Summary
פיתחנו מודל במבחנה המחקה מרכיב חשוב בתגובה הדלקתית החריף במהלך הזיהום של שלפוחית השתן עם חיידקי Escherichia uropathogenic. Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial מאפשר הערכה כמותית של הגירת נויטרופילים אנושיים על פני epithelia שלפוחית השתן, בתרבית על תומך חדיר, בתגובה לזיהום חיידקים או חומרי chemoattractant.
Abstract
הגיוס של תאי מערכת החיסון מהפריפריה לאתר של דלקת הוא צעד חיוני בתגובה החיסונית המולדת בכל משטח הרירי. במהלך הזיהום של שלפוחית השתן, כדוריות דם לבנות polymorphonuclear (PMN; נויטרופילים) נודדים ממחזור הדם ולעבור את אפיתל שלפוחית השתן. כישלון לפתור את הזיהום בהעדר תגובת neutrophilic מדגים את החשיבות של PMN בהגנה על שלפוחית השתן. כדי להקל על קולוניזציה של אפיתל שלפוחית השתן, Escherichia coli uropathogenic (UPEC), הסוכן סיבתי של רוב הדלקות בדרכי שתן (זיהומים בדרכי השתן), לדכא את התגובה הדלקתית חריפה באמצעות מגוון של מנגנונים שהוגדרו באופן חלקי. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין המארח ופתוגן חיידקים נוסף, פיתחנו מודל במבחנה של היבט זה של התגובה החיסונית המולדת לUPEC. ב assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial, וריאציה על חדר בוידן, epith שלפוחית השתן בתרביתתאי elial גדלים למפגש בחלק התחתון של תמיכה חדירה. PMN מבודדים מהדם ורידי אדם ומוחל על צד basolateral של שכבות תאי אפיתל שלפוחית השתן. הגירת PMN המייצגת את כיוון basolateral לפסגה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתגובה לזיהום חיידקים או מולקולות chemoattractant נפקדת באמצעות hemocytometer. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין UPEC ותאי אוקריוטים כמו גם לחקור את הדרישות מולקולריות לחציית האפיתלים שלפוחית השתן על ידי PMN. מודל נדידת נויטרופילים transuroepithelial יהיה לקדם את ההבנה של התגובה הדלקתית הראשונית לUPEC בשלפוחית השתן שלנו.
Introduction
התנועה של תאים בכל הגוף, לעתים קרובות על פני מרחקים ארוכים, נדרשת לצמיחה והתפתחות, ריפוי פצעים, ותגובה חיסונית. נדידת תאים היא מורכבת ודורשת התיאום של תהליכים רבים ושונים, כוללים מפלי איתות והסידור מחדש של רכיבי cytoskeletal. תאים יכולים לנוע באופן אקראי (chemokinesis), כמו גם לכיוון הדרגתיים מוגדר כימי (chemotaxis). טכניקות רבות פותחו ללמוד נדידת תאים במבחנה. הטכניקה העתיקה ביותר והנפוצה ביותר, קאמרי בוידן, מורכב ממערכת שתי קאמרית אנכית שבו חומר chemoattractant ממוקם בתא והתאים של עניין התחתון ממוקמות בתא העליון 1. התנועה של תאים על פני המסנן החדיר, עם נקבוביות בגודל מוגדר, בין שני התאים היא תחת פיקוח. טכניקות נוספות פותחו כדי לחקור את נדידת תאים, כוללים תא זיגמונד 2 וקאמרי דאן3. גישות קולקטיביות אלו הניבו תובנה משמעותית לתנועה של תאים מסוגים רבים ושונים.
