Kvantitativ vurdering av Menneskelig Neutrophil Migration Across en kultivert Blære Epitel

Summary

Vi har utviklet en in vitro-modell som etterligner en viktig komponent i den akutte betennelsesresponsen under infeksjon av blæren med uropathogenic Escherichia coli. Den transuroepithelial nøytrofil migrering analysen muliggjør kvantitativ vurdering av human neutrofil migrering over blæren epitel, kultivert på gjennomtrengelige bærere, som reaksjon på bakteriell infeksjon eller kjemotiltrekkende stoffer.

Abstract

Rekrutteringen av immunceller fra periferien til stedet av betennelse er et viktig skritt i det medfødte immunrespons til enhver slimhinneoverflaten. Under infeksjon i urinblæren, polymorfnukleære leukocytter (PMN, nøytrofile) migrere fra blodet og traversere blæren epitel. Unnlatelse av å løse infeksjon i fravær av en nøytrofil respons demonstrerer viktigheten av PMN i blæren forsvar. For å lette kolonisering av blæren epitel, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), den utløsende agent for de fleste urinveisinfeksjoner (UVI), dempe den akutte betennelsesreaksjon ved hjelp av en rekke delvis definerte mekanismer. For ytterligere å undersøke samspillet mellom verten og bakteriell patogen, har vi utviklet en in vitro modell av dette aspektet av den medfødte immunrespons til UPEC. I transuroepithelial nøytrofile migrasjon analysen, en variant på Boyden kammer, kultivert blære epithelial celler blir dyrket til konfluens på undersiden av en permeabel støtte. PMN blir isolert fra humant venøst ​​blod, og er anvendt på basolateral side av blæren epiteliale cellelagene. PMN migrering representerer fysiologisk relevant basolateral-til-apikal retning som reaksjon på bakteriell infeksjon eller kjemotiltrekkende molekyler er nummerert ved hjelp av et hemocytometer. Denne modellen kan brukes til å undersøke samspillet mellom UPEC og eukaryote celler samt å avhøre de molekylære krav til traversering av blæren epitel av PMN. Den transuroepithelial nøytrofile migrasjon modellen vil videreutvikle vår forståelse av den innledende betennelsesreaksjon til UPEC i blæren.

Introduction

Bevegelsen av celler i hele kroppen, ofte over lange avstander, er nødvendig for vekst og utvikling, sårheling og immunrespons. Celle migrasjon er komplekse og krever samordning av mange ulike prosesser, herunder signal kaskader og omorganisering av cytoskeletal komponenter. Celler kan flytte tilfeldig (chemokinesis) samt mot definerte kjemiske gradienter (kjemotaksis). Mange teknikker har blitt utviklet for å studere cellemigrering in vitro. Den eldste og mest vanlige teknikk, Boyden kammer, består av en vertikal to-kammersystem hvor en kjemoattraktant substans er plassert i bunnkammeret og celler av interesse er plassert i den øverste kammeret ^1. Bevegelsen av cellene på tvers av gjennomtrengelige filter med porer av definert størrelse, separering av de to kamre er overvåket. Andre teknikker har blitt utviklet for å undersøke cellemigrasjon, inkludert Zigmond kammeret ² og Dunn kammeret^Tre. Disse kollektive tilnærminger har gitt betydelig innsikt i bevegelsen av mange forskjellige celletyper.

