Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודלים לאינטראקציה בין סביבת גנים כדי לחשוף מנגנוני רגישות במחלת פרקינסון

Published: January 7, 2014 doi: 10.3791/50960
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

Summary

ליפוקסיג'נאז (LOX) isozymes יכול לייצר מוצרים שעשויים להגדיל או להקטין נוירואינפלמציה ו ניוון עצבי. מחקר אינטראקציה גנטית-סביבה יכול לזהות LOX השפעות ספציפיות isozyme. באמצעות 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) מודל של נזק nigrostriatal בשני קווים מהונדסים LOX isozyme לקוי מאפשר להשוות את התרומה של איזוזימים LOX על שלמות דופאמין ודלקת.

Abstract

פעילות Lipoxygenase (LOX) כבר מעורב בהפרעות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, אבל השפעותיו מחלת פרקינסון (PD) פתוגנזה מובנים פחות. מודלים של אינטראקציה בין סביבת גנים יש תועלת לחשוף את ההשפעה של מסלולים תאיים ספציפיים רעילות כי לא ניתן לראות באמצעות מודל מחלה גנטית או רעילה בלבד. כדי להעריך אם isozymes LOX נפרדים באופן סלקטיבי לתרום ניוון עצבי הקשורות PD, מהונדס (כלומר 5-LOX ו 12/15-LOX לקוי) עכברים ניתן לאתגר עם רעלן המחקה פגיעה בתא ומוות בהפרעה. כאן אנו מתארים את השימוש של רעלן עצבי, 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), אשר מייצר נגע nigrostriatal כדי להבהיר את התרומות המובהק של LOX isozymes לניוון עצבי הקשורים PD. השימוש MPTP בעכבר, ופרימט לא אנושי, מבוסס היטב כדי לסכם את הנזק nigrostriatal ב PD. היקף הנגע הנגרמת על ידי MPTP נמדד על ידי ניתוח HPLC של דופמין והמטבוליטים שלו וניתוח כתמים מערביים חצי כמותיים של סטריאטום לטירוסין הידרוקסילאז (TH), האנזים המגביל את הקצב לסינתזה של דופמין. כדי להעריך סמנים דלקתיים, אשר עשוי להדגים רגישות LOX isozyme סלקטיבית, חלבון חומצי פרפור גליה (GFAP) ו Iba-1 אימונוהיסטוכימיה מבוצעים על קטעי המוח המכילים סובסטנציה ניגרה, וניתוח כתם מערבי GFAP מבוצע על הומוגנטים סטריאטליים. גישה ניסיונית זו יכולה לספק תובנות חדשניות על אינטראקציות בין סביבות גנים שבבסיס ניוון nigrostriatal ו PD.

Introduction

שימוש במודלים של אינטראקציה בין גנים לסביבה מספק גישה לחיקוי גורמי סיכון שעשויים להשפיע על מחלת פרקינסון אידיופטית (PD) ומעניק הזדמנות להבחין בתובנות מכניות שלא סביר שיבהירו אותן על ידי שימוש במערכת גנטית או רעילה בלבד1,2. כאן אנו ממחישים נקודה זו ומתארים את היישום של 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) מודל העכבר של ניוון nigrostriatal3 כדי להבין טוב יותר את הסלקטיביות של ליפוקסיגנאז (LOX) פעילות איזוזימה על נוירואינפלמציה ורעילות4. בעוד תפקיד עבור ISOZYmes LOX הוערך באופן נרחב בהפרעות היקפיות5,6, כמו גם מחלת מערכת העצבים המרכזית כוללשבץ 7 ומחלת אלצהיימר8,9, התפקיד של המשפחה של isozymes בתפקוד nigrostriatal ניוון הקשורים PD אינו מובן היטב ומצדיק מחקר. הרעלן העצבי MPTP מדגים ניוון מועדף של המסלול nigrostriatal ו recapitulates דלדול דופמין סטריאטלי ואובדן תאים דופאמין nigral כי ביסוד ליקויים מוטוריים בחולי PD10. בעוד מודל זה אינו לשחזר את הסגל המלא של התנהגויות PD nonmotor ומנוע פרנק α-synuclein חיובי לוי גוף פתולוגיה, זה כבר שימושי כדי להבהיר מטרות מכניות הרומן שתורמים נזק nigrostriatal עבור בדיקות תרגום בשלב מוקדם כפי שהוא המודל המאופיינת הטובה ביותר לא פולשני זמין לייצר מוות תאי ניגרל מלווה אובדן דופמין סטריאטלי11-15. שימוש נרחב בעכבר MPTP, עם פרדיגמות החל חריפה, subacute כדיכרונית 16-18, אפשרה סטנדרטיזציה של מינון לגרום נזק nigrostriatal קל עד חמור19,20 עם הפעלת מנגנונים שונים של רעילות בהתאם משטר הטיפול18,21,22. כתוצאה מכך, זה מאפשר 'חלון של נגע' להיות ממוקד שעלול לגרום לפציעה nigrostriatal משופרת או מופחתת בהתאם לסוכן הטיפולי או מודל מהונדס מנוצל23-25.

כמו כן חיוני למחקרים ביולוגיים תרגום וגילוי הם הטכניקות המשמשות להערכת נזק ואת הראיות שיטות כאלה לספק. עבור מודל העכבר MPTP, מדדים הוקמה כדי להעריך נגעים הם מדידה של סמנים של טון דופאמין סטריאטלי, כולל דופמין מטבוליטים שלה על ידי HPLC, וניתוח כתם מערבי של טירוסין hydroxylase (TH), האנזים הגבלת קצב סינתזה דופמין,ואינדיקטורים של אירועים ניווניים כגון הפעלה גלית באמצעות ניתוח כתם מערבי immunostochemist. למרות שמדובר בהליכים נוירוכימיים, ביוכימיים והיסטולוגיים קלאסיים, הטכניקות מספקות קריאות קריטיות וניתנות לשחזור על היקף הנזק בתוך המסלול הדופאמינרגי הניגרוסטריאטי, מצביעות על מנגנוני רעילות, והוכיחו את עצמן ככלים חשובים להבנת אירועים ניווניים בפ"ד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל ההליכים בבעלי חיים ושיטות הטיפול בבעלי חיים צריכים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים (IACUC). המחקר המתואר כאן בוצע בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי IACUC של SRI הבינלאומי.

