Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Summary

Biz üropatojenik Escherichia coli ile mesane enfeksiyonu sırasında akut inflamatuar yanıtın önemli bir bileşeni taklit eden bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici maddelere cevap olarak, geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiştir, mesane epiteli üzerinde insan nötrofil göçü kantitatif bir değerlendirmesini sağlar.

Abstract

Enflamasyon siteye periferiden bağışıklık hücrelerinin işe herhangi mukozal yüzeyde doğal immün yanıtta önemli bir adımdır. Mesane enfeksiyonu sırasında, polimorfonükleer lökosit (PMN, nötrofiller) kan göç ve mesane epitel dolaşırlar. Nötrofilik yanıt yokluğunda enfeksiyonu gidermek için başarısızlık mesane savunma PMN önemini göstermektedir. Kesesi epitelinin üropatojenik Escherichia coli (UPEC) kolonizasyonunu kolaylaştırmak için, idrar yolu enfeksiyonları (İYE) çoğunluğunun neden olan madde, kısmen tanımlanan çeşitli mekanizmalar kullanılarak akut bir enflamatuar yanıtı ıslatın. Bundan başka ev sahibi ve bakteriyel patojen arasındaki etkileşimi incelemek için, UPEC için tabii immun cevabın bu yönünün bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyinde, Boyden odasının bir varyasyon, kültürlü mesane epithElial hücreler, geçirgen desteğin alt akmak üzere yetiştirilmektedirler. PMN İnsan toplardamar kanından izole edilir ve mesane epitel hücre katmanlarının bazolateral tarafına uygulanır. Bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici moleküllere yanıt olarak, fizyolojik olarak ilgili bazolateral-apikal yönü temsil eden PMN geçişi, bir hemositometre kullanılarak numaralandırılmış. Bu model UPEC ve ökaryotik hücreler arası etkileşimleri incelemek için hem de PMN mesane epitel geçişi için moleküler şartları sorgulamak için kullanılabilir. Transuroepithelial nötrofil göçü modeli mesane UPEC için başlangıçtaki inflamatuar cevabın anlayışımızı ilerletmek olacaktır.

Introduction

Vücuttaki hücrelerin hareketi, çoğunlukla uzun mesafeler boyunca, büyüme ve gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkisi için gereklidir. Hücre göç karmaşık ve sinyal iletim ve sitoskeletal bileşenlerinin yeniden düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok farklı süreçlerin koordinasyonunu gerektirir. Hücreler tanımlanmış kimyasal geçişlerini (kemotaksı) doğru rastgele (kemokinezinin) hareket olarak yapabilirsiniz. Birçok teknik in vitro hücre göçü incelemek için geliştirilmiştir. En eski ve en yaygın teknik, Boyden haznesi, bir kemo-çekici maddenin alt bölmeye ve ilgi hücrelerinde yerleştirilen dikey iki odacıklı sistem oluşur, üst bölmede ¹ yerleştirilir. Iki bölmeyi ayıran tanımlanan boyutta gözenekleri olan geçirgen filtre boyunca hücrelerin hareketi izlenir. Ek teknikler arasında Zigmond odası ² ve Dunn odası da dahil olmak üzere, hücre göçü araştırmak için geliştirilmiştir^3. Bu toplu yaklaşımlar çok farklı hücre tiplerinin hareketine önemli bakış açısı vermiştir.

Kemokinezinin ve kemotaksi temel ilkelerini sorgulama ek olarak, iki odacık tahlilleri hücre dışı matris bileşenleri ve hem de endotelyal ve epitel hücre katmanları üzerinden hücre göçü soruşturma kolaylaştırmıştır. Diğer teknikler üzerinden iki oda sistemlerinin kullanılmasının bir avantajı, gözenekli membranı, kolajen ya da fibrinojen gibi proteinler ile kaplanabilir, ve hücre dışı matris-benzeri bariyer boyunca hücre göçü değerlendirilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, kültürlenmiş hücre soyları yetiştirildi ve geçirgen destekler üzerinde farklı olabilir. Endotelyal hücre engeli boyunca hareketini araştırmak için, kültürlenmiş endotelyal hücreleri, geçirgen desteğin üst haznesinde tohumlanır ve büyütülür. Gibi bağışıklık hücreleri gibi hareketli hücreler, en karşısındaki alt rezervuara üst hazne ve göç eklenirfizyolojik apikal-to-bazolateral yönünde endotel bariyer görülmektedir. Bu model kan akışı bağışıklık hücrelerinin ekstravazasyonunu anlamada çok değerli olmuştur. Göç endotel aksine, bir epitel bariyerinden hücrelerinin hareketi tipik olarak bazolateral-apikal yönünde meydana gelir. In vitro olarak, bu etkinlik modellemek amacıyla, araştırmacılar, tohum ve geçirgen desteklerin alt kültürlenmiş epitelyum hücreleri büyür. Hareketli hücrelerin bazolateral-apikal yönü temsil eden epitelyal bariyer boyunca üst hazne ve göç, ilave edilir, izlenir. Transepitelyal göç tür modeller belirgin mukozal yüzeylerinde inflamatuar yanıtlar, özellikle akciğer olanlar ve ^4,5 gut anlayışımıza katkıda bulunmuştur.