I tillegg til å avhøre de grunnleggende prinsippene for chemokinesis og kjemotaksis, har to-kammer analyser tilrettelagt etterforskningen av cellemigrasjon gjennom ekstracellulære matrix komponenter og både endothelial og epiteliale cellelagene. En fordel med to-kammer-systemer i forhold til andre teknikker, er at den porøse membran kan være belagt med proteiner som kollagen og fibrinogen, og cellemigrasjon på tvers av en ekstracellulær matriks-lignende barriere kan vurderes. I tillegg kan dyrkede cellelinjer dyrkes og differensieres på permeable støtter. For å undersøke bevegelsen av cellene over en endotelisk barriere, er dyrkede endoteliale celler utsådd og dyrket i det øvre reservoar av de gjennomtrengelige bærere. Bevegelige celler, slik som immunceller, tilsettes til det øvre reservoar, og migrering inn i det nedre reservoar over endothelial barriere i den fysiologiske apikal-til-basolateral retning er observert. Denne modellen har vært uvurderlig i å forstå bloduttredelse av immunceller ut av blodet. I motsetning til transendothelial migrasjon, bevegelse av cellene over en epitelial barrieren oppstår typisk i basolateral-til-apikal retning. For å modellere slike hendelser in vitro, forskere frø og vokse dyrkede epitelceller på undersiden av den gjennomtrengelige bærere. Motile celler blir tilsatt til det øvre reservoar, og migreringen tvers av epiteliale barriere, som representerer den basolateral-til-apikal retning, blir overvåket. Slike modeller av transepithelial migrasjon har bidratt vesentlig til vår forståelse av betennelsesreaksjoner på slimhinner, spesielt de av lunge og gut ^4,5.

I kontrast, har immunceller menneskehandel gjennom epitelet i urinveiene fått mye mindre oppmerksomhet. For å videreutvikle vår understanding av medfødte immunresponser i urinveiene under infeksjon med uropathogenic Escherichia coli (UPEC), utviklet vi en in vitro assay, den transuroepithelial nøytrofile migrasjon analysen, som gjør at etterforskningen av polymorfonukleære leukocytter (PMN, nøytrofile) bevegelse over en blære epiteliale barriere ^{6 -8.} Som med andre to-kammer-modeller av transepithelial migrasjon, blir dyrkede humane blære epitelceller dyrket på undersiden av en permeabel støtte og danner konfluente epiteliale lag. Humane nøytrofiler, isolert fra venous blod, påføres den basolateral side av epitellaget, og migrasjon på tvers av epitelet i fysiologisk relevant basolateral-til-apikal retningen er kvantifisert som svar på infeksjon med forskjellige stammer av E. coli-eller i nærvær av chemoattractant molekyler. Mye forskning har fokusert på nøytrofil bevegelse, både chemokinesis og chemotaxis, i fravær av andre celletyper. Den transuroepithelial nøytrofile migrasjon analysen er en fordel som det tar hensyn til komplekse interaksjoner mellom blære epitelceller og immunceller under infeksjon. Dette medgjørlig in vitro modell har potensial til å tillate detaljert undersøkelse av immunresponser ved uroepithelial overflater.

Protocol

En. Dyrkning 5637 Blære Epitelceller

Utfør følgende trinn i en laminær vev-kultur hette forberedt med UV-bestråling og tørkes ned med 70% etanol.

1. Forbered RPMI-1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) [betegnet RPMI +], filtersteriliser ved hjelp av et 0,22 mikrometer porestørrelse filter, og varm til 37 ° C i et vannbad.
2. Tin en cryovial av 5637-celler (American Type Culture Collection HTB-9; avledet fra blære karsinom) i et 37 ° C vannbad. Raskt overfører de tinte celler til en 75 ^cm2 vevskultur-kolbe inneholdende 20 ml RPMI +.
3. Inkuber i kolben ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% _CO2 inntil cellene er omtrent 95% sammenflytende (~ 6 ⁶ x 10 celler pr kolbe), omtrent 4 dager.
4. Å subkultur de 5637 cellene:
   1. Fjern mediet fra kolben. Vask cellene med 10 ml Dulbeccos Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ved romtemperatur.
   2. Tilsett 6 ml varm (37 ° C) 0,05% trypsin, 0,02% EDTA-løsning til kolben, og inkuberes ved 37 ° C med 5% _CO2 i 15 minutter.
   3. Overfør cellene til en 15 ml konisk rør og pellet ved sentrifugering ved 300 x g i 5 min. Fjern trypsin / EDTA-løsning.
   4. Resuspender cellene i 6 ml RPMI + (10. ⁶ celler / ml), og overføre 1 ml (10 ^seks celler) til en ny 75 cm ^2-kolbe inneholdende 20 ml RPMI +.
5. Gjenta trinn 1,4 til subkultur celler hver 4. dag, eller når cellene når 95% samløpet.