1. רכישה ותחזוקה של עכברים לוק-לקויים

  1. לרכוש 5-LOX לקוי או 12/15-LOX לקוי עכברים זן בהתאמה ובקרות תואמות מין בגיל 7-8 שבועות ולאפשר כמה ימים להתאקלמות למתקן לאחר ההגעה.
  2. שמרו על עכברים בדיור קבוצתי במחזור של 12 שעות בחושך בהיר ותנו מזון ומי שתייה מודעת ליביטום.

2. אמצעי זהירות MPTP, אחסון, הכנה, טיהור וסילוק

הערה: שיכרון MPTP מחשיפה תוך ורידי בבני אדם הוכח כגורם לפרקינסון10; MPTP הוא ליפופילי מאוד והוא יכול בקלות לחצות את מחסום הדם - מוח26. יש לנקוט אמצעי זהירות כדי להבטיח טיפול בטוח, ניקוי רעלים וסילוק. חילוף החומרים שלה כרוך צעדים מרובים כולל המרה 1-מתיל-4-פניל-2,3-דיהידרופרידיניום על ידי האנזים מונואמין אוקסידאז B (MAO-B)27. מעכבי MAO-B עשויים להיות מנוצלים במקרה של שיכרון אנושי מקרי.

  1. ודא שלצוותים יש הכשרה מתאימה בבטיחות ובטיפול לפני השימוש ב- MPTP כפי שהוכתב על ידי ועדת הבריאות והבטיחות של המוסד. כל מוסד רשאי להקים וליישם נהלי הפעלה סטנדרטיים משלו לשימוש ב- MPTP, בהתבסס על המלצות המפורטות באופן מקיף בספרות17,22.
  2. לפני ההכנה, יש לתרום ציוד מגן אישי מתאים (PPE) כולל: חלוק מעבדה חד פעמי או חליפת גוף מלאה, כפפות ניטריל כפולות, מסכה כירורגית, כיסוי שיער, משקפי בטיחות וכיסויי נעליים חד פעמיים. PPE הנכון צריך להיות משוחק במהלך הכנת MPTP, פרדיגמת ההזרקה ו 72 שעות לאחר הזרקה בעת טיפול בבעלי חיים ו / או מצעים.
  3. בצע חישובים לפני ההכנה. יש לפעול בהתאם להנחיות המוסדיות למינון כמויות; משלוח של 100-150 μl משמש בדרך כלל עבור 25-30 עכברים גרם.
    1. כדי להכין פתרון MPTP 3 מ"ג / מ"ל מלוחים, להחיל גורם תיקון (1.211 MPTP-HCl: 1.0 בסיס חופשי MPTP); הריכוז של MPTP-HCl ברכב מלוחים הוא 3.633 מ"ג / מ"ל.
    2. הכינו את כל הציוד, האספקה והריאגנטים הדרושים להכנת MPTP וטיהור פוטנציאלי לשפיכה לפני הטיפול ברעלן העצבי.
  4. הסר בקבוקון מקור MPTP-HCl ממיקום האחסון הנכון.
    הערה: יש לשמור את MPTP ב- RT בבקבוקון סגור בתוך גורם מכיל משני, ולאחסן אותו בתוך ארון נעול, שכותרתו "MPTP".
    1. מכסים את האזור המקיף קשקשים עם רפידות או מגבות נייר מעומעמות בתמיסת אקונומיקה של 10% כדי להפחית את הסיכון מאבקה שנשפכה. יש לשמור על רקמות ו-10% תמיסת אקונומיקה בקרבת מקום כאמצעי זהירות.
    2. באמצעות איזון אנליטי הממוקם במכסה המנוע אדים, שוקלים 50 מ"ג MPTP-HCl לתוך בקבוקון זכוכית עם בלימה משנית המכילה 10% רקמה ספוגה אקונומיקה. תווית בקבוקון זכוכית "MPTP" עם ריכוז ותאריך.
    3. סגור בקבוקון מקור ולנגב את החוץ עם 10% אקונומיקה.
  5. מוסיפים לאט תמיסת מלח סטרילית של 13.763 מ"ל לבקבוקון וסוגר לחלוטין לערבוב. (הפתרון הוא 3.633mg/ml MPTP-HCl).)
    1. במכסה המנוע, לעקר בזהירות פתרון MPTP על ידי סינון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוקון הזרקה שכותרתו בתוך מיכל משני עם 10% רקמה ספוגה אקונומיקה. נקה כל שפיכה עם רקמה ספוגה באקונומיקה.
    2. בזהירות להיפטר חדות בקבוקון במיכל biohazard שכותרתו כראוי. שמור על פתרון MPTP בבקבוקון במיכל המשני עם רקמה ספוגה אקונומיקה להובלה לחדר נהלים לבעלי חיים.
      הערה: אין למטבל את פתרון MPTP לחיטוי מכיוון שהאדייה שלו מהווה סכנת שאיפה.
  6. החזר בקבוקון מקור MPTP לגורם המכיל המשני שלו ומקום במיקום האחסון. מרית מרוקן, קנה מידה אנליטי ומשטח מכסה המנוע במשך 10 דקות באמצעות 10% אקונומיקה.