Bunun aksine, idrar yolu epitel boyunca bağışıklık hücresi ticareti daha az dikkat çekmiştir. Bizim understandi ilerletmek içinbir mesane epitelyal bariyer ⁶ boyunca hareket, (nötrofil PMN) ng üropatojenik Escherichia coli (UPEC) ile enfeksiyon sırasında idrar yollarında doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin nedeniyle, polimorfonükleer lökosit, inceleme sağlayan bir in vitro tahlil, transuroepithelial nötrofil göçü deneyi geliştirilmiştir ^-8. Transepitelyal göç diğer iki odacıklı modellerinde olduğu gibi, kültürlenmiş insan mesane epitel hücreleri, geçirgen desteğin alt büyüdü ve birleşik epitel tabakalar oluştururlar. Toplardamar kanından izole İnsan nötrofilleri, epitel tabakanın bazolateral tarafına uygulanır ve fizyolojik olarak ilgili bazolateral-apikal yönünde epitel boyunca göç E farklı suşları ile enfeksiyona yanıt olarak ölçülür E. coli ya da kemo-çekici moleküllerinin varlığı. Pek çok araştırma ek hücre tiplerinin yokluğunda, nötrofil hareketi kemokinezinin ve kemotaksis hem odaklı vardı. Bu hesaba enfeksiyon sırasında mesane epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki karmaşık etkileşimler alır gibi transuroepithelial nötrofil göçü deneyi avantajlıdır. Bu uysal in vitro model epitelyal yüzeylerde bağışıklık tepkilerinin ayrıntılı bir araştırma izin vermek için potansiyele sahiptir.

Protocol

1.. 5637 Mesane Epitel hücrelerinin kültür

Laminer akış doku kültürü kaputu UV radyasyonu ile hazırlanmış ve% 70 etanol ile sildi aşağıdaki adımları uygulayın.

1. % 10 fetal sığır serumu (FBS) [adlandırılır RPMI +] ihtiva eden RPMI-1640 ortamı hazırlayın, filtre, su banyosu içinde bir 0.22 um gözenek boyutlu filtre kullanılarak sterilize ve sıcak 37 ° C.
2. 5637 hücre cryovial çözülme (American Type Culture Collection HTB-9, mesane karsinomu türetilmiş), 37 ° C su banyosu içinde. Hızla 20 ml RPMI + ihtiva eden bir 75 cm ² doku kültürü şişesine çözülmüş hücreleri aktarın.
3. Hücreler, yaklaşık% 95 konfluent (kap basma-6 x 10 ⁶ hücre), yaklaşık 4 gün kadar,% 5 _CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edin, şişeyi.
4. 5637 hücreleri altkültürü için:
   1. Şişeden gelen orta çıkarın. 10 ml Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin ile hücrelerin yıkayınOda sıcaklığında e (DPBS).
   2. 6 ml ılık (37 ° C),% 0.05 tripsin, şişeye% 0.02 EDTA çözeltisi ekleyin ve 15 dakika boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
   3. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile bir 15 ml konik bir tüp ve pelet hücreleri aktarın. Tripsin / EDTA çözeltisi çıkarın.
   4. 20 ml RPMI + içeren yeni bir 75 cm ² şişeye 6 ml RPMI + (10 ⁶ hücre / ml), ve transfer 1 ml (10 ⁶ hücre) 'de tekrar süspansiyon hücreleri.
5. Hücreler% 95 izdiham ulaştığınızda her 4 gün hücrelerini altkültürü için adım 1.4 tekrarlayın ya.