2. Seeding og voksende 5637 Celler på Utette Støtter

Utfør følgende trinn i en vev kultur hette med aseptisk teknikk. For optimalt resultat ved å bruke 5637 celler som har gjennomgått færre enn 10 subkulturer.

1. Bruk sterile pinsetter, invertere permeable støtter i en steril 25 mm dype vev kultur parabolen.
2 kolbe av 5637 celler på 95% samløpet i henhold til trinn 1.4.1-1.4.3.
2. Ved hjelp av en 1000 mL pipette, forsiktig resuspender cellene i ~ 2 ml RPMI + til en konsentrasjon på 3 x 10 ^{til 6} celler / ml, bestemt ved celletelling under anvendelse av hemocytometer.
3. Påfør 50 ul av cellesuspensjonen (1,5 x 10 ⁵ celler) til hver gjennomtrengelige støtte uten å berøre membranen. Sett lokket på fatet, og nøye plassere fatet ved 37 ° C med 5% CO ₂ for ikke mer enn 16 timer.
4. Bruk sterile pinsetter, høyre de permeable støtter inn i en 24-brønns plate som inneholder 0,6 ml RPMI + per brønn. Til 0,1 ml RPMI + til det øvre reservoar av hver gjennomtrengelig støtte. Inkuber ved 37 ° C med 5% CO _2.
5. Sett på medium hver 2 dager. Først aspirat medium fra det øvre reservoaret, etterfulgt av det nedre reservoar, og deretter anvende friskt RPMI + i motsatt rekkefølge, til det nedre reservoaret (0,6 ml), og deretter den øvre Reservoir (0,1 ml).
6. Syv dager etter seeding de permeable støtter med 5637 celler, vurdere samløpet av cellene. Fyll det øvre reservoar med RPMI + (~ 0,35 ml). Cellene blir tilstrekkelig sammenflytende når mediet ikke likevekt mellom de øvre og nedre reservoarer.

Tre. Utarbeidelse av Bakteriell Inokulum

1. Ved hjelp av aseptisk teknikk, tilsett 20 ml av passende kulturkraft i en 250 ml kolbe med en hette. Bruk Luria-Bertani (LB) kjøttkraft for E. coli-kulturer, og legge antibiotika til suppen der det er hensiktsmessig.
2. Ved hjelp av en steril inokulasjon loop, vaksinere suppen med bakterier fra en glyserol lager eller en strek plate. For UPEC stammer, inkuber bakteriekultur ved 37 ° C i omtrent 16 timer uten rysting (for å fremme produksjon av type 1 pili).
3. Overfør den bakteriekultur i et sentrifugerør. Pellet bakteriene ved sentrifugering ved 8000 xg i 10 min.
4. Dekanter supernatantenOg resuspender bakterier i PBS å OD ₆₀₀ = 1,000, tilsvarende ~ 10 ⁹ CFU / ml.
   1. For å generere en varme-drepte bakterie stimulus, inkubere en aliquot (f.eks ~ 1,5 x 10 CFU ⁸ i 150 pl) av de resuspenderte bakteriene ved 55 ° C i 30 min. Plate en delmengde av varme-drepte suspensjonen for å bekrefte bakteriell død.
5. Umiddelbart før bruk fortynnes de resuspenderte bakterier (bor eller varme-drepte) 10-fold til 10 ⁸ CFU / ml i varm serumfritt RPMI [betegnet RPMI-] i et mikro-sentrifugerør.

4. Isolering av Menneskelig Neutrophils fra perifert blod

Samlingen av blod fra voksne frivillige krever forhånds gjennomgang og godkjennelse fra en institusjonell gjennomgang bord. Bruk egnet personlig verneutstyr og avhende farlige materialer for å unngå eksponering for menneskeblod.