3. ניהול MPTP

  1. הכינו כלובים חד פעמיים עם מכסים מחוררים מיקרוסולטור סטנדרטיים המכילים ספינות מסוננות פוליאסטר המסומנות "MPTP" (מינוס גריל מזון תיל), ספינות כלוב חד פעמיות, כדורי מזון רטובים מראש והידרוגל כמקור מים. לשקול את כל בעלי החיים ואת נפח שיא של 3 מ"ג / מ"ל MPTP מלוחים נדרש עבור 15 מ"ג / קילוגרם הזרקה.
    הערה: מטבוליטים MPTP ניתנים לגילוי excreta במשך 3 ימים לאחר הזרקה28,29; עם זאת, עכברים מפרישים MPTP n-תחמוצת, נגזרת רעילה שאינה חוצה ממברנות בגלל ההידרופיליות שלה30.
    1. לובש את כל PPE המפורטים לעיל ומחזיק עכברים על כרית ספיגה חד פעמית, להזריק רכב מלוחים או תמיסת MPTP עבור 15 מ"ג / קילוגרם מינון לתוך חלל תוך-פרטי (i.p.), מדי יום במשך 4 ימים עם מזרק פקעת חד פעמי 26-מד.
    2. אין לסכם את המזרק לאחר השימוש; יש להשליך לתוך מיכל חדים ייעודי ומסומן MPTP. לשמור על 10% אקונומיקה ורקמות בקרבת מקום כדי לנקות כל טפטוף מקרי.
  2. מניחים בעלי חיים מוזרקים עם MPTP בכלובים חד פעמיים, עד 5 עכברים לכלוב, ובית על מתלים פתוחים. אין להשתמש במדפים מאווררים.
    1. מניחים MPTP להשתמש בשלטים על מתלה המכיל עכברים ודלת חדר דיור עד 72 שעות לאחר הזריקה האחרונה.
      הערה: להבטיח את הטמפרטורה של חדר דיור הוא בין 22.2 - 24.4oC, כמו עכברים חווים היפותרמיה חולפת עד 12h בעקבות שיכרון MPTP. 31
    2. נקה משטח עבודה עם אקונומיקה לאחר כל שימוש (ראה שלב 2.8), להשליך שאריות פתרון MPTP על ידי הוספת נפח שווה ערך של 10% אקונומיקה, ולהשליך את התוכן כמו פסולת נוזלית biohazardous.
    3. השלך את כל PPE בשימוש בסל סילוק ייעודי. במידת הצורך, יש לרסס עם 10% אקונומיקה לפני ההשלכה.
  3. יש לבדוק בעלי חיים באופן קבוע ולרענן את מקור המזון והמים מדי יום במהלך פרדיגמת ההזרקה ו-72 שעות לאחר הזריקה האחרונה. הערה: למרות שלא צפוי זיהום באזור המקיף את החלק החיצוני של הכלוב, אזור זה מטופל בתמיסת אקונומיקה כאמצעי זהירות (כמתואר בשלב 2.8). יש להקפיד בעת טיפול בכל העכברים והציוד בתקופה זו.
    1. שלושה ימים לאחר הזריקה האחרונה, להשליך את כל הכלובים ואניות בשקית biohazard שכותרתו כראוי. לחדש את השימוש PPE רגיל ודיור רגיל לבעלי חיים; להסיר כרזות דלת ומדף.

4. קצירת רקמות

  1. המתת חסד לבעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם 7 ימים לאחר הזרקת MPTP האחרונה. יש לנתח מיד את המוח על הקרח באמצעות תבנית מוח מצוננת מראש עם חריצי 1 מ"מ במישור הקורונל.
  2. לנתח את הסטריאטום מפרוסת קדום בעובי 2 מ"מ ברמה של המזנון העדתי.
    1. הסר את האזורים הקליפתיים והתת-קליפתיים שמסביב באמצעות אזמל. רקמת סטריאטל בהקפאה מהירה מכל חצי כדור בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.5 מ"ל לניתוח נוירוכימי או ביוכימי.
  3. לחסום midbrain / hindbrain במישור coronal ברמה של ההיפותלמוס הקדמוני ורקמות תיקון טבילה בתמיסה מימית פורמלדהיד 4%.

5. עיבוד רקמות

  1. תהליך הביוכימיה
    1. הומוגניזציה רקמה סטריאטלית מחצי כדור אחד באמצעות משבש תא קולי 200-μL Tris-EDTA מאגר תמוגה (בסיס Tris 25mM, 1mM EDTA, 1:100 פרוטאז וקוקטיילים מעכבי פוספטאז) עבור 10 פולסים ב 10-12 הרץ וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4oC ב 1000xg.
    2. בזהירות לשאוף את supernatant, לשקם את גלולה במאגר תמוגה 150-μl. שברים משמשים לניתוח ביוכימי על ידי SDS-PAGE ו סופג המערבי.
      הערה: השתמש במאגר המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז בתוך שעה אחת של הכנה עקב חוסר יציבות בתמיסות מימיות.
  2. תהליך נוירוכימיה
    1. השתמש בסטריאטום שנותח מחצי הכדור האחר מכל דגימה המאוחסנת ב- -80°C עבור HPLC. להפשיר רקמות סטריאטליות בצינורות microfuge על קרח, להוסיף 500-μl 0.3N חומצה פרכלורית (PCA) הומוגניזציה באמצעות sonicator.
      הערה: כדי להפוך 100 מ"ל של PCA 0.3N, למדוד 90-מיליליטר ddH2O, להוסיף צילינדר בוגר 100 מ"ל, להוסיף 2.58 מ"ל של 70% PCA, ולהביא 100-מיליליטר סימן. מאגר מדגם זה יכול להיות מאוחסן ב 4°C עד חודש אחד.
    2. רקמת Sonicate striatal ב 500-μl קר כקרח 0.3N PCA, עבור 10 פולסים ב 10-12 הרץ ומניחים על קרח. כדי להבטיח הומוגניות, sonicate דגימות בפעם השנייה במשך 10 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 12 דקות ב 4oC ב 16,100xg.
    3. מיד נטול קפאין לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. מייבשים את שבר הכדור במכסה המנוע.
    4. לשמור על supernatant ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש למדידת דופמין מטבוליטים שלה, 3,4-dihydroxyphenylacetic חומצה (DOPAC) וחומצה הומובנילית (HVA) על ידי HPLC עם זיהוי אלקטרוכימי.
    5. לאחר יבש, לשקם את שבר גלולה ב 0.5N NaOH (500 μL), ו sonicate בקצרה. יש לאחסן שבר גלולה משוחזר ב-4°C עד לקביעת סך כל החלבון בשיטת לאורי.
  3. תהליך אימונוהיסטוכימיה
    1. טבילה-לתקן בלוקים באמצע ובמוח האחורי לילה ב 4% פתרון מימית פורמלדהיד cryoprotect בפתרונות סוכרוז מדורגים (10% מלוחים אגירה פוספט (0.01 M PBS; 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl ו- ddH2O, pH 7.4) עבור 24 שעות, ולאחר מכן 30% ב- PBS עד שהרקמה שוקעת) ב- 4°C. בקצרה כתמים קוביות cryoprotected כדי להסיר פתרון סוכרוז עודף, להקפיא על קרח יבש ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
    2. מקטע מיקרוטום של בלוקי מוח המכילים מוח באמצע ובחלק האחורי בהקפאה.
      1. הסר רקמות מ-80°C, ישווה ב-16°C למשך שעה בהקפאה, והתלה במדיית הטמעת רקמות.
      2. לאסוף מקטעי קורנל בעובי של 40 מיקרומטר לתוך פתרון cryoprotectant (0.01M PBS עם 30% סוכרוז, 30% אתילן גליקול, pH 7.4) ב -16°C. לאסוף רקמות באופן סדרתי לתוך 6 צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל במרווחי זמן של 240 um ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