בנוסף לחקירה את העקרונות הבסיסיים של chemokinesis וchemotaxis, מבחני שני קאמריים הקלו החקירה של נדידת תאים באמצעות רכיבי מטריצה תאיים ושני שכבות תאי אנדותל ואפיתל. יתרון של מערכות שתי קאמריות על פני שיטות אחרות הוא שהקרום הנקבובי יכול להיות מצופה עם חלבונים כגון קולגן או פיברינוגן, ונדידת תאים על פני מחסום כמו מטריקס-תאי ניתן להעריך. בנוסף, ניתן לגדל שורות תאים בתרבית ומובחנות על תומך החדיר. כדי לחקור את התנועה של תאים על פני מכשול אנדותל, תאי אנדותל בתרבית הם זורעים וגדלו במאגר העליון של תומך החדיר. תאי ניעתי, כגון תאים חיסוניים, מתווספים למאגר וההגירה העליונים למאגר התחתון ברחבי enמחסום dothelial בכיוון הקודקוד לbasolateral הפיזיולוגי הוא ציין. מודל זה כבר לא יסולא בפז בהבנת extravasation של תאים חיסוניים מחוץ לזרם הדם. בניגוד לtransendothelial הגירה, התנועה של תאים על פני מחסום האפיתל מתרחשת בדרך כלל בכיוון basolateral לפסגה. על מנת לבנות מודל אירועים אלה במבחנה, חוקרי הזרעים ולגדל תאי אפיתל בתרבית בחלק התחתון של תומך החדיר. תאי ניעתי מתווספים למאגר העליון וההגירה על פני מחסום אפיתל, המייצג את כיוון basolateral לפסגה, הוא תחת פיקוח. מודלים כאלה של הגירת transepithelial תרמו באופן משמעותי להבנה של תגובות דלקתיות במשטחים הריריים, במיוחד אלו של הריאות ובטן 4,5 שלנו.
בניגוד לכך, סחר בתא חיסון דרך האפיתל של דרכי השתן זכה להרבה פחות תשומת לב. כדי לקדם את understanding של תגובות חיסוניים מולדים בדרכי השתן במהלך זיהום בחיידקי Escherichia uropathogenic (UPEC), פיתחנו assay במבחנה, assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial, המאפשר חקירה של ויקוציטים polymorphonuclear (PMN; נויטרופילים) תנועה על פני מחסום האפיתל בשלפוחית השתן 6 -8. כמו בדגמים שני קאמריים אחרים של הגירת transepithelial, תאי שלפוחית השתן אנושיים בתרבית האפיתל גדלים על החלק התחתון של תמיכה חדירה ויוצרים שכבות אפיתל ומחוברות. נויטרופילים אנושיים, מבודדים מהדם ורידים, מוחלים על צד basolateral של שכבת האפיתל, והגירה על פני האפיתל בכיוון basolateral לפסגה הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית היא לכמת בתגובה לזיהום עם זנים שונים של א coli או הנוכחות של מולקולות chemoattractant. מחקרים רבים שהתמקדו בתנועת נויטרופילים, שניהם chemokinesis וchemotaxis, בהעדר סוגים נוספים של תאים. Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial הוא יתרון כפי שהוא לוקח בחשבון את יחסי גומלין מורכבים בין תאי אפיתל שלפוחית השתן ותאי מערכת החיסון בזיהום. יש מודל צייתן זה במבחנה את הפוטנציאל כדי לאפשר את החקירה מפורטת של תגובות חיסוניים במשטחי uroepithelial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culturing 5637 תאי אפיתל שלפוחית השתן
בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע רקמות תרבות זרימה למינרית מוכנה עם קרינת UV וניגב את עם 70% אתנול.
- הכן את המדיום RPMI-1640 מכיל 10% בסרום שור העובר (FBS) [+ RPMI כינה], מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 גודל נקבובית מיקרומטר, וחם ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- להפשיר cryovial של 5637 תאים (אמריקאי סוג תרבות אוסף HTB-9; נגזר מקרצינומה של שלפוחית השתן) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. במהירות להעביר את התאים מופשרים בבקבוק תרבית רקמה 75 2 סנטימטר המכיל 20 מיליליטר RPMI +.
- דגירה את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified עם 5% CO 2 עד לתאים ומחוברות כ 95% (~ 6 x 10 6 תאים לכל בקבוק), כ -4 ימים.
- לתת 5637 תאים:
- הוצא את המדיה מהבקבוק. לשטוף את התאים עם פוספט שנאגר סאלין של 10 מיליליטר Dulbeccoדואר (DPBS) בטמפרטורת חדר.
- הוסף 6 מיליליטר טריפסין החם (37 מעלות צלזיוס) 0.05%, 0.02% פתרון EDTA לבקבוק, ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 15 דקות.
- להעביר את תאי צינור 15 מיליליטר חרוטי, וגלולה ידי צנטריפוגה ב XG 300 למשך 5 דקות. הסר את פתרון טריפסין / EDTA.
- Resuspend תאי 6 מיליליטר + (10 6 תאים / מיליליטר), ומיליליטר RPMI העברה 1 (10 6 תאים) ל75 סנטימטר 2 בקבוק חדש המכיל 20 מיליליטר RPMI +.
