektion med UPEC isolater i 24 timer. I disse modeller UPEC fremkalde robust PMN migration. I modsætning hertil er de epiteliale lag i vores model udsættes for UPEC for en relativt kort periode, 1 time med henblik på at undersøge de indledende vekselvirkninger mellem vært og patogen. Endvidere er anvendelsen af en blære epitelcellelinie og blærebetændelse-afledt UPEC isolere muliggør potentiel translation af in vitro-resultaterne til den murine blærebetændelse model ^16. Endelig undersøgelserne nævnt ovenfor udnyttede store gennemtrængelige understøtninger, der kræver 6 såvel vævsdyrkningsskåle. Anvendelsen af ​​mindre gennemtrængelige understøtninger, som i vores model reducerer reagens brug og øger antallet af indsatsens, der kan manipuleres per eksperiment. Selv om hver af disse modelsystemer har fordele og ulemper, at det kollektive potentiale i disse modeller definerer begivenheder, der kræves for PMN migration til urinvejsinfektioner væv er betydelig.

Selvom mindre godt forstået end migration over endotel barrierer, er passagen af PMN tværs gastrointestinale og pulmonale epitelial barrierer fået megen studie ^4,5. Transepithelial neutrofilmigration modeller, der beskæftiger permeable støtter og dyrkede epitelceller har afsløret nogle af de signalveje begivenheder og adhæsionsmolekyler involveret i bevægelsen af ​​PMN gennem disse epithel. Indledende undersøgelser under anvendelse af dyrkede urin epitelceller antyder inddragelsen af intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) og β-integrinet CD11b/CD18 (Mac-1) i PMN-migration over urin væv ^15. Det er uklart, hvilke yderligere signalveje og klæbende molekyler er involvereti disse komplekse processer i urinvejene. Brug af transuroepithelial neutrofilmigration model beskrevet heri, måske udvidet med mikroskopisk undersøgelse ^14,15 kan interrogeres disse grundlæggende spørgsmål og mange andre. Derudover er der i forbindelse med bakterielle genetik, denne model kan anvendes til yderligere at evaluere patogen-specifikke fænotyper, såsom undertrykkelse af PMN migration ved UPEC. Det er uklart, på hvilket tidspunkt i multi-trins proces af PMN migration UPEC udøver sin undertrykkende effekt. Også den mekanisme, hvormed YbcL indflydelse PMN migration er endnu ikke belyst. Ved først at forstå de grundlæggende krav til passage af PMN over blæren epitel, kan vi så begynde at undersøge, hvordan UPEC manipulerer disse processer for at lette sygdom.

Sammenfattende mens mange teknikker eksisterer for at studere bevægelsen af ​​celler, er til rådighed til at afhøre cellemigration over cellulære barrierer færre tilgange. Modifications til Boydenkammer har været integreret undersøge cellemigration over endotel-og epitel-barrierer. En medgørlig in vitro model af akut inflammatorisk respons i urinvejene, såsom transuroepithelial neutrofil migration assay beskrevet heri, er et værdifuldt redskab til interrogering disse komplekse processer. Endelig kan ændringer til dette assay lette efterforskningen i andre sygdomstilstande i urinvejene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell Inserts (i.e. permeable supports)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution	GE Healthcare	17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates	Corning	3473	24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8	R&D Systems	208-IL	Reconstituted in PBS to 100 μg/ml