6. חיסונים

  1. לקבוע את ריכוז החלבון בחלק על-טבעי סטריאטלי (מוכן כמתואר בסעיף 5.1) על ידי BCA assay.
  2. לחשב דילול הנדרש עבור כל מדגם להניב 10 מיקרוגרם לכל טוב נמסר ב 20 μl של נפח.
  3. דיללו חלבון על-טבעי עם חיץ 4X Laemmli ומאגר הומוגניזציה להפקת 10 מיקרוגרם חלבון בתמיסת חיץ 1X Laemmli. חישוב לדוגמה:
    1. לקבוע ריכוז סופי של חלבון ונפח נדרש. במקרה זה, 10 מיקרוגרם ב 20 μl (0.5 מ"ג / מ"ל) נדרש.
    2. קבע את הנפח הסופי של פתרון החלבון הדרוש. למרות 20 μl נדרש לטעינה, נפח נוסף צריך להיות מוכן (30 μl).
    3. מאז הנפח הסופי ואת הריכוז ידועים, ואת הריכוז של שבר חלבון supernatant ידוע (נקבע על ידי מבחני BCA), לחשב את נפח החלבון supernatant הנדרש באמצעות המשוואה:
      Vטבעי = (Vהסופי xC הסופי)/C supernatant
      לכן, עבור ריכוז חלבון טבעי של 1.5 מ"ג / מ"ל,
      Vטבעי = (30 μl x 0.5 מ"ג / מ"ל)/1.5 מ"ג / מיליליטר
      Vטבעי = 10 μl
    4. לחשב כמות של 4X Laemmli מאגר נדרש להניב ריכוז 1x ב 30 μl של נפח (30 μl / 4 = 7.5 μl). הערה: מאגר Laemmli 4X חייב להיות מדולל לעוצמה של פי 1 בהכנת הדגימה.
    5. לחשב את כמות מאגר הומוגניזציה הנדרש כדי להביא נפח ל 30 μl (ולקבל את ריכוז החלבון הסופי הרצוי של 0.5 מ"ג / מ"ל):
    6. הכן מדגם על ידי מערבולת ולאחר מכן pipetting 10 μl של חלבון supernatant לתוך 12.5 μl של חוצץ הומוגניזציה. הוסף 7.5 מיקרוליטר של מאגר Laemmli 4X עבור פתרון עבודה מדגם 30-μl וריכוז 0.5 מ"ג / מיליליטר.
  4. מכינים את כל הדגימות באמצעות הליך המתואר, מערבולת ומרתיחים במשך 5 דקות.
    הערה: השתמש בצינורות מיקרוצנטריפוגה בורג העליון כדי למנוע דליפה ופתיחה עקב לחץ במהלך הרתיחה.
  5. לאחר 5 דקות, מיד מניחים על קרח. לטעון 20 μl של פתרון עבודה מדגם לכל ג'ל היטב (10 מיקרוגרם של חלבון). דגימות חלבון נפרדות על ידי SDS-PAGE על ג'ל טריס-גליצין 12%.
    1. השתמש בסולם חלבון מוכתם מראש לאישור משקולות מולקולריות. המאגר פועל הוא בסיס Tris 25 mM, גליצין 192 מ"מ, 0.1% SDS ו- ddH2O, pH 8.3.
    2. חלבונים נפרדים על ידי אלקטרופורזה: לרוץ ב 80 V כדי לנקות את בארות (10 דקות) ו 125 V (כ 1 שעות; עד סולם החלבון נפרד לחלוטין) כדי לפתור את החלבונים.
  6. בצע העברת חלבון לניטרוסלולוז באמצעות קרום 0.2 מיקרומטר ניטרוקלולוז במאגר העברת טריס-גליצין (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, 0.04% SDS, 20% מתנול ו- ddH2O, pH 8.3) לילה עבור 40 V ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. לשטוף כתמי nitrocellulose ב 1x Tris מלוחים (TS; 25mM Tris, 0.9% NaCl ב ddH2O, pH 7.4) במשך 10 דקות ב RT. lncubate ב Ponceau S במשך 5 דקות ואז לשטוף ב DDH2O כדי לספק אימות גס של טעינת חלבון שווה ערך. סרוק תמונה כדי לשמור על רשומה עבור מחברת ולבטל את השימוש ב- PBS.
    הערה: לחלופין, לשטוף כתם מילי-Q או ddH2O המכיל HCl (0.2%) במשך כ 5 דקות. בצע סריקה לאיתור רשומה. הסר כתם פונסאו S מהממברנה על ידי שלב הדגירה הבא (כלומר מקום במאגר החסימה).
  8. חסום כתמים ב 5% אבקת חלב ללא שומן ב TS עבור 1 שעה ב RT ו הדגירה 24h ב 4ºC עם ארנב אנטי טירוסין hydroxylase (1:1000), אנטיβ-actin (1:200); אנטי GFAP (1:1000) ב 5% חלב-TS.
  9. לשטוף כתמים 3 x 5 דקות ב TS עם 0.05% Tween-20 ו 1 x 5 דקות ב TS, ואז דגירה ב נוגדן משני HRP-מצומד (1:5000 ב TS המכיל 5% חלב), מותאם למין הראשי, עבור 2 שעות ב RT.
  10. הכן מצע chemiluminescent באמצעות כמויות שוות של פתרונות לומינול וחמצן ולהגיש בקשה במשך 1-3 דקות. בחדר חושך, מניחים כתם בשרוול פלסטיק לחשיפה לקולנוע וחושפים לקולנוע; הסרט מפותח לאחר מכן באמצעות מעבד אוטומטי.
  11. רצועת כתמים עם חיץ הפשטה זמין מסחרית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, לשטוף 3x 10 דקות ב TS עם 0.05% Tween-20, ו 1x 10 דקות ב TS ולאחר מכן reprobe עבור בקרת טעינה או חלבון אחר של עניין.
  12. כימתו את האותות באמצעות תוכנת Image J למדידות צפיפות אופטית ונרמלו לבקרת הטעינה הפנימית β– אקטין.