- חזור על שלב 1.4 לתת תאים כל 4 ימים או כאשר התאים מגיעים למפגש 95%.
2. זריעה וגידול 5637 על תאים בתומכים חדיר
בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות טכניקת aseptic. לקבלת תוצאות אופטימליות, השתמש 5637 תאים שעברו פחות מ 10 תת תרבות.
- בעזרת מלקחיים סטריליות, להפוך את תומך החדיר בצלחת תרבות רקמות עמוקה 25 מ"מ סטרילי.
- בעזרת פיפטה 1,000 μl, בעדינות resuspend התאים ~ 2 מיליליטר RPMI + לריכוז של 3 x 10 6 מיליליטר תאים /, נקבע על ידי תא לספור באמצעות hemocytometer.
- החל 50 μl של ההשעיה התא (1.5 x 10 5 תאים) לכל תמיכה חדירה בלי לגעת בקרום. מניחים את המכסה על הצלחת, ומניח בזהירות את הצלחת על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך לא יותר מ 16 שעות.
- בעזרת מלקחיים סטריליות, נכון תומך החדיר לתוך צלחת 24 גם מכילה 0.6 מיליליטר + RPMI לכל טוב. הוסף 0.1 מיליליטר RPMI + למאגר העליון של כל תמיכה חדירה. לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2.
- החלף את המדיום כל 2 ימים. ראשית, בינוני לשאוב מהמאגר העליון ואחריו המאגר התחתון, ולאחר מכן להחיל טרי RPMI + בבסדר ההפוך, למאגר התחתון (0.6 מיליליטר) ולאחר מכן העליון reservoir (0.1 מיליליטר).
- שבעה ימים לאחר זריעה תומכת החדיר עם 5637 תאים, להעריך את המפגש של התאים. למלא את המאגר העליון עם RPMI + (~ 0.35 מיליליטר). התאים במידה מספקת הם מחוברות כאשר המדיום אינו לאזן בין המאגרים העליונים ותחתונים.
3. הכנת הבידוד בקטריאלי
- באמצעות טכניקת aseptic, להוסיף 20 מיליליטר של מרק התרבות המתאים לבקבוק 250 מיליליטר עם מכסה. השתמש במרק לוריא-Bertani (LB) לE. תרבויות coli, ולהוסיף אנטיביוטיקה למרק שבו מתאים.
- שימוש בחיסון לולאת סטרילי, לחסן את המרק עם חיידקים ממניות גליצרול או צלחת פס. לזני UPEC, דגירה תרבות החיידקים ב37 מעלות צלזיוס למשך כ 16 שעות, בלי ללחוץ (כדי לקדם את הייצור של פילים מסוג 1).
- העבר את תרבות החיידקים לצינור צנטריפוגות. גלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה ב8,000 XG 10 דקות.
- למזוג supernatant, ו resuspend החיידקים בPBS לOD 600 = 1.000, שווה ערך ל ~ 10 9 CFU / מיליליטר.
- כדי ליצור גירוי חיידקים-נהרג חום, דגירה aliquot (למשל ~ 1.5 x 10 8 CFU ב150 μl) של חיידקי resuspended ב55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. פלייט aliquot של ההשעיה נהרג חום כדי לאשר מות חיידקים.
- מייד לפני השימוש, לדלל את חיידקי resuspended (לחיות או נהרג חום) של פי 10 ל10 8 CFU / מיליליטר בRPMI סרום ללא חם [RPMI-כינה] בצינור microfuge.
4. בידוד של נויטרופילים אנושיים מהדם היקפי
האוסף של דם ממתנדבים מבוגרים דורש ביקורת מראש ואישור מועדת בדיקה מוסדית. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים ולהשליך כיאות חומרים מסוכנים, כדי למנוע חשיפה לדם אנושי.
- כ 25 מיליליטר של דם ורידים מv הבוגר ובריאolunteer צריך להיגרר ל3 צינורות איסוף דם סטרילית נתרן המכיל הפרין על ידי צוות המיומן בphlebotomy.
- חוזקה עוטף את צינורית גומי סביב הזרוע העליונה, מעל המרפק.
- לחטא את אתר הכניסה, פוסה antecubital, תוך שימוש באלכוהול 70% סטרילי לנגב.