2. Geçirgen Desteklenmesi Hakkındaki 5637 Hücreler tohumlama ve Yetiştirme

Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. En iyi sonuçlar için, az 10 altkültürler uğramıştır 5637 hücreleri kullanır.

1. Steril forseps kullanılarak, steril bir 25 mm derin doku kültürü çanağı içinde geçirgen destek ters.
2 şişe tripsinize edin.
2. 1000 ul pipet kullanarak, yumuşak bir hemositometre kullanılarak bir hücre sayımı ile belirlenir 3 x 10 ⁶ hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar ~ 2 ml RPMI + hücreleri tekrar süspansiyon.
3. Membran dokunmadan her geçirgen destek hücre süspansiyonu (1.5 x 10 ⁵ hücre) 50 ul uygulanır. Tabağına yerleştirin kapağı ve dikkatli bir şekilde en fazla 16 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de çanak yerleştirin.
4. Oyuk başına 0.6 ml RPMI + ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içine steril forseps sağ geçirgen destek kullanılması. Her bir geçirgen desteğin üst haznesine 0.1 ml RPMI + ekleyin. % 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
5. Her 2 günde bir ortam değiştirin. First, aspirat alt rezervuar ardından üst hazneden orta ve alt hazne (0.6 mi), ters sırayla taze RPMI + uygulamak ve daha sonra üst reservoir (0.1 ml).
6. Yedi gün 5637 hücreleri ile geçirgen destek tohumlama sonra, hücrelerin izdiham değerlendirmek. RPMI + (~ 0.35 mi) ile üst doldurun. Orta üst ve alt kapları arasındaki dengeye etmez, hücreler yeterince birleşmiş olan.

3. Bakteriyel inokulum hazırlanması

1. Aseptik teknik kullanılarak, bir kap ile bir 250 ml şişeye uygun bir kültür et suyu ile 20 ml ekleyin. E. Luria-Bertani (LB) suyu kullanın coli kültürleri ve uygun olduğunda suyu için antibiyotik ekleyin.
2. Steril bir aşılama döngü kullanılarak, bir gliserol stokundan bakteri ya da bir çizgi plaka ile suyu inoküle. UPEC suşlar için, (tip 1 pili üretimini teşvik etmek için) çalkalama olmaksızın, yaklaşık olarak 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe bakteri kültürü.
3. Bir santrifüj tüpüne bakteri kültürü aktarın. 10 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj ile bakteriler Pelet.
4. Süpernatant süzünVe ~ 10 ⁹ CFU / ml 'ye eşdeğer, = 1.000 OD ₆₀₀ için PBS içinde tekrar süspansiyon bakteri.
   1. Isı ile öldürülmüş bakteriyel uyarıcı oluşturmak için, bir kısım 30 dakika boyunca 55 ° C 'de yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteri (150 ul, örneğin 1.5 x 10 ~ ⁸ CFU) inkübe edilir. Bakteriyel ölüm onaylamak için ısı ile öldürülmüş süspansiyonu bir kısım Plate.
5. Kullanımdan hemen önce, yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteriler (canlı ya da ısıyla öldürülmüş) 10 kat sıcak serum içermeyen RPMI ⁸ CFU / ml 10 için bir mikro tüp içerisinde [RPMI-adlandırılır] seyreltin.

4. Periferik Kan İnsan nötrofilleri İzolasyonu

Yetişkin gönüllülerin kan toplanması ileri inceleme ve kurumsal inceleme kurulu onayı gerektirir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve düzgün bir insan kanına maruz kalmaktan kaçınmak için tehlikeli madde atmayın.