7. נוירוכימיה

  1. רקמה לניתוח מוכנה כמתואר לעיל בסעיף 5.2. אנא עיינו בטבלה 1 לקבלת מתכון שלב נייד.
    הערה: כל ריאגנטים חייבים להיות ≥99.0% טהורים ומדרגת HPLC. ודאו שלמות חיץ עם כלי זכוכית נקיים ומסורים מוקפצים. יש להשתמש במאגר פאזה נייד בתוך שבעה ימים ממועד ההכנה.
    1. שוקלים את הדיהידרוגן פוספט וחומצת לימון, מוסיפים 1 ליטר ddH2O ומערבבים בצילינדר בוגר 2-L. סנן את הפתרון באמצעות קרום GSTF של 0.22 מיקרומטר.
      הערה: זה ממקסם את החילוץ של מזהמים בחומצת פוספט ולימון, אשר מסייע למזער את זרמי הרקע.
    2. הוסף את OSA ואחריו את פתרון האצטוניטריל ו- EDTA. הוסף DDH2O ברמה של HPLC לכ- 1900 מ"ל לפני התאמת ה- pH ל- 3.0 עם חומצה זרחתית.
    3. הוסף DDH2O ברמה של HPLC לסימן 2-L ולאחר מכן שפוך לבקבוק 2-L. מוסיפים בר ערבוב ייעודי, ומפרקים את השלב הנייד על ידי ערבובו תחת ואקום במשך > 10 דקות.
  2. הכן את הסטנדרטים עבור דופמין, DOPAC ו HVA עבור עקומות סטנדרטיות. פתרונות מלאי של תקנים מוכנים ב 1 מ"ג / מ"ל ב 0.3 N PCA.
    1. שוקלים 12.4 מ"ג דופמין-HCl, ומוסיפים 10.0 מ"ל של 0.3 N PCA כדי להפוך 1 מ"ג / מ"ל דופמין.
    2. שוקלים 10.0 מ"ג DOPAC, ומוסיפים 10.0 מ"ל של 0.3 N PCA כדי להפוך 1 מ"ג / מ"ל DOPAC.
    3. שוקלים 10.0 מ"ג HVA, ומוסיפים 10.0 מ"ל של 0.3 N PCA כדי להפוך 1 מ"ג / מ"ל HVA.
  3. הכן פתרונות סטנדרטיים לעבודה מפתרונות המלאי. סטנדרטים של חמש נקודות משמשים ליצירת עקומת ריכוז.
    1. למדידה של דופמין סטריאטלי, להכין ריכוזים סטנדרטיים של 12.5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, ו 200 ng/ml.
    2. עבור DOPAC סטריאטלי, להכין ריכוזים סטנדרטיים של 2.5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, ו 40 ng/ml.
    3. עבור HVA סטריאטלי, להכין ריכוזים סטנדרטיים של 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, ו 80 ng/ml.
    4. צור סטנדרטים של חמש נקודות: לדלל 1 מ"ג / מ"ל דופמין פתרון מלאי 5 מיקרוגרם / מיליליטר באמצעות 0.3N PCA. לדלל 1 מ"ג / מ"ל DOPAC פתרון מלאי 1 מיקרוגרם / מיליליטר באמצעות 0.3N PCA, לדלל 1 מ"ג / מ"ל פתרון מניית HVA ל 2 מיקרוגרם / מיליליטר באמצעות 0.3N PCA.
    5. העבר 1 מ"ל של 5 מיקרוגרם / מיליליטר דופמין, 1 מ"ל של 1 מיקרוגרם / מיליליטר DOPAC, ו 1 מיליליטר של 2 מיקרוגרם / מיליליטר HVA לתוך בקבוק נפח 25 מ"ל ולהביא נפח 25 מיליליטר סימן עם 0.3 N PCA.
      הערה: הסטנדרטים המעורבים בבקבוקון נפחי מכילים את הריכוז הגבוה ביותר של תקני חמש הנקודות: 200 ng/ml של דופמין, 40 ng/ml של DOPAC, ו 80 ng/ml של HVA.
    6. מעבירים 1 מ"ל מהסטנדרטים המעורבים לצינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים של 1.5 מ"ל. בצע דילול טורי של 1:1 ארבע פעמים כדי ליצור את הסטנדרטים הבאים של ארבע נקודות.
      1. לדוגמה, כדי 250 μl של סטנדרטים מעורבים, להוסיף 250 μl של מאגר מדגם מערבולת ביסודיות כדי לייצר סטנדרטים מעורבים ב 50% של ריכוזים מקוריים; חזור על תהליך עד דילול הרצוי מושגים.
  4. הכן את מערכת HPLC (משאבה, דגימה אוטומטית, עמודה הפוכה (C18, 150×3.2 מ"מ, 3 מיקרומטר)). לטהר את המשאבה עם שלב נייד טרי להחליף את כל הפתרון הקודם במערכת HPLC ולכוד בועות אוויר עם שלב נייד טרי. מצננים את הדגימה האוטומטית ל-4 מעלות צלזיוס. מחממים את העמודה ל-35°C, מה שמפחית את הלחץ הכולל.
    1. הגדר את המתח ב- -150 mV ו- 220 mV עבור האלקטרודות הראשונה והשנייה של הגלאי האלקטרוכימי, בהתאמה. השווה את המערכת לפחות 2 שעות, ובאופן אידיאלי לילה, עם השלב הנייד בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר / דקה.
      הערה: במהלך שיווי המשקל התאים צריכים להיות מופעלים, והקריאה הבסיסית מנוטרת. קריאה יציבה מציינת שהמערכת מוכנה לשימוש. במשך שעתיים של שלב שיווי המשקל, לאפשר לשלב הנייד להיכנס למיכל פסולת במקום לחשב אותו מחדש. לאחר תקופה זו, ניתן למחזר את השלב הנייד בן לילה לשיווי משקל.
    2. לאחר השלמת שיווי המשקל, התאם את קצב זרימת הפאזה הנייד ל- 0.6 מ"ל/דקה. להזריק 20 μl של כל אחד מהסטנדרטים חמש נקודות.
  5. להפשיר דגימות סטריאטליות על קרח, ולהזריק 2 x 20 μl של כל מדגם לתוך מערכת HPLC. השתמש בסטנדרטים בהתחלה ובאופן אקראי לאורך כל קבוצה של דגימות סטריאטליות.
  6. השתמש בתוכנה כדי לנתח את האזור תחת דופמין, DOPAC, פסגות HVA המיוצר על ידי סטנדרטים ודגימות. זהה ניתוח לפי זמן שמירה ומדידה על-ידי השוואת האזור מתחת לשיא לזה של עקומת 5 נקודות עבור התקן המתאים לו.
  7. הכן שבר גלולה כמתואר בסעיף 5.2.3. בצעו בדיקה של חלבון לאורי על גלולת הסטריאטלים. הערה: מבחנה זו תמדוד את כמות החלבון הקיימת בדגימות הסטרייטל במ"ג/מ"ל; מידע זה משמש כדי לקבוע את ריכוז ng/mg של ניתוח.