- צרף בעל צינור פלסטיק למערכת מחט פרפר מכונפת.
- הכנס את המחט לתוך וריד antecubital בזווית 30 מעלות או פחות, שיפוע כלפי מעלה. המחט ניקבה את וריד כשפרץ של דם מופיע בצינורות הפלסטיק.
- הכנס צינור איסוף דם לתוך מחזיק צינור פלסטיק. כאשר צינור האיסוף הראשון הוא מלא, להחליף עם צינור האיסוף השני. חזור עם הצינור השלישי.
- כאשר צינור האיסוף השלישי הוא כמחצית מלא, להסיר את חוסם עורקים.
- כסה את האתר לנקב עם כדור צמר גפן סטרילי ולסגת באיטיות את המחט מהווריד. הסט את מגן עליי המחט והמקוםBiohazard na חד מיכל.
- תפעיל לחץ על האתר לנקב. כסה את כדור האתר לנקב וכותנה עם תחבושת דביקה.
- בעדינות להפוך את צינורות איסוף דם כדי לפזר את הפרין.
בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות טכניקת aseptic.
- בעזרת פיפטה 10 מיליליטר, בעדינות להעביר את הדם לצינור חרוטי טרי, מיליליטר 50 סטרילי. הוסף נפח שווה ערך של 3% (w / v) dextran ב0.9% NaCl ומערבבים על ידי היפוך. דגירה הצינור זקוף בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
- מבלי לשבש את השכבה התחתונה, לשאוב בזהירות את השכבה העליונה ולהעביר אותו לצינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות. בטל supernatant.
- Resuspend התא גלולה בנפח של .0.9% NaCl שווה להתחלת נפח דם.
- שכבת 10 מיליליטר של תמיסת צנטריפוגה צפיפות תחת ההשעיה תא, עמ 'שומר את הממשק בין שני השלבים. צנטריפוגה ב XG 400 ל30 דקות עם בלם לא. בטל supernatant.
- לlyse תאי דם אדומים שנותרו, resuspend התא גלולה ב 10 מיליליטר 0.2% קרים NaCl. דגירה במשך 30 שניות, ולאחר מכן מייד להוסיף 10 מיליליטר 1.6% קרים NaCl לשחזר isotonicity.
- גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 6 דקות. בטל supernatant.
- חזור על שלבים 4.6-4.7 עד התא גלולה מופיע להיות חופשי של תאי דם אדומים, בדרך כלל 3 סיבובים של תמוגה.
- בעזרת פיפטה 1,000 μl, resuspend התא גלולה, בעיקר PMN, בחם (37 מעלות צלזיוס) RPMI לריכוז של 10 7 תאים / מיליליטר, שנקבע על ידי תא לספור באמצעות hemocytometer. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. בדרך כלל, כדאיות PMN וטהרה הן> 99% כפי שהוערך על ידי הרחקת trypan הכחולה ויזואליזציה של מורפולוגיה גרעינית לאחר הצביעה, בהתאמה.
5. Transuroepithelial נויטרופילים הגירה כפילומר
בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות טכניקת aseptic. השתמש אך ורק תומך חדיר נושאות שכבות תאים ומחוברות 5637, כפי שנקבע בשלב 2.7. יכולות-RPMI להיות מוכנה 24 גם צלחות המכילות מראש ושמרו על 37 ° C עם 5% CO 2 עד לשימוש.
- Aliquot 1 מ"ל לחמם RPMI לכל גם בצלחת 24 גם; להכין 3 בארות לתמיכה חדירה.
- לשאוב את המדיום מהמאגרים העליונים ותחתונים של תומך החדיר.
- בעזרת מלקחיים סטריליות, להעביר את תומך החדיר לצלחת 24 גם מוכנה בשלב 5.1. שטוף את תומך החדיר שלוש פעמים על ידי העברת התמיכות מהיטב היטב.
- אם הבידוד חיידקים הוא לשמש, להפוך תומכת החדיר בצלחת תרבות רקמות עמוקה 25 מ"מ סטרילי. אם chemoattractant (למשל, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) או IL-8) הוא לשמש, המשך לשלב 5.6.
- לניסויים עם bact חי או נהרגגירויי erial, לחסן צד הפסגה של כל תמיכה חדירה עם 60 μl RPMI-(דלקת מדומה) או עם הבידוד החיידקים (6 x 10 6 CFU) מוכן בשלב 3.5. מניחים את המכסה על הצלחת ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך שעה 1.