1. Sağlıklı yetişkin v venöz kan yaklaşık 25 miolunteer phlebotomy eğitimli personel tarafından 3 steril sodyum heparin içeren kan toplama tüpleri içine çekilmelidir.
   1. Sıkıca dirsek üstü, üst kol etrafında bir lastik turnike sarın.
   2. Steril% 70 alkol silin kullanarak giriş siteyi, Antekübital fossayı dezenfekte edin.
   3. Kanatlı bir kelebek iğne sistemine bir plastik tüp tutucu takın.
   4. Yukarı bakacak şekilde 30 ° açı veya daha az, eğimin bir antekubital damara iğne takın. Kan bir hamle plastik boru göründüğünde iğne damarı delinmiş.
   5. Plastik tüp yuvasına bir kan toplama tüpü yerleştirin. Ilk koleksiyonu tüp dolu olduğunda, ikinci toplama tüpü ile değiştirin. Üçüncü boru ile tekrarlayın.
   6. Üçüncü toplama tüp, yaklaşık yarısı dolduğunda, turnike çıkarın.
   7. Steril bir pamuk ile delinme siteyi örtün ve yavaş yavaş damardan iğneyi. İğne ve yer i üzerinde koruyucu kalkan kaydırınna biohazard konteyner diyez.
   8. Ponksiyon basınç uygulayın. Yapışkan bandaj ile delinme site ve pamuk örtün.
   9. Yavaşça heparin dağıtmak için kan toplama tüpleri ters.

Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın.

2. 10 ml bir pipet kullanarak, yumuşak bir taze, steril bir 50 ml konik bir tüp için kan aktarın. % 3 eşdeğer bir hacim (a / h) dekstran% 0.9 NaCI ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. 20 dakika boyunca, oda sıcaklığında dik olarak tüp inkübe edin.
3. Alt katmanı bozmadan, dikkatle üst tabakası aspire ve yeni bir 50 ml konik tüp transfer. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile Pelet hücreleri. Süpernatant atın.
4. Kan tekrar başlangıç ​​hacmine eşit% 0.9 NaCI hacminde hücre pelletini.
5. Hücre süspansiyonu, p altında yoğunluk santrifüj çözeltisi 10 ml Katmanİki faz arasındaki arayüz ayırma. Hiçbir frenli 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj. Süpernatant atın.
6. Arta kalan kırmızı kan hücreleri lize etmek için, 10 ml soğuk% 0.2 NaCl'de hücre pelletini. 30 saniye boyunca inkübe ve sonra derhal izotonikliğe yeniden 10 ml soğuk% 1.6 NaCI ekleyin.
7. 6 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile Pelet hücreleri. Süpernatant atın.
8. Hücre topağı, kırmızı kan hücrelerinin lize, tipik olarak 3 tur arındırılmış olması görünene kadar yineleyin 4,6-4,7 adımları tekrarlayın.
9. 1000 ul pipet kullanarak, in, hücre pelletini, öncelikle PMN tekrar süspansiyon sıcak (37 ° C) RPMI-hücre bir hemasitometre kullanılarak saymak suretiyle belirlendi 10 ⁷ hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda,. Kullanılana kadar 37 ° C'de hücreleri tutun. Sırasıyla, boyandıktan sonra, nükleer morfoloji tripan mavi dışlama ve görselleştirme ile değerlendirilen Tipik olarak, PMN canlılığı ve saflık>% 99 bulunmaktadır.

5. Transuroepithelial Nötrofil Göç gibidemek

Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. Adım 2.7 'de tespit edildiği üzere, birleşik 5637 hücre katmanları taşıyan sadece geçirgen destek kullanın. Ihtiva eden 24 oyuklu plakalar RPMI-olabilir, önceden hazırlanmış ve% 5 _CO2, kullanıma kadar 37 ° C 'de muhafaza edilebilir.

1. Kısım 1, 24 oyuklu plakada oyuk başına RPMI-ısınmaya ml; geçirgen destek başına 3 kuyu hazırlar.
2. Geçirgen desteklerin üst ve alt haznelerden ortam aspire.
3. Steril forseps kullanılarak, aşama 5.1 'de hazırlanan 24 plaka için geçirgen destek aktarın. Kuyudan kuyuya destekleri aktararak geçirgen özelliği destekleyip üç kez yıkayın.
4. Bakteriyel inokulum kullanılacak ise, steril bir 25 mm derin doku kültürü çanağı içinde geçirgen destek ters. Bir kimyasal çekicidir (örneğin, N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) ya da IL-8) kullanılacak ise, 5.6 adıma geçin.
5. Canlı veya öldürülen Bact ile deneyler içinerial uyarı, 60 ul RPMI-(sahte enfeksiyon) veya bakteriyel aşı aşama 3.5 de hazırlanan (6 x 10 ⁶ CFU) ile her bir geçirgen destek apikal yan inoküle. Tabağına yerleştirin ve kapağı, 1 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
6. , 24 oyuklu, düşük bağlanma plakasına oyuk RPMI-başına 0,6 ml ilave et; geçirgen destek oyuk başına 1 hazırlar. RPMI-to PMN girişi numaralandırmak 0.5 ml içeren 3 kuyu hazırlayın.
   1. Bir kimyasal çekicidir bakterilerin yerine kullanılıyorsa, aşama 5.6 'de hazırlanan 24 oyuklu plaka RPMI-in 0.6 ml kemoatraktan ekleyin.
7. 24-iyi düşük eki plaka içine doğru geçirgen destekler.
8. Her bir geçirgen desteğin üst haznesine (bazolateral taraf), aşama 4.9 de hazırlanan 0.1 ml PMN (10 ⁶ PMN) ekleyin. Doğrudan 500 ul ihtiva eden gözlere 100 ul RPMI-PMN ekleyin. 1 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
9. Steril forseps kullanarak, hafifçe kazıyınKuyunun kenarına karşı geçirgen destek zar apikal taraftan ek PMN kaldırmak ve daha sonra desteğin imha etmek.
10. Yavaşça 1000 ul pipet ucu ile de her bir alt kazıma ile PMN toplayın ve mikrofüj tüpler için PMN süspansiyonlar aktarın.
11. Hemasitometre kullanarak PMN Enumerate.
12. Alt haznede PMN toplam sayısını hesaplamak için, 6000 1 mm ^2'de PMN sayısı (100 nl) çarpın. PMN sayısı 10 ⁶ giriş PMN normalize gibi veri girişi PMN bir yüzdesi olarak belirtilir, ya da olabilir.

Representative Results

Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, çeşitli uyaranlara (Şekil 1B) karşılık olarak kültürlenmiş mesane epitel hücre tabakası boyunca insan PMN göç kantitatif bir değerlendirmesini sağlar. Protokol basit iken, PMN göçünü etkilemeye ve sonuç olarak bu tahlilin tekrarlanabilirliğini etkileyen değişkenler vardır. Teknik ve biyolojik çoğaltır arasındaki değişkenliği azaltmak için geçirgen destek ve PMN hazırlarken önlemler alınmalıdır. Örneğin, yeterli bir birleşik 5637 hücre tek tabakaları ihtiva eden geçirgen destek bir deney kullanılmalıdır. 5637 hücre Confluence sıvıya karşı sızdırmazlık ölçen işlevsel bir test kullanılarak değerlendirilir. Üst hazneye ilave ortam karşısında geçirgen tabaka desteği dengeye, daha sonra 5.637 hücreler deney yapmak için yeterince konfluent değildir. Üst hazne içindeki hacmi muhafaza edilir, daha sonra geçirgenmümkün destek PMN geçişini değerlendirmek için de kullanılabilir. Biz hücrelerin izdiham üzerine alçakgönüllülükle yükselir, bu sistemi, transepitelyal elektriksel direnci ölçülen var, bu yöntem seçilirse, bakım aksi takdirde steril kurulum kirletmesine değil alınmalıdır. 7 gün sonra tohumlama 5637 hücrelerin Kavşak hücrelerinin geçiş sayısı ve geçirgen destek üzerine serpildi hücre sayısı dahil olmak üzere birçok faktör tarafından etkilenir. Buna ek olarak, 5637 hücre ekim sırasında ters konumda geçirgen destek üzerinde inkübe edilir zaman miktarı 16 saat (Şekil 1A) aşmamalıdır. En iyi tekrarlanabilirlik için, protokol tam olarak izlenmelidir. Son olarak, birleşik 5637 hücre katman içeren geçirgen destek 1-2 gün içinde kullanılmalıdır ve desteklerin membranlar 5637 hücrelerinin büyümesi ya da transuroepithelial nötrofil göçü deneyi sırasında ya da temas sırasında hiçbir zaman.

Bir In5637 hücrelere ddition, değişkenlik de PMN hazırlanması esnasında katılabilmektedir. Bu sayı, kişiden kişiye değişir, ancak PMN izole etmek için, yukarıda ayrıntılı olarak açıklanan protokol kullanılarak, insan kanı, 1 ml, tipik olarak, yaklaşık 10 ⁶ PMN verir. Tek bir donörün kan tipik verim bilinir sonra, izolasyon protokol aşağı yukarı buna göre ölçekli olabilir. Sağlıksız veya hasta bireylerden PMN kaçınılmalıdır ve farklı PMN donörler görülen sonuçlar tekrar olduğundan emin olmak için biyolojik kopyalar için kullanılmalıdır. PMN izolasyonu sırasında aktivasyonunu önlemek için yavaşça ve aseptik ele alınmalıdır. PMN kez vücuttan uzun bir süre hayatta olmayan Son olarak, deneysel prosedürler zamanlaması önemlidir. Biz izolasyon işlemini tamamladıktan 1 saat içinde PMN kullanmaktadır. Bu hususlar dikkate alındığında, en az 3 teknik çoğaltır her bir biyolojik tekrarında dahil edilmelidir.

Sayısı1 saat sonra alt haznede PMN 10 ⁶ giriş PMN normalize (Şekil 2) de gösterilmiştir. Alternatif olarak, PMN numaraları biyolojik çoğaltır arasındaki farklılığı azaltabilir giriş PMN, normalizasyon sonrasında bir iç kontrole kıyasla olabilir. Detaylara dikkat ile yukarıda özetlenen protokole uyulması bakteri (Şekil 2A) ve kemoatraktant maddelerin (Şekil 2B) gibi uyaranlara PMN göç numaralandırma sağlar.

Şekil 1. Deney tasarımı şematik. (A) 5637 mesane epitel hücreleri ters geçirgen destek üzerinde tohumlanır, destekler, 24 oyuklu bir plakaya düzeltilemez edilir ve hücreler çoğalmak üzere büyütüldüler. (B) Permeabirleşik 5637 hücreleri içeren ble destekleri E ile ters çevrilir ve enfekte epitel tabakaları apikal tarafında coli. Seçenek olarak ise, Kemoattraktantlar alt haznede yerleştirilebilir. Geçirgen destek düşük bağlantı plakasına düzeltilemez edilir ve yeni izole edilmiş insan PMN (epitel tabakaların bazolateral taraf temsil eden), üst hazneye uygulanır. PMN epitel boyunca göç eder ve bir hemositometre kullanılarak alt hazneden numaralandırılır.

Şekil 2. PMN çeşitli uyaranlara yanıt olarak mesane epitel boyunca göç eder. Patojenik E ile (A) Enfeksiyon coli suşu MG1655, ısı ile öldürülmüş MG1655 (HKMG) veya UPEC mutant UTI89 ybcL :: cat önemli ölçüde daha fazla PMN migratio ortaya çıkarırn wild-tip UPEC gerginlik UTI89 ile alay enfeksiyon ya da enfeksiyon daha, bir sistit (*, p <0.001) izole. (B) sahte işlem (* p <0.001) önemli ölçüde daha fazla PMN göç alt hazne sonuçlarına fMLF (100 nM) ya da IL-8 (100 ng / ml) ilavesi. En az 3 kez tekrarlanmış olan biyolojik ortalamasını ve standart sapmasını temsil eder. Istatistiksel olarak önemli farklılıklar bir Student t-testi kullanılarak tespit edilmiştir.

Discussion

Kültürlü bir mesane epitel hücre çizgisi ve yeni izole edilmiş insan PMN kullanarak, transuroepithelial nötrofil göçü bir in vitro bir model oluşturduk. Bu model idrar yolu enfeksiyonu (İYE) sırasında doğal immün yanıt, tipik UPEC ⁹ nedeniyle son derece yaygın bir bakteriyel enfeksiyon karmaşıklığı incelemek başlayan vesile olmuştur. Mesane ya da sistit enfeksiyon esnasında, mesane lümenine PMN işe bakteri açıklık ¹⁰ için gereklidir. Bir enflamatuar yanıtın karşısında bir dayanak oluşturmak için, UPEC UPEC bağışıklık basınç ^6,11 yokluğunda mesane epitel istila edebilir süreyi uzatır mesane, PMN için varış geciktirir. Bu fenotip, erken zaman noktalarında UPEC ile PMN göç bastırılması, transuroepithelial PMN göç eden in vitro model gözlenir. Patojenik E. enfeksiyonu coli MG1655 ortaya çıkarırüropatojenik E ile enfeksiyona daha belirgin PMN migrasyonu coli UTI89 (Şekil 2A); MG1655 ve UTI89 ile ko-enfeksiyon üropatojenik fenotip (PMN göç yani düşük seviyeleri) verir ^6. YbcL silinmesi ⁷ vahşi tip UTI89 (Şekil 2A) ile karşılaştırıldığında, alt haznede önemli ölçüde daha fazla PMN ile sonuçlanmıştır Ayrıca, bastırıcı fenotipine katkıda bulunan bir UPEC protein, YbcL, tespit edilmiştir. PMN göç yüksek düzeyleri de ısı-ölümlü MG1655, fMLF ve IL-8 (Şekil 2A ve B) ile ortaya çıkarıldı. Canlı bakteriyel uyarıcı ile enfeksiyon ile karşılaştırıldığında, kemo-çekiciler kullanımı deneysel protokol ve sonuçların yorumlanmasını kolaylaştırmak hem de olabilir. Diğer Kemoattraktantlar (örneğin, bakteriyel ürünler ya da kemokinler), aynı zamanda, bu modelde, PMN ortaya olasıdır. Bugüne kadar, transuroepithelial nötrofil göç götay in vivo modellerde ^6-8 doğrulandıktan fenotiplerini açığa UPEC tarafından erken inflamatuar yanıtın baskılanması soruşturma kolaylaştırmıştır ve gelecekteki çalışmalarında çok değerli bir araç olacaktır.

Bu deney bir dizi soru adrese potansiyeline sahip olsa da, birkaç sınırlamalar vardır. Hazırlanması ve suretin arasında yeniden sağlamak için deneyler sırasında, bu deneyde doğasında değişkenlerin sayısı göz önüne alındığında, dikkat edilmelidir. Sayma yoğun bir zaman olabilir ve PMN kısa ömürlü, özellikle bakteri varlığında, vücuttan kez olarak sayımı ile PMN numaralandırma, hata eğilimli. PMN numune toplama ve PMN numaralandırma arasındaki zamanı azaltarak daha doğru veri toplama neden olur. Araştırmacılar PMN ^12,13 için bir vekil olarak miyeloperoksidaz (MPO) enzim aktivitesini ölçmek kolorimetrik deneyleri tarif var. Örneğin 3,3 ve alt katmanlar kullandıkları gibi kolorimetrik tahlilleri# 39;, 5,5 ',-tetrametilbenzidin (TMB) veya 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) (ABTS) alt PMN mevcut konsantrasyonlarını tespit etmek için yeterince duyarlı değildir (Lau ve Hunstad, yayınlanmamış veri) yukarıda ayrıntılı transuroepithelial nötrofil göç protokolünü kullanan rezervuarlar. , Migrasyon deneyi parametreleri alt rezervuar numunelerdeki PMN yoğunluğunu artırmak için manipüle edilebilir. Alternatif olarak, potansiyel bir floresan substratı kullanan büyük bir hassasiyet ile bir MPO tahlil, kurulabilir. MPO aktivitesi ölçümü PMN sayımı için bir alternatif temsil eder ve alt rezervuar örneklerinde PMN daha doğru numaralandırma etkinleştirebilirsiniz. Ayrıca, bu tür bir deneyi de epitel tabakaları ve üst haznede kalan PMN yapışık numaralandırılmasına izin verebilir. A valide MPO-tabanlı protokol transuroep tahsil edilebilecek veri miktarını ve türünü genişletmek verebilecek güçlü bir araç temsil edecekithelial nötrofil göçü deneyi.

Gastrointestinal sistem ve akciğer doğal immün tepkisini modellemek Transepitelyal nötrofil göçü deneyler yaygındır ve PMN ^4,5 ile epitel engellerin zikzaklı mevcut anlaşılması için sorumludur. Buna karşılık, üroepitelyal engelleri karşısında PMN hareketi çok daha az dikkat çekmiştir. Kaydet ve arkadaşları farklılaşmış UROtsa hücrelerden oluşan bir polarize epitel kullanan bir model bildirdin, geçirgen büyütüldü üreter dokusundan türetilen bir ölümsüzleştirdi hücre hattı, ¹⁴ destekler. Agace ve arkadaşları benzer bir modeli ¹⁵ farklılaşmamış mesane (J82) ve böbrekte (A498) epitel hücrelerinin kullanımı bildirdin. 5637 hücre tabakaları tabakalı ve büyük olasılıkla resmen polarize uğramamış olsa burada detaylı transuroepithelial nötrofil göç modelde, sıkı kavşaklar makromolekülsel geçirimsizliği tarafından değerlendirilir, oluşurakı ve sıkı kavşak proteinlerin (Lau ve Hunstad, yayınlanmamış veri) ifadesi ve yerelleştirme. Notun, epitel tabakası da biz anlattığımız enfeksiyon koşullarında böyle geçirimsizliği korur. Kaydet ve Agace tarafından bildirilen protokoller UPEC 24 saat izolatlar ile enfeksiyon sonrası enflamatuar yanıtı modeli. Bu modellerde, UPEC sağlam PMN göçü ortaya çıkarmak. Bunun tersine, bizim modelinde epitel tabakaları ev sahibi ve patojen arasındaki ilk etkileşimi incelemek için, zaman, 1 saat gibi kısa bir süre için UPEC maruz kalmaktadır. Bundan başka, mesane epitel hücre hattının kullanımı ve sistit türetilmiş UPEC izole murin sistit modelinde ¹⁶ in vitro çeviri bulguların potansiyel sağlar. Son olarak, çalışmalar, 6 çukurlu doku kültür kaplarına gerektirir kullanılan geniş geçirgen destek yukarıda. Daha küçük geçirgen desteklerin kullanılması, bizim modelinde olduğu gibi, reaktif kullanımını azaltır ve ekin sayısını artırırDeneme başına manipüle edilebilir s. Bu model sistemler, her avantajları ve dezavantajları vardır, ancak bu modellerin toplu potansiyel üriner dokulara PMN göçü için gerekli etkinlik önemli olduğunu tanımlamak için kullanılır.

Daha az endotel engelleri genelinde göçün daha anlaşılır olmasına rağmen, gastrointestinal ve pulmoner epitel engelleri karşısında PMN geçiş çok ^{çalışma, 4,5} aldı. Geçirgen destek ve kültürlenmiş epitelyum hücrelerinin kullanılması Transepitelyal nötrofil göçü modelleri, bu sinyal olayları ve epitel üzerinden PMN hareketine katılan yapışma moleküllerinin bazı ortaya koymuştur. Kültür idrar epitel hücreleri kullanılarak yapılan ön çalışmalar içi yapışma molekülü-1 (ICAM-1), katılımını ve idrar dokular ¹⁵ arasında PMN göç β-integrin CD11b/CD18 (Mac-1) göstermektedir. Bu, ek bir sinyal yollar ve yapışkan moleküller dahil olduğu belirsizdiridrar yollarında bu karmaşık süreçlerde. Burada tarif transuroepithelial nötrofil göç modeli kullanılarak, belki mikroskobik inceleme ^14,15 ile artar, bu temel sorular ve diğerleri sorguya olabilir. Buna ek olarak, bakteri genetik ile bağlantılı olarak, bu model ayrıca, UPEC ile PMN göç bastırılması olarak patojene özgü fenotipleri değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu UPEC onun baskılayıcı bir etkiye sahip PMN göç çok aşamalı bir işlemde bu noktada açık değildir. Ayrıca, YbcL PMN göçü etkileyen hangi mekanizma henüz aydınlatılamamıştır gelmiştir. İlk mesane epiteli boyunca PMN geçişi için temel ihtiyaçlarını anlayarak, biz o UPEC hastalığı kolaylaştırmak için bu süreçleri yöneten nasıl soruşturma başlayabilirsiniz.

Bir çok yöntem hücrelerin hareketi çalışma için mevcut ise Özet olarak, daha az sayıda yaklaşımlar hücre engelleri arasında hücre göçü sorgulamak için kullanılabilir. ModificatioBoyden odasına ns endotel ve epitel engelleri karşısında hücre göçü araştıran ayrılmaz bir parçası olmuştur. Örneğin burada detaylı transuroepithelial nötrofil göçü deneyi olarak idrar yolu, akut inflamatuar yanıtın bir uysal in vitro modeli, bu karmaşık işlemleri araştırılması için değerli bir araçtır. Son olarak, bu tahlil için modifikasyonlar, idrar yolu, diğer hastalık durumları içine araştırmalar kolaylaştırabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell Inserts (i.e. permeable supports)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution	GE Healthcare	17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates	Corning	3473	24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8	R&D Systems	208-IL	Reconstituted in PBS to 100 μg/ml