8. אימונוהיסטוכימיה

  1. שפעת חיסונית כפולה GFAP/TH
    1. הסר צינורות המכילים מידברין חתוכים מ-20°C מקפיא ולהביא RT. הסר מקטעי רקמה המכילים סובסטנציה ניגרה מפתרון cryopreservative במגש המכיל PBS.
    2. מניחים מקטעי רקמה בתוספות פוליסטירן עם תחתיות רשת פוליאסטר לאימונוכימיה צפה בחינם. לשטוף 3 x 5 דקות ב PBS.
    3. מעבירים חלקים לצלחת של 96 באר עם תמיסת בלוק של 180 מיקרול (5% סרום חמור רגיל, 1% PVP, 1% BSA ו-0.3% טריטון X-100 ב-PBS) בכל באר. דגירה 40 דקות ב RT.
      הערה: כל שלבי הכביסה והדגירה מבוצעים בתסיסה קלה על שייקר.
    4. להעביר קטעים בארות המכילות את פתרון הנוגדן העיקרי (180 μl לבאר). דגירה בקוקטייל נוגדנים ראשוני, ארנב אנטי GFAP (1:1000) וכבשים נגד TH (1:400) מדולל ב- PBS עם 1% BSA ו 0.3% TX-100, עבור 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. IgG מהמינים העיקריים משמש כשליטה חיסונית שלילית.
    5. דגירה בקוקטייל נוגדנים משני (1:200 חמור נגד ארנב 568 ו 1:200 FITC חמור אנטי כבשים ב PBS עם 0.1% TX-100). השתמש בנייר כסף כדי להגן על הפתרון מפני אור במהלך הכנה ודגרת; דגירה ב RT במשך 2 שעות.
      1. לשליטה שלילית, מדגרים חלקים ב- IgG מהמינים העיקריים מדוללים לאותו ריכוז המשמש לנוגדנים העיקריים.
      2. לשטוף 2 x PBS ו 1 x TS במשך 5 דקות כל אחד ב RT. הר מקטעי רקמה על בתוספת שקופיות בינוני הרכבה עם כתם Hoechst ו coverslip.
    6. דגירה בקוקטייל נוגדנים משני (1:200 חמור נגד ארנב 568 ו 1:200 FITC חמור אנטי כבשים ב PBS עם 0.1% TX-100). השתמש בנייר כסף כדי להגן על הפתרון מפני אור במהלך הכנה ודגרת; דגירה ב RT במשך 2 שעות.
    7. לשטוף 2 x PBS ו 1 x TS במשך 5 דקות כל אחד ב RT. הר מקטעי רקמה על בתוספת שקופיות בינוני הרכבה עם כתם Hoechst ו coverslip.
    8. הגן על שקופיות מפני אור וחמצון עד להדמיה על-ידי אחסון בתיבת שקופית ב- 4°C.
    9. לנתח את הפקד השלילי הראשון כדי לקבוע את רמת הרקע של פלואורסצנטיות, ולאחר מכן להעריך עבור אימונואקטיביות חיובית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
  2. אימונוהיסטוכימיה Iba1 עם משקעים כרומגן
    1. הסר צינורות המכילים מידברין חתוכים מ-20°C מקפיא ולהביא RT. הסר מקטעי רקמה המכילים סובסטנציה ניגרה מפתרון cryopreservative במגש המכיל PBS.
    2. מקם מקטעי רקמה בתוספות פוליסטירן לאימונוכימיה צפה חופשית. לשטוף חלקים 3 x 5 דקות PBS, ומניחים קטעים ישירות לתוך צלחת 12-באר המכיל מחומם מראש 10 מ"מ חומצת לימון monohydrate, pH 9.0, 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, לאחזור אפיטופ.
    3. צלחת מגניבה 20 דקות ב RT. החזר קטעים כדי מוסיף ולשטוף 3 x 5 דקות ב PBS.
    4. מעבירים חלקים לצלחת של 96 באר המכילה תמיסת חסימה של 180 מיקרול (10% סרום עיזים רגיל, 1% BSA ב-PBS) לבאר, והדגירה 40 דקות ב-RT.
    5. להעביר קטעים בארות המכילות נוגדן ראשוני מדולל 180-μl (1:1000 ב 1% BSA-PBS). דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    6. העבר מקטעים להוספות. לשטוף 3 x 5 דקות PBS ולהחיל נוגדן משני biotinylated (1:200 ב 1.5% נורמלי סרום-PBS) עבור 1 שעה ב RT.
    7. הכן פתרון ABC 30 דקות לפני השימוש. לשטוף 3 x 5 דקות PBS ולהעביר לפתרון ABC עבור 1 שעה ב RT.
    8. הכן פתרון DAB בשכונה. לשטוף 2x 5 דקות PBS ו 1x 5 דקות ב TS, ולהדגיר חלקים DAB.
      1. לפתח במשך 3-4 דקות. שליטה שלילית צריכה להישאר בהירה בצבע.
        הערה: בצע שלב זה מכסה המנוע אדים כמו DAB הוא מסרטן ידוע. פתרון של 0.2M אשלגן פרמנגנט ב ddH2O לטיהור צריך להישמר בסמיכות במקרה של טפטופים מקריים.
    9. יש לשטוף חלקים לזמן קצר ב- ddH2O ולאחר מכן ב- TS 3 x 5 דקות. הר קטעים על מגלשות בתוספת אוויר יבש לילה במכסה המנוע אדים.
    10. Decontaminate פסולת DAB עם נפח שווה של 0.2M אשלגן פרמנגנט ב ddH2O, מערבולת, דגירה במכסה המנוע אדים לילה לפני אחסון בפח פסולת DAB שכותרתו כראוי מכסה המנוע אדים.
      הערה: פתרון אקונומיקה אינו מבטל את המאפיינים המוטאגניים של DAB.
      1. נקו פריטים לשימוש חוזר (כלומר מוסיף פוליסטירן) ושטפו עם חומר ניקוי.
    11. להתייבש / נגד כתם קלות עם סגול Cresyl (CV). כל שלבי התייבשות/שטיפה הם 3 דקות: אתנול 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 שניות), ddH20 x 2, 95% אתנול + חומצה אצטית קרחונית (0.1%) x 2, 100% אתנול, וקסילין.
    12. מכסה ב distyrene-טולואן-xylene הרכבה בינונית ויבשה במכסה המנוע אדים.
    13. שים לב לאימונואקטיביות חיובית על ידי מיקרוסקופ אור. IgG מהמינים העיקריים משמש כשליטה חיסונית שלילית.