- הוספת 0.6 מיליליטר RPMI לכל גם ל24 גם צלחת נמוכה מצורף; להכין 1 גם לתמיכה חדירה. הכן 3 בארות המכילות 0.5 מיליליטר RPMI-למנות קלט PMN.
- אם chemoattractant נמצאת בשימוש במקום של חיידקים, להוסיף chemoattractant ל0.6 מיליליטר RPMI-בצלחת 24 גם מוכנה בשלב 5.6.
- העכבר תומך החדיר לתוך הצלחת נמוכה המצורף 24 גם.
- הוסף 0.1 מיליליטר PMN (10 6 PMN), מוכן בשלב 4.9, למאגר העליון (צד basolateral) של כל תמיכה חדירה. הוספת 100 PMN μl ישירות לבארות המכילות 500 μl RPMI. לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך שעה 1.
- בעזרת מלקחיים סטריליות, בעדינות לגרדהממברנה של התמיכה חדירה כנגד קצה היטב כדי להסיר PMN נוסף מהצד הפסגה ולאחר מכן להשליך את התמיכה.
- לאסוף PMN ידי בעדינות מגרד את תחתית היטב כל אחד עם קצה פיפטה 1,000 μl, ולהעביר את מתלי PMN לmicrofuge צינורות.
- ספירת PMN באמצעות hemocytometer.
- כדי לחשב את המספר הכולל של PMN במאגר התחתון, הכפל את מספר PMN ב1 מ"מ 2 (100 NL) על ידי 6,000. ניתן לדווח על הנתונים כאחוז מPMN הקלט, או כמספרי PMN מנורמלים 10 6 PMN קלט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial מאפשר הערכה כמותית של הגירת PMN האנושי על פני שכבות תאי אפיתל שלפוחית השתן בתרבית בתגובה לגירויים שונים (איור 1). בעוד הפרוטוקול הוא פשוט, יש מספר משתנה שיכול להשפיע על הגירת PMN וכתוצאה מכך משפיעה על שחזור של assay זה. יש לנקוט אמצעים בעת ההכנה תומכת החדיר וPMN להפחית שונות בין משכפל הטכני וביולוגי. לדוגמא, יש להשתמש רק תומך חדיר המכילים שכבות תאים מספיק מחוברות 5637 בניסוי. מפגש של 5637 התאים נבחנים באמצעות assay פונקציונלי המודד את האטימות לנוזלים. אם מדיום נוספו למאגר העליון equilibrates פני התמיכה חדירה, אז 5637 התאים אינם מספיק מחוברות לביצוע הניסוי. אם הנפח במאגר העליון נשמר, אז permeתמיכה יכולה יכולה לשמש כדי להעריך הגירת PMN. יש לנו למדוד את ההתנגדות חשמלית transepithelial במערכת זו, אשר עולה בצניעות על מפגש של התאים, אם בשיטה זו היא שנבחרה, יש להיזהר שלא לזהם את ההתקנה אחרת סטרילי. מפגש של 5637 התאים 7 ימים לאחר הזריעה יכול להיות מושפע מגורמים רבים, כוללים מספר המעבר של התאים ומספר התאים שנזרעו על התמיכה חדירה. בנוסף, משך זמן ש5637 התאים מודגרת על התמיכה חדירה בעמדה ההפוכה בזריעה לא יעלה 16 שעה (איור 1 א). לשחזור אופטימלי, הפרוטוקול צריך להיות בדיוק אחריו. לבסוף, יש להשתמש בתומך חדיר המכיל מחוברות 5637 שכבות תאים בתוך 1-2 ימים, והקרומים של תומך לא צריכים להיות נגעו במהלך או צמיחה של 5637 תאים או במהלך assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial.
בddition ל5637 תאים, השתנות יכולה להיות גם הציגה במהלך הכנת PMN. באמצעות הפרוטוקול המפורט לעיל כדי לבודד PMN, 1 מיליליטר של דם אנושי בדרך כלל תשואות על 10 6 PMN, אם כי מספר זה משתנה מאדם לאדם. ברגע שהתשואה האופיינית לדם של תורם בודד ידועה, פרוטוקול הבידוד וניתן לשנותם למעלה או למטה בהתאם. יש להימנע PMN מאנשים בריאים או חולים, ויש להשתמש בי תורמי PMN שונים עבור משכפל ביולוגי, כדי להבטיח שתוצאות שנצפו הן שחזור. יש לטפל בעדינות ובסביבה נקיה מחיידקים PMN כדי להימנע מהפעלה בבידוד. לבסוף, התזמון של הפרוצדורות חיוני, כמו PMN לא לשרוד במשך פרקי זמן ארוכים הוסרו פעם אחת מהגוף. אנו מנצלים PMN בתוך 1 שעות של השלמת הליך הבידוד. בהתחשב בשיקולים אלה, יש לכלול לפחות 3 טכניים משכפל בכל אחד לשכפל ביולוגיים.
מספרPMN במאגר התחתון לאחר שעה 1 מוצג ב( איור 2) מנורמל ל10 6 PMN קלט. לחלופין, ניתן להשוות מספרי PMN לבקרה פנימית לאחר הנורמליזציה לPMN קלט, אשר עשוי להפחית וריאציה בין משכפל ביולוגי. היצמדות לפרוטוקול שתואר לעיל עם תשומת לב לפרטים מאפשרת הספירה של הגירת PMN בתגובה לגירויים כוללים חיידקים (איור 2 א) וחומרי chemoattractant (איור 2).
איור 1. סכמטי של עיצוב ניסיוני. (א) בתאי אפיתל 5637 שלפוחית השתן הם זורעים על תומך חדיר הפוך, תומך הם יישרו לתוך צלחת 24 גם, והתאים גדלים לנקודת מפגש. (ב) Permeaתומך ble מכיל 5637 תאים ומחוברות הם הפוכים ונגוע E. coli בצד הקודקוד של שכבות אפיתל. לחלופין, ניתן להציב chemoattractants במאגר התחתון. תומך החדיר הם יישרו לתוך צלחת נמוכה מצורף, וPMN אדם המבודד טרי מוחלים על המאגר העליון (המייצג את צד basolateral של שכבות אפיתל). PMN נודדים על פני האפיתל והם מנו מהמאגר התחתון באמצעות hemocytometer.
איור 2. PMN נודדים ברחבי epithelia שלפוחית השתן בתגובה לגירויים שונים. זיהום () עם א 'nonpathogenic MG1655 זן החיידק, MG1655 (HKMG) או המוטציה UPEC UTI89 ybcL-נהרג חום :: חתול מעורר יותר באופן משמעותי migratio PMNn מזיהום או דלקת מדומה עם UTI89 מתח UPEC wild-type, דלקת שלפוחית השתן הבודד (* p <0.001). (ב) התוספת של fMLF (100 ננומטר) או IL-8 (100 ng / ml) לתוצאות המאגר התחתונות באופן משמעותי יותר הגירת PMN מאשר טיפול מדומה (* p <0.001). הנתונים מייצגים את הממוצע וסטיית תקן של לפחות 3 חזרות ביולוגיות. הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית נקבעו באמצעות מבחן t של סטודנט מזווג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות קו תרבותי אפיתל שלפוחית תא וPMN אדם המבודד טרי, הקמנו מודל במבחנה של הגירת נויטרופילים transuroepithelial. מודל זה כבר סייע במתחיל לנתח את המורכבות של התגובה החיסונית המולדת בדלקת בדרכי שתן (UTI), זיהום חיידקים נפוץ מאוד שנגרם בדרך כלל על ידי 9 UPEC. במהלך הזיהום של שלפוחית השתן, או דלקת בשלפוחית השתן, גיוס של PMN ללומן שלפוחית השתן הוא חיוני לסילוק חיידקים 10. כדי לבסס דריסת רגל בפרצוף של תגובה דלקתית, UPEC לעכב את הגעתו של PMN לשלפוחית השתן, אשר מאריכה את התקופה שבה UPEC יכול לפלוש אפיתל שלפוחית השתן בהעדר 6,11 לחץ חיסוניים. פנוטיפ זה, דיכוי של הגירת PMN ידי UPEC בנקודות זמן מוקדמים, הוא ציין במודל שלנו במבחנה של הגירת PMN transuroepithelial. זיהום עם א 'nonpathogenic מעורר coli MG1655באופן משמעותי יותר מאשר הגירת PMN זיהום עם א 'uropathogenic coli UTI89 (איור 2 א); שיתוף זיהום עם MG1655 וUTI89 מניב את פנוטיפ uropathogenic (כלומר רמות נמוכות של הגירת PMN) 6. יתר על כן, זיהינו חלבון UPEC, YbcL, שתורם לפנוטיפ המדכא, כמו מחיקה של ybcL הביאה באופן משמעותי יותר PMN במאגר נמוך יותר בהשוואה לUTI89 wild-type (איור 2 א) 7. רמות גבוהה של הגירת PMN גם שהושרו על ידי-נהרג חום MG1655, fMLF ו-IL-8 (2A דמויות ו-B). בהשוואה לזיהום עם גירוי חיידקים חי, השימוש בchemoattractants עשוי לפשט גם את פרוטוקול הניסוי והפרשנות של תוצאות. סביר להניח כי chemoattractants האחר (למשל מוצרי חיידקים או כמוקינים) הייתי גם לעורר PMN במודל זה. עד כה, התחת הגירת נויטרופילים transuroepithelialאיי יש להקל חקירות לדיכוי התגובה הדלקתית מוקדם על ידי UPEC, חושפים פנוטיפים שאומתו במודלי vivo 6-8, ויהיו כלי רב ערך בעשייה בעתיד.