1. Omtrent 25 ml av venøs blod fra en frisk voksen volunteer bør trekkes inn i tre sterile natriumheparin holdig blod samling rør av ansatte opplært i blodprøvetaking.
   1. Tett vikle en gummi tourniquet rundt overarmen, over albuen.
   2. Desinfiser oppføring hotellet, antecubital fossa, ved hjelp av en steril 70% alkohol tørk.
   3. Fest et plastrør holder til en bevinget sommerfugl nål system.
   4. Stikk nålen inn en antecubital blodåre på en 30 ° vinkel eller mindre, skråkant vendt opp. Nålen har punktert venen når en sprute blod kommer frem i plastrør.
   5. Sett inn en blodprøverøret inn i plastrøret holderen. Når den første samlingen røret er fullt, erstatte med den andre samlingen tube. Gjenta fremgangsmåten med det tredje røret.
   6. Når den tredje samling rør er omtrent halvfull, fjern tourniquet.
   7. Dekk stikkstedet med en steril bomullsdott og trekk sakte nål fra venen. Skyv den beskyttende skjold over nål og sted jegna biohazard Sharps container.
   8. Press mot stikkestedet. Dekk til stikkstedet og bomullsdott med et plaster.
   9. Vend forsiktig blod samling rør for å spre heparin.

Utfør følgende trinn i en vev kultur hette med aseptisk teknikk.

2. Ved hjelp av en 10 ml pipette, forsiktig overføre blodet til et friskt, sterilt 50 ml konisk rør. Til et tilsvarende volum av 3% (w / v) dekstran i 0,9% NaCl og blandes ved inversjon. Inkuber røret stående ved romtemperatur i 20 min.
3. Uten å forstyrre den nedre sjikt, omhyggelig aspirer det øvre laget og overføre den til en ny 50 ml konisk tube. Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min. Kast supernatanten.
4. Resuspender cellepelleten i et volum av 0,9% NaCl tilsvarende utgangsvolumet av blod.
5. Laget 10 ml av densitets-sentrifugering-løsning i henhold til cellesuspensjonen, preservere grensesnittet mellom de to fasene. Sentrifuger ved 400 xg i 30 min uten brems. Kast supernatanten.
6. For å lysere gjenværende røde blodlegemer, cellepelleten suspenderes i 10 ml kald 0,2% NaCl. Inkuber i 30 sek, og deretter straks tilsett 10 ml kald 1,6% NaCl for å gjenopprette isotonisitet.
7. Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 6 min. Kast supernatanten.
8. Gjenta trinn 04.06 til 04.07 frem til cellen pellet ser ut til å være fri for røde blodceller, vanligvis tre runder med lyse.
9. Ved hjelp av en 1,000 ul pipette, cellepelleten suspenderes, i første rekke PMN, i varmt (37 ° C) RPMI-til en konsentrasjon av 10 ⁷ celler / ml, bestemt ved celletelling under anvendelse av hemocytometer. Hold cellene ved 37 ° C før bruk. Vanligvis PMN levedyktighet og renhet er> 99% som vurderes av trypanblått eksklusjon og visualisering av kjernefysisk morfologi etter farging, henholdsvis.

5. Transuroepithelial Neutrophil Migration Assi

Utfør følgende trinn i en vev kultur hette med aseptisk teknikk. Bruk kun permeable støtter peiling konfluente 5637 cellelag, som bestemt i trinn 2.7. De 24-brønns skåler inneholdende RPMI-kan fremstilles på forhånd og holdt ved 37 ° C med 5% _CO2 inntil bruk.

1. Delmengde 1 ml varme RPMI-per brønn i en 24-brønns plate; forberede tre brønner per gjennomtrengelig støtte.
2. Aspirere mediet fra den øvre og nedre reservoarer av de permeable bærere.
3. Ved hjelp av sterile pinsetter, overfører de permeable støttene til den 24-brønns plate fremstilt i trinn 5.1. Vask de permeable støtter tre ganger ved å overføre støttene fra brønn til brønn.
4. Hvis en bakteriepodestoff skal brukes, snus de permeable bærere i et sterilt 25 mm dype vev dyrkningsskål. Hvis en kjemoattraktant (f. eks, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) eller IL-8) som skal benyttes, fortsett til trinn 5.6.
5. For eksperimenter med levende eller drept bacterial stimuli, inokulere den apikale side av hver gjennomtrengelig støtte med 60 pl RPMI-(mock-infeksjon), eller med det bakterielle inokulat (6 x 10 ⁶ CFU) fremstilt i trinn 3.5. Sett lokk på komfyr og inkuberes ved 37 ° C med 5% _CO2 i 1 time.
6. Tilsett 0,6 ml RPMI-per brønn til en 24-brønnen lav festeplate; forberede en godt per gjennomtrengelig støtte. Forbered tre brønner som inneholder 0,5 ml RPMI-å nummerere PMN innspill.
   1. Hvis en kjemoattraktant blir brukt i stedet for bakterier, tilsett chemoattractant til 0,6 ml RPMI-i 24-brønns plate fremstilt i trinn 5.6.
7. Høyre de permeable støttene til 24-vel lav festeplate.
8. Til 0,1 ml PMN (10 ^6. PMN), fremstilt i trinn 4.9, i den øvre reservoaret (basolateral side) av hver gjennomtrengelig støtte. Tilsett 100 ul PMN direkte til brønner inneholdende 500 pl RPMI-. Inkuber ved 37 ° C med 5% _CO2 i 1 time.
9. Ved hjelp av steril tang, forsiktig skrapeMembranen av den gjennomtrengelige støtte mot kanten av brønnen for å fjerne overskytende for PMN fra den apikale side og deretter kastes bæreren.
10. Samle PMN ved forsiktig å skrape bunnen av hver brønn med 1000 mL pipettespissen, og overføre PMN-suspensjoner i mikrofugerør.
11. Nummerere PMN ved hjelp av en hemocytometer.
12. For å beregne det totale antall PMN i nedre reservoaret, multiplisere antall PMN i 1 mm ² (100 nl) etter 6000. Data kan bli rapportert som en prosentandel av innspill PMN, eller som PMN tall normalisert til 10 ⁶ innspill PMN.

Representative Results

Den transuroepithelial nøytrofil migrering analysen muliggjør kvantitativ vurdering av human PMN migrasjon over dyrkede blære epitelial cellelagene i respons til forskjellige stimuli (figur 1B). Mens protokoll er enkel, er det et antall variabler som kan påvirke PMN migrasjon og følgelig påvirker reproduserbarheten av denne analysen. Tiltak bør tas ved utarbeidelsen av permeable støtter og den PMN å redusere variasjonen mellom tekniske og biologiske replikater. For eksempel bør bare permeable bærere inneholdende tilstrekkelig konfluente 5637 cellelag bli brukt i et eksperiment. Samløpet av 5637 celler er vurdert ved hjelp av en funksjonsanalyse som måler impermeabilitet til væske. Hvis mellom tilsatt til det øvre reservoar equilibrates over det gjennomtrengelige støtte, da 5637-celler er ikke i tilstrekkelig grad konfluent å utføre forsøket. Hvis volumet i det øvre reservoaret opprettholdes, så den slipper gjennomstand støtte kan brukes til å vurdere PMN migrasjon. Vi har målt transepithelial elektrisk motstand i dette systemet, som stiger beskjedent ved samløpet av cellene, hvis denne metoden er valgt, bør man være forsiktig for ikke å forurense ellers sterile oppsett. Løpet av 5637-celler 7 dager etter såing kan påvirkes av flere faktorer, blant annet passasjen antall celler og antall celler sådd på det gjennomtrengelige støtte. I tillegg bør mengden av tid som 5637 celler blir inkubert på den gjennomtrengelige støtte i den omvendte stilling under såing ikke overstige 16 timer (figur 1A). For optimal reproduserbarhet, bør protokollen følges nøye. Til slutt bør permeable bærere inneholdende sammenflytende cellelag 5637 brukes i løpet av 1-2 dager, og membranene i bærerne bør aldri bli rørt enten under veksten av 5637-celler eller i løpet av transuroepithelial neutrofil migrering assay.

I enapparat.Foruten de 5637 cellene, kan variabilitet også bli innført i løpet av PMN forberedelse. Ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor for å isolere PMN, 1 ml humant blod gir typisk ca 10 ⁶ PMN, selv om dette antallet varierer fra individ til individ. Når typisk utbytte av en enkelt donor blod er kjent, kan isolasjonsprotokoll skaleres opp eller ned tilsvarende. PMN fra helseskadelige eller syke individer bør unngås, og forskjellige PMN-donorer bør brukes for biologiske replikater for å sikre at resultatene observert er reproduserbare. PMN skal håndteres forsiktig og under aseptiske betingelser for å unngå aktivering under isolering. Til slutt, er tidspunktet for de eksperimentelle prosedyrer avgjørende, som PMN ikke overleve i lengre perioder av gangen en gang fjernet fra kroppen. Vi benytter PMN innen en time å fullføre isolasjonsmetoden. Gitt disse hensynene, bør minst tre tekniske gjentak inngå i hver biologisk replikere.

AntalletPMN i det nedre reservoar etter 1 time er vist i (fig. 2) normalisert til 10 ^seks inngangs PMN. Alternativt kan PMN tallene sammenlignes med en intern kontroll etter normalisering til innspill PMN, noe som kan redusere variasjonen mellom biologiske replikater. Etterlevelse protokollen skissert ovenfor med fokus på detaljer gjør at telling av PMN migrasjon i respons på stimuli, inkludert bakterier (Figur 2A) og kjemoattraktant stoffer (Figur 2b).

Figur 1. Skjematisk av eksperimentell design. (A) 5637 blære epitelceller blir utsådd på omvendte gjennomtrengelige bærere, er støttene rettet inn i en 24-brønners plate, og cellene er dyrket til de flyter sammen. (B) PermeaBLE bærere inneholdende konfluente 5637 celler blir invertert og infisert med E. coli på den apikale side av epiteliale lag. Alternativt kan chemoattractants bli plassert i det nedre reservoar. De gjennomtrengelige bærere er rettet i en lav-festeplate, og ferskt isolerte human PMN påføres det øvre reservoaret (som representerer basolateral side av epiteliale lag). PMN vandrer på tvers av epitel og er nummerert fra det nedre reservoaret ved hjelp av et hemocytometer.

Figur 2. PMN vandrer på tvers av blæren epitel som respons på forskjellige stimuli. (A) Infeksjon med ikke-patogent E. coli stamme MG1655, varme drept MG1655 (HKMG) eller UPEC mutant UTI89 ybcL :: katt utløser betydelig mer PMN migration enn mock infeksjon eller infeksjon med vill-type stamme UPEC UTI89, en cystitt isolere (*, p <0,001). (B) Tilsetning av fMLF (100 nM) eller IL-8 (100 ng / ml) til det nedre reservoaret resulterer i en betydelig mer PMN migrering enn uekte behandling (*, p <0,001). Dataene representerer gjennomsnitt og standardavvik fra minst tre biologiske replikater. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt med en uparet Student t-test.

Discussion

Ved hjelp av en kultivert blære epitelial cellelinje og fersk isolert human PMN, etablerte vi en in vitro modell av transuroepithelial nøytrofile migrasjon. Denne modellen har vært instrumental i ferd med å dissekere kompleksiteten i det medfødte immunrespons under urinveisinfeksjon (UVI), en svært vanlig bakteriell infeksjon vanligvis forårsaket av UPEC ^ni. Ved infeksjon av blæren, eller cystitt, er avgjørende for bakteriell klaring ¹⁰ rekruttering av PMN til blæren lumen. Å etablere et fotfeste i ansiktet av en betennelsesreaksjon, UPEC forsinke ankomsten av PMN til blæren, noe som forlenger perioden hvor UPEC kan invadere blæren epitel i fravær av immun press ^6,11. Denne fenotype, undertrykkelse av PMN migrering av UPEC ved tidlige tidspunkter, er observert i våre in vitro modell av transuroepithelial PMN migrasjon. Infeksjon med nonpathogenic E. coli MG1655 utløserbetydelig mer PMN migrasjon enn infeksjon med uropathogenic E. coli UTI89 (Figur 2A), co-infeksjon med MG1655 og UTI89 gir den uropathogenic fenotype (dvs. lave nivåer av PMN migrasjon) ^6. Videre har vi identifisert en UPEC protein, YbcL, som bidrar til den undertrykkende fenotype, som sletting av ybcL resulterte i signifikant mer PMN i det nedre reservoar i forhold til villtype UTI89 (figur 2A) ^7. Høye nivåer av PMN migrering ble også fremkalt ved varme-drepte MG1655, fMLF og IL-8 (figurene 2A og B). I forhold til infeksjon med levende bakterie stimulus, kan bruken av chemoattractants forenkler både eksperimentelle protokoll og tolkningen av resultatene. Det er sannsynlig at andre chemoattractants (f.eks bakterielle produkter eller kjemokiner) ville også lokke fram PMN i denne modellen. Så langt, den transuroepithelial nøytrofile migrasjon assay har tilrettelagt undersøkelser i undertrykkelse av den tidlige betennelsesreaksjon etter UPEC, avslører fenotyper som er bekreftet i in vivo-modeller ^6-8, og vil være et uvurderlig verktøy i fremtidige bestrebelser.

Mens denne analysen har potensial til å ta opp en rekke spørsmål, er det noen begrensninger. Gitt antallet variabler som ligger til denne analysen, må man være forsiktig mens han forberedte og gjennomføre eksperimenter for å sikre reproduserbarhet mellom replikater. Opplisting PMN ved telling er utsatt for feil, som teller kan være tidkrevende og PMN er kortvarig gang fjernet fra kroppen, spesielt i nærvær av bakterier. Redusere tiden mellom PMN prøvetaking og PMN oppregning vil resultere i mer nøyaktig datainnsamling. Forskere har beskrevet fargemetriske tester som måler myeloperoxidase (MPO) enzymaktivitet som et surrogat for PMN ^12,13. Analyser utnytte kolorimetriske underlag som 3,3 &Nr. 39,, 5,5 ',-tetrametylbenzidin (TMB) eller 2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS) er ikke tilstrekkelig følsom for påvisning av konsentrasjoner av PMN til stede i den nedre reservoarer som bruker transuroepithelial nøytrofile migrasjon protokollen beskrevet ovenfor (Lau og Hunstad, upubliserte data). Parametrene for migreringsanalyse kan bli manipulert for å øke PMN tettheten i de nedre reservoarprøver. Alternativt kan en MPO analysen med større følsomhet, potensielt å benytte et fluorescerende substrat, kunne etableres. Måling av MPO-aktivitet representerer et alternativ til PMN telling og kan muliggjøre mer nøyaktig telling av PMN i nedre reservoarprøver. I tillegg kan en slik analyse også tillate telling av PMN vedheftende til de epitele sjikt, og som er igjen i det øvre reservoar. En validert MPO-basert protokoll ville representere et kraftig verktøy som kan utvide mengden og type data som kan hentes fra transuroepithelial nøytrofile migrasjon analysen.

Transepithelial nøytrofile migrasjon analyser modellering det medfødte immunforsvaret i mage-tarmkanalen og lungene er utbredt og er ansvarlig for vår nåværende forståelse av traversering av epitel barrierer ved PMN ^4,5. I kontrast, har PMN bevegelse over uroepithelial barrierer fått langt mindre oppmerksomhet. Säve og kolleger har rapportert en modell som bruker en polarisert epitel består av differensierte UROtsa celler, støtter en udødeliggjort cellelinje avledet fra ureter vev, dyrket til konfluens på gjennomtrengelig ^14. Agace og kolleger har rapportert bruk av udifferensiert blære (J82) og nyre (A498) epitelceller i en lignende modell ^15. I transuroepithelial nøytrofile migrasjon modellen beskrevet her, selv om de 5637 cellelag er ikke stratifisert og sannsynligvis ikke formelt polarisert, er trange veikryss dannet, vurdert av impermeabilitet for macromolecularflux og uttrykket og lokalisering av trange veikryss proteiner (Lau og Hunstad, upubliserte data). Av notatet, epitellaget opprettholder også en slik tetthet under infeksjonen forholdene vi har beskrevet. Protokollene rapportert av Säve og Agace modellere den inflammatoriske respons etter infeksjon med UPEC isolerer for 24 hr. I disse modellene, UPEC framprovosere robust PMN migrasjon. I motsetning til dette blir de epitele sjikt i modellen utsettes for UPEC for en relativt kort tid, 1 time, for å undersøke de første interaksjoner mellom vert og patogen. Videre muliggjør bruken av en blære epitelial cellelinje og en cystitt-avledet UPEC isolere potensial oversettelse av in vitro-funnene til det murine cystitt modellen ^16.. Til slutt, studiene nevnt ovenfor benyttes store permeable bærere som krever seks brønners vevkul-retter. Bruken av mindre gjennomtrengelige bærere, som i vår modell, reduserer reagens bruk og øker antallet av innsatsens som kan manipuleres per eksperiment. Selv om hver av disse modellsystemer har fordeler og ulemper, til den kollektive potensialet av disse modellene definere hendelser som kreves for PMN migrering inn i urinveis vev er betydelig.

Selv om mindre godt forstått enn migrasjon over endoteliale barrierer, har passasjen av PMN tvers av gastrointestinal og pulmonale epiteliale barrierer fått mye studie ^4,5. Transepithelial nøytrofile migrasjon modeller som benytter permeable støtter og dyrkede epitelceller har avslørt noen av de signal hendelser og adhesjonsmolekyler som er involvert i bevegelsen av PMN gjennom disse epitel. Foreløpige studier ved hjelp av dyrkede epitelceller urin foreslår å involvere intercellulære adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) og β-inte CD11b/CD18 (Mac-1) i PMN migrasjon over urin vev ^15. Det er uklart hvilke ekstra signalveier og lim molekyler er involverti disse komplekse prosesser i urinveiene. Bruke transuroepithelial nøytrofile migrasjon modellen som er beskrevet her, kanskje supplert med mikroskopisk undersøkelse ^14,15, kan disse grunnleggende spørsmålene og mange andre vil bli avhørt. I tillegg i sammenheng med bakterielle gener, denne modellen kan brukes for ytterligere å evaluere patogen-spesifikke fenotyper som for eksempel undertrykkelse av PMN migrering av UPEC. Det er uklart på hvilket punkt i flertrinns fremgangs PMN migrering UPEC utøver sin undertrykkende effekt. Også, den mekanismen som YbcL påvirker PMN migrasjon har ennå ikke klarlagt. Ved først å forstå de grunnleggende krav til passering av PMN over blæren epitel, kan vi da begynne å sondere hvordan UPEC manipulerer disse prosessene for å legge til rette for sykdom.

I sammendrag, og mange teknikker eksisterer for å undersøke bevegelsen av cellene, færre tilnærminger er tilgjengelige for å avhøre cellemigrering over cellebarrierer. Modifications til Boyden kammeret har vært en integrert del undersøke celle migrasjon over endothelial og epitel barrierer. En medgjørlig in vitro modell av akutt inflammatorisk respons i urinrøret, slik som transuroepithelial neutrofil migrering assay beskrevet heri, er et verdifullt verktøy for å avhøre disse komplekse prosesser. Til slutt, modifikasjoner av denne analysen kunne lette undersøkelser i andre sykdomstilstander i urinveiene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell Inserts (i.e. permeable supports)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution	GE Healthcare	17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates	Corning	3473	24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8	R&D Systems	208-IL	Reconstituted in PBS to 100 μg/ml