9. סטטיסטיקה

  1. להעריך את ההבדלים בין האמצעים על ידי ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) כדי להשוות הבדלים בין גנוטיפ על ידי ANOVA דו כיווני להשוות הבדלים בין גנוטיפ וטיפול רעיל. השתמש בניתוח HSD שלאחר hoc של Tukey כאשר ההבדלים נצפים על ידי בדיקות ANOVA(p≤0.05).
    הערה: ניסויים (עם n = 6-9 עכברים /קבוצה) מבוצעים לפחות פעמיים כדי להבטיח רבייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרדיגמה זו של חשיפה לרעלן יכולה לייצר דלדול דופמין סטריאטלי משמעותי וניתן לגילוי של 20% ב- MPTP לעומת בעלי חיים מוזרקים מלוחים. חשוב לציין כי הרבה MPTP שונים עשויים להניב קצת פחות או יותר נגע; לכן, לדיוק טוב יותר, ניסוי ראשוני בעכברים מסוג בר מומלץ לפני השימוש מהונדסים כאשר הרבה חדש של רעלן עצבי מנוצל. השימוש בנגע קל עד בינוני מאפשר השפעה של transgene להיות שנצפה; נגע חמור עלול ליצור "אפקט רצפה" עם פציעה חזקה מדי כדי להקל או כל כך מזיק כי זה מאפיל על ההשפעה של שינוי גנטי מזיק. ההשפעות של MPTP על דופמין סטריאטלי היו שונות באופן משמעותי בעכברים 5-LOX isozyme לקוי, אבל לא עכברים 12/15-LOX isozyme לקוי (איור 1). יתר על כן, בשיטות אלה, הצלחנו להבחין בהבדל משמעותי ברמות הדופמין בשל מחסור 5-LOX בעכברים שטופלו מלוחים(איור 1).

אימונובלוטינג עבור TH ו- GFAP מותר לאישור של נזק ו neuroinflammation, בהתאמה, ברמה של הסטריאטום בעכברים מסוג בר, אפקט שהצטמצם בסטריאטום 5-LOX isozyme לקוי (איורים 3A ו 3B). הנגע ניכר גם ברמת הסובסטנציה ניגרה(איור 2A ו-2B). באותם עכברים, ניתן לראות את דלדול הנוירונים החיוביים של TH ואימונו-ראקטיביות מוגברת של GFAP באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי בעל תווית כפולה (איור 2A). יתר על כן, הפעלה מיקרוגליאלית גבוהה במידה ניכרת (כלומר אימונו-ראקטיביות של Iba1) בסוג פראי, אך לא חסר איזוזיים של 5-LOX, עכברים ניכרים בסבסטנציה ניגרה בעקבות חשיפה ל- MPTP (איור 2B). לכן, מודל MPTP יכול לספק כלי שימושי כדי להעריך את ההשפעה של נטייה גנטית ניוון nigral ודלקת.

Figure 1
איור 1. LOX isozyme-השפעות סלקטיביות על דופמין סטריאטלי לאחר אתגר MPTP. (א) הומוגנטים סטריאטליים שימשו למדידת דופמין (DA) על ידי HPLC מ WT ו 5-LOX-/- המלטה ניתנו מלוחים או MPTP (n = 6-8 / קבוצה). ‡, מסמן השפעה משמעותית עקב גנוטיפ; p<0.05. *, מסמן השפעה משמעותית עקב גנוטיפ וטיפול; p<0.05. אין הבדל משמעותי עקב הטיפול צוין 5-LOX-/- עכברים (n.s.) המציין כי MPTP לא לייצר דלדול DA striatal בקו מהונדס זה. (ב) הומוגנטים סטריאטליים שימשו למדידת DA ב WT ו 12/15-LOX-/- המלטה ניתנו מלוחים או MPTP (n = 6-9 / קבוצה). לא נצפה הבדל משמעותי ברמות DA עקב גנוטיפ. הפחתה משמעותית, ודומה, עקב טיפול MPTP צוין בשני הגנוטיפים. *, עמ'<0.01. הנתונים מוצגים כ- SEM ± ממוצע.

Figure 2
איור 2. 5-LOX השפעות isozyme על ניגרל TH ו astroglia בעקבות אתגר MPTP. (א) כתמי כשל חיסוני עבור TH (FITC; ירוק) ו- GFAP (568; אדום) immunoreactivities בוצע במקטעי המוח nigral מ WT ו 5-LOX-/- המלטה ניתנו מלוחים או MPTP. פחות גופי תאים חיוביים TH (*) ואימונואקטיביות GFAP משופרת ניכרים בקבוצת WT-MPTP. בר = 25 מיקרומטר. (B) היסטולוגיה אימונוהיסטוכימית עבור איבה-1 על microglia זוהה באמצעות DAB (כרומטגן חום); חלקים היו מוכתמים על ידי קריסיל סגול. סעיפים Nigral מ WT ו 5-LOX-/- המלטה מטופלים עם מלוחים או MPTP הוערכו. Microglia עם גופי תאים פרועים ותהליכי הסתעפות ארוכים נצפים בסובסטיה ניגרה מעכברים שטופלו מלוחים (ראשי חץ). מיקרוגליה פעילה עם גופי תאים מעוגלים ותהליכים קצרים ומעובה, נצפתה בסבסטנציה ניגרה מעכברים שטופלו ב- MPTP (חצים). בר = 10 מיקרומטר.