בעוד assay זה יש הפוטנציאל לטפל במספר השאלות, יש כמה מגבלות. בהתחשב במספר המשתנים טבועים assay זה, יש להקפיד בעת ההכנה וביצוע ניסויים כדי להבטיח שחזור בין משכפל. ספירת PMN ידי ספירה היא מועדת לטעויות, כמו ספירה יכולה להיות זמן אינטנסיבי וPMN הם קצרים חיים פעם אחת הוסר מהגוף, במיוחד בנוכחות של חיידקים. צמצום הזמן בין איסוף דגימת PMN וספירת PMN יגרום לאיסוף נתונים מדויק יותר. חוקרים תארו מבחני colorimetric המודדים את פעילות אנזים myeloperoxidase (MPO) כתחליף לPMN 12,13. מבחני ניצול מצעי colorimetric כגון 3,3 &39 #;, 5,5 ',-tetramethylbenzidine (TMB) או 2,2'-azino-BIS (3-ethylbenzothiazoline-6-גפרה חומצה) (ABTS) אינו רגיש מספיק כדי לזהות את הריכוזים של PMN נוכח הנמוך מאגרים באמצעות פרוטוקול נדידת נויטרופילים transuroepithelial שפורט לעיל (ולאו Hunstad, נתונים שלא פורסמו). הפרמטרים של assay ההגירה יכולים להיות מניפולציות כדי להגדיל את צפיפות PMN בדגימות המאגר התחתונות. לחלופין, assay MPO עם רגישות רבה יותר, פוטנציאל ניצול מצע ניאון, ניתן להקים. מדידה של פעילות MPO מייצגת אלטרנטיבה לספירת PMN ועשויה לאפשר לספירה מדויקת יותר של PMN בדגימות המאגר התחתונים. בנוסף, assay כזה עשוי גם לאפשר ספירה של חסיד PMN לשכבות האפיתל ושנותר במאגר העליון. פרוטוקול מבוסס MPO תוקף ייצג כלי רב עוצמה שיכול להרחיב את הכמות וסוג הנתונים שניתן היה לגבות מן transuroepassay ההגירה נויטרופילים ithelial.
מבחני הגירת נויטרופילים Transepithelial דוגמנות התגובה החיסונית המולדת במערכת העיכול והריאות נפוצים והם אחראים להבנה הנוכחית שלנו של חציית מחסומי האפיתל ידי PMN 4,5. לעומת זאת, תנועת PMN פני מחסומי uroepithelial קיבלה הרבה פחות תשומת לב. שמור ועמיתים דיווחו מודל המשתמש באפיתל מקוטב המורכב של תאי UROtsa מובחנים, שורה הונצחה תא נגזרת מרקמת שופכן, גדלה למפגש בחדיר תומכת 14. Agace ועמיתיו דיווחו על השימוש בשלפוחית שתן שלא עברו התמיינות (J82) וכליות תאי אפיתל (A498) במודל דומה 15. במודל נדידת transuroepithelial נויטרופילים המפורטים כאן, אם כי שכבות תאי 5637 אינן מרובדת וסביר להניח שלא מקוטב באופן רשמי, צמתים הדוקים נוצרים, שהוערכו על ידי אטימות לmacromolecularשטף והביטוי והלוקליזציה של חלבוני צומת הדוקים (לאו וHunstad, נתונים שלא פורסמו). ראוי לציין, שכבת האפיתל גם שומרת על אטימות כזו בתנאי הזיהום שתארנו. הפרוטוקולים שדווחו על ידי שמור וAgace מודל התגובה הדלקתית לאחר ההדבקה בUPEC מבודד ל24 שעות. במודלים אלה, UPEC לעורר הגירת PMN חזקה. לעומת זאת, שכבות אפיתל במודל שלנו חשופות לUPEC לתקופה קצרה יחסית של זמן, 1 שעות, על מנת לבחון את יחסי הגומלין הראשוניים בין המארח והפתוגן. יתר על כן, השימוש בשורת תאי אפיתל שלפוחית השתן וUPEC נגזר דלקת שלפוחית השתן לבודד מאפשרים תרגום פוטנציאל של ממצאים במבחנה למודל העכברי 16 דלקת שלפוחית השתן. לבסוף, המחקרים שהוזכרו לעיל תומך חדיר גדול מנוצל שדורשים 6 מנות בתרבית רקמה היטב. השימוש בתומך חדיר קטן יותר, כמו במודל שלנו, מפחית את שימוש במגיב ומגדיל את המספר של הכנסים שניתן לטפל בכל ניסוי. למרות שכל אחת ממערכות המודל הללו יש יתרונות וחסרונות, את הפוטנציאל הקולקטיבי של מודלים אלה כדי להגדיר אירועים הנדרשים להגירת PMN לתוך רקמות בדרכי שתן הוא משמעותיים.
אמנם פחות מובן היטב מהגירה פני מחסומי אנדותל, המעבר של PMN פני עיכול ומחסומי אפיתל ריאתי זכה להרבה 4,5 מחקר. דגמי נדידת נויטרופילים Transepithelial שמעסיקים תומכים חדירים ותאי אפיתל בתרבית חשפו כמה מאירועי האיתות והמולקולות הדבקות מעורבות בתנועה של PMN דרך אפיתלים אלו. מחקרים ראשוניים בשימוש בתאי אפיתל בתרבית שתן מצביעים על מעורבותם של הידבקות אינטר מולקולה 1 (ICAM-1) וCD11b/CD18 β-integrin (Mac-1) בהגירה PMN פני רקמות שתן 15. לא ברור שמסלולי איתות נוספים ומולקולות דבקים מעורביםבתהליכים המורכבים אלה בדרכי השתן. שימוש במודל נדידת transuroepithelial נויטרופילים המתואר במסמך זה, בתוספת אולי עם בדיקה מיקרוסקופית 14,15, ניתן נחקרו השאלות הבסיסיות הללו ועוד רבים האחרים. בנוסף, בשיתוף עם גנטיקה של חיידקים, מודל זה יכול לשמש כדי להעריך עוד יותר פנוטיפים הפתוגן ספציפי כגון דיכוי של הגירת PMN ידי UPEC. לא ברור באיזו נקודה בתהליך רב שלבים של הגירת PMN UPEC מפעיל ההשפעה מדכאת שלה. כמו כן, המנגנון שבאמצעותו משפיע YbcL הגירת PMN טרם הובהר. על ידי הבנת הדרישות הבסיסיות למעבר PMN פני אפיתל שלפוחית השתן ראשון, אז אנחנו יכולים להתחיל לחקור כיצד UPEC מתפעל תהליכים אלה כדי להקל על מחלה.
לסיכום, בעוד שטכניקות רבות קיימות כדי ללמוד את התנועה של תאים, פחות גישות זמינות לחקור את נדידת תאים פני מחסומים סלולריים. ModificatioNS לתא בוידן היה חלק בלתי נפרד מחקירת נדידת תאים פני מחסומי אנדותל ואפיתל. מודל צייתן במבחנה של התגובה הדלקתית החריף בדרכי השתן, כגון assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial מפורט במסמך הוא כלי רב ערך לחקירת תהליכים המורכבים אלה. לבסוף, השינויים assay זה יכול להקל על חקירות למצבי מחלה אחרות בדרכי השתן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקי R01-DK080752 וP50-DK064540. אנו מודים לג' Loughman על מאמציה בהקמת assay זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Orientation chamber in chemotaxis. Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).
- Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration. Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection. J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).
- Haraoka, M., et al. Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection. J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).
- Billips, B. K., et al. Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).
- Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration. Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