Figure 3
איור 3. 5-LOX השפעות isozyme על TH סטריאטלי ודלקתי בעקבות עלבון רעיל. (א) רמות החלבון של Striatal TH נמדדו בחצי כמותית על ידי ניתוחי כתמים מערביים של הומוגנט מ- WT ו- 5-LOX-/- המלטה ניתנו מלוחים או MPTP (n = 6-8 / קבוצה). אימונו-ראקטיביות, שנמדדה על ידי צפיפות אופטית, מנורמלת β-אקטין. *, עמ'<0.05. (ב) באופן דומה, GFAP נמדדה באופן חצי כמותי על ידי ניתוחי כתמים מערביים של הומוגנט סטריטל מ- WT ו- 5-LOX-/- littermates שניתנו עם מלוחים או MPTP (n = 6-8 / קבוצה) ונורמלו β-actin. *, עמ'<0.05. הנתונים מצוינים כמשמעותיים ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

העיצוב של מחקר זה אינטראקציה גנים-סביבה אפשר לנו לקבל מידע חדש לגבי האופי הכפול של isozyme 5-LOX במסלול nigrostriatal. על ידי ביצוע HPLC למדידת מונואמינים סטריאטליים לאחר טיפול מלוחים או MPTP בחומרים מהונדסים חסרים isozyme 5-LOX ואת המלטה שלהם סוג פראי, הצלחנו לציין כי המחסור שלה נראה מגן בתנאים רעילים (איור 1), אבל בתנאים רגילים, חוסר האנזים מפחית את רמות הדופאמין striatal ועלול להיות מזיק. לכן, אנו מסוגלים להוכיח כי 5-LOX isozyme תורם הטון דופאמין סטריאטלי בתנאים רגילים, אבל יכול לתרום נזק בעקבות אתגררעילים 4.

בעוד הערכה נוספת צריכה להשאיל תובנות מכניות חדשניות על תפקידם של ISOZYmes LOX רעילות nigrostriatal, ניתוחים כתם מערבי (איור 3) כמו גם מחקרים אימונוהיסטוכימיים (איור 2) גילה כי סמני גירוי עצבי היו, לפחות בחלקו, מוחלש ב 5-LOX isozyme לקוי cohort נחשף MPTP. ממצאים אלה, תוך שימוש בטכניקות ביוכימיות והיסטולוגיות קלאסיות, מצביעים על תפקיד קריטי של מוצרי 5-LOX ב potentiation של הפעלת מיקרו ואסטרו-גליה4.

בהתאם לאינטראקציה בין גנים לסביבה שנחקרה, ניתן לנתח קריאות פתולוגיות בנוסף להפעלת גליה. חשיבות מיוחדת PD הוא אובדן של נוירונים דופאמין הסובסטנציה ניגרה הצטברות פתולוגית פוטנציאלית וצבירה של α-סינוקלאין. לאורך קו זה, ההשפעה של חשיפה רעילים בעכברים מהונדסים עם α-סינוקלאין overexpression כבר במעקב על ידי הערכה של מוות תאי ניגרל(כלומר באמצעות ספירת תאים סטריאולוגיים משוחדים) ותצהיר α-synucleinמסיסים 32-35.

מינון ה-MPTP המשמש בפרדיגמה המתוארת כאן מייצר נגע קל עם פגיעה סטריאטלית צנועה אך משמעותית (איור 1)והפעלת גליה הן בסטריאטום והן בסבסטנציה ניגרה(איורים 2 ו-3). בדרך כלל, מינונים גבוהים יותר של רעילים משמשים כדי לייצר אובדן תאים דופאמין ניגרל חזק דלדול דופמין סטריאטלי23,24,32,36-38,39. חשוב לציין כי רעילות של MPTP יכול להשתנות בין ספקים והרבה; כתוצאה מכך מינונים ייתכן שיהיה צורך להתאים כדי לייצר את הנגע הרצוי. יתר על כן, גורמים אחרים אשר יש לקחת בחשבון הם המתח ואת המין של בעלי חיים מנוצל למחקרים. רגישות סלקטיבית לנוירו-רעלן הוכח בזני רקע שונים של עכברים, תופעה שנבעה, לפחות בחלקה, מהבדלים בהפעלת מסלולים תת-תאיים המתווכים ניוון, כולל JNK ו- c-Jun36-39. הבדלים תלויי מין רעילות MPTP דווחו גם40,41, ועשויים לתרום שונות במחקרים באמצעות עכברים מהונדסים שבו שני המינים משמשים קווי רבייה עניים. במקרה כזה, השימוש בפקדי wildtype תואמי מין הוא קריטי4. השפעות הקשורות למין כאלה עשויות להסביר את ההבדל בנגע שנצפה בעכברי WT בין ניסויים הבודקים את ההשפעה של עכברים לקויי 5 ו-12/15-LOX שבהם נעשה שימוש במין אחד לשורה אחת ושני המינים עבור השני (איור 1). עבור מחקרי אינטראקציה בין גנים לסביבה, אתגר MPTP המייצר פגיעה חמורה (למשל >80% ירידה דופמין סטריאטלי) אינו מומלץ כמו זה עשוי להסוות השפעה גנטית אפשרית.

בעוד חשיפה MPTP מייצרת מוות תאי ניגרל3,42, דלדול דופמין סטריאטלי3, מורכב אני עיכוב43-45, והפעלת גליה46,47 שדווחו ב PD אנושי, בעכבר, ניוון פרוגרסיבי לאט שמייצר פרקינסון יציב(כלומר גירעונות מוטוריים) ופרנק α-סינוקלאין פתולוגיה(כלומר גופי Lewy ו neurites) לחלוטין recapitulating תכונות סימן ההיכר של המחלה אינה מתרחשת במודל. עם זאת, חשוב לציין כי עכבר MPTP מילא תפקיד קריטי בהבנת מסלולים תת-תאיים התורמים לניוון עצבי הקשור ל- PD. וריאציה בפרדיגמות חשיפה, למשל, חשפה הפעלה של מנגנונים שונים של רעילות: מינון נמוך, חשיפה subacute מקדם מוות תא אפופטוטי48 עם תגובה חיסונית מוגבלת49 ואילו טיפול אקוטי עם מינונים גבוהים יותר מייצר הפעלה microglial מסומן50. אכן, גורמים כאלה צריכים להילקח בחשבון בעת ניצול המודל ללימודי יעילות, רלוונטי למחקר הנוכחי, כדי לחשוף את ההשפעה של גורם סיכון גנטי פוטנציאלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIGMS 056062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01 counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt 7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

Tags

רפואה בעיה 83 MPTP דופמין Iba1 TH GFAP lipoxygenase מהונדס אינטראקציות סביבה גנטית עכבר מחלת פרקינסון ניוון עצבי נוירו-אינפלציה
מודלים לאינטראקציה בין סביבת גנים כדי לחשוף מנגנוני רגישות במחלת פרקינסון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R.,… More

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter