Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Gene-miljø Interaktion Modeller til unmask modtagelighed mekanismer i Parkinsons sygdom

Published: January 7, 2014 doi: 10.3791/50960
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

Summary

Lipoxygenase (LOX) isozymer kan generere produkter, der kan øge eller mindske neuroinflammation og neurodegeneration. En interaktionsundersøgelse mellem gen og miljø kunne identificere LOX isozymspecifikke virkninger. Ved hjælp af 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) model af nigrostriatal skader i to LOX isozym-mangelfulde transgene linjer giver mulighed for sammenligning af bidraget fra LOX isozymer på dopaminergisk integritet og inflammation.

Abstract

Lipoxygenase (LOX) aktivitet har været impliceret i neurodegenerative lidelser såsom Alzheimers sygdom, men dens virkninger i Parkinsons sygdom (PD) patogenese er mindre forstået. Gen-miljø interaktion modeller har nytte i afmaskering virkningen af specifikke cellulære veje i toksicitet, som ikke kan observeres ved hjælp af en udelukkende genetisk eller toksikant sygdom model alene. For at vurdere, om forskellige LOX-isozymer selektivt bidrager til PD-relateret neurodegeneration, kan transgene (dvs. 5-LOX og 12/15-LOX mangelfulde) mus udfordres med et toksin, der efterligner celleskade og død i lidelsen. Her beskriver vi brugen af et neurotoksin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), som producerer en nigrostriatal læsion for at belyse de forskellige bidrag fra LOX-isozymer til neurodegeneration relateret til PD. Brugen af MPTP i mus, og nonhuman primat, er veletableret til at opsummere nigrostriatal skader i PD. Omfanget af MPTP-induceret læsionering måles ved HPLC-analyse af dopamin og dets metabolitter og semi-kvantitativ western blot-analyse af striatum for tyrosinhydrafylase (TH), det hastighedsbegrænsende enzym til syntese af dopamin. For at vurdere inflammatoriske markører, som kan påvise LOX isozym-selektiv følsomhed, udføres glial fibrillary acidic protein (GFAP) og Iba-1 immunohistochemistry på hjernesektioner, der indeholder substantia nigra, og GFAP Western blot analyse udføres på striatal homogenater. Denne eksperimentelle tilgang kan give ny indsigt i gen-miljø interaktioner underliggende nigrostriatal degeneration og PD.

Introduction

Brug af gen-miljø interaktion modeller giver en tilgang til at efterligne risikofaktorer, der sandsynligvis påvirker idiopatisk Parkinsons sygdom (PD) og giver mulighed for at skelne mekanistiske indsigter, der er usandsynligt, at blive belyst ved brug af en genetisk eller toksikant system alene1,2. Her illustrerer vi dette punkt og beskriver anvendelsen af 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) musemodel af nigrostriatal degeneration3 for bedre at forstå selektiviteten af lipoxygenase (LOX) isozymaktivitet på neuroinflammation ogtoksicitet 4. Mens en rolle for LOX isozymer er blevet bredt evalueret i perifere lidelser5,6 samt CNS sygdom, herunder slagtilfælde7 og Alzheimers sygdom8,9, den rolle, som familien af isozymer i nigrostriatal funktion og degeneration relateret til PD er ikke godt forstået og berettiger undersøgelse. MPTP neurotoksin demonstrerer præference degeneration af nigrostriatal vej og opsummerer striatal dopamin udtømning og nigral dopaminergiske celle tab, der ligger til grund motoriske funktionsnedsættelser i PD patienter10. Selv om denne model ikke gengiver den fulde cadre af nonmotoriske og motor pd adfærd og ærlig α-synuclein-positive Lewy krop patologi, det har været nyttigt at belyse nye mekanistiske mål, der bidrager til nigrostriatal skade og til tidlig oversættelsestest, da det er den bedst karakteriserede ikke-invasive model til rådighed til pålideligt at producere nigral celledød ledsaget af striatal dopamintab11-15. Bred brug af MPTP-musen, med paradigmer lige fra akut, subakut til kronisk16-18, har gjort det muligt for standardisering af dosering at resultere i mild til alvorlig nigrostriatal skade19,20 med aktivering af forskellige toksicitetsmekanismer afhængigt af behandlingsregimet18,21,22. Dette gør det derfor muligt at målrette et »læsionsvindue«, der kan resultere i øget eller reduceret nigrostriatal skade afhængigt af det terapeutiske middel eller den transgene model, der anvendes23-25.

Også afgørende for translationelle og opdagelse biologi undersøgelser er de teknikker, der anvendes til at vurdere skader og den dokumentation, sådanne metoder giver. For MPTP-musemodellen er etablerede målinger til vurdering af læsionering måling af markører for striatal dopaminergisk tone, herunder dopamin og dets metabolitter af HPLC, og vestlig blotanalyse af tyrosinhydroxylase (TH), det hastighedsbegrænsende enzym i dopaminsyntese og indikatorer for degenerative hændelser såsom glialaktivering ved hjælp af vestlig blot western analyse og immunohistochemistry4. Selv om disse er klassiske neurokemiske, biokemiske og histologiske procedurer, giver teknikkerne kritiske og reproducerbare udlæsninger om omfanget af skader inden for den nigrostriatale dopaminergiske vej, indikerer toksicitetsmekanismer og har vist sig at være værdifulde værktøjer til at forstå degenerative begivenheder i PD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Alle dyreforsøg og dyreplejemetoder bør godkendes af institutionens institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg (IACUC). Den her beskrevne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra SRI Internationals IACUC.

1. Erhvervelse og vedligeholdelse af LOX-mangelfulde mus

  1. Køb 5-LOX-mangelfulde eller 12/15-LOX-mangelfulde mus og respektive stamme- og sexmatchede kontroller i en alder af 7-8 uger og giv flere dage til akklimatisering til faciliteten efter ankomsten.
  2. Vedligehold mus i gruppehus på en 12-timers lys-mørk cyklus og giv mad og drikkevand ad libitum.

2. MPTP-forholdsregler, opbevaring, forberedelse, dekontaminering og bortskaffelse

Bemærk: MPTP-forgiftning fra intravenøs eksponering hos mennesker har vist sig at forårsage parkinsonisme10; MPTP er meget lipofil og kan let krydse blod-hjerne barrieren26. Der bør træffes forebyggende foranstaltninger for at sikre sikker håndtering, afgiftning og bortskaffelse. Dens stofskifte indebærer flere trin, herunder konvertering til 1-methyl-4-phenyl-2,3-dihydropyridinium af enzymet monoaminoxidase B (MAO-B)27. MAO-B-hæmmere kan anvendes i tilfælde af utilsigtet menneskelig forgiftning.

  1. Sørg for, at personalet har passende sikkerheds- og håndteringstræning, før de bruger MPTP som dikteret af institutionens sundheds- og sikkerhedsudvalg. Hver institution kan fastlægge og gennemføre sine egne standardprocedurer for brug af MPTP på grundlag af anbefalinger , der er udførligt skitseret i litteraturen17,22.
  2. Før tilberedningen skal der medbringes passende personlige værnemidler (PPE), herunder følgende: engangslaboratorie eller fuldkropsdragt, dobbeltnitrilhandsker, kirurgisk maske, hårdæksel, sikkerhedsbriller og engangsskobetræk. Der skal bæres korrekt PV under forberedelsen af MPTP, injektionsparadigmet og 72 timer efter injektionen ved håndtering af dyr og/eller strøelse.
  3. Udfør beregninger før forberedelse. De institutionelle retningslinjer for dosering af volumener bør følges. levering af 100-150 μl anvendes typisk til 25-30 g mus.
    1. For at forberede en 3 mg/ml MPTP-opløsning i saltvand skal der anvendes en korrektionsfaktor (1.211 MPTP-HCl: 1,0 MPTP-fri base); koncentrationen af MPTP-HCl i saltvandskøretøjet er 3,633 mg/ml.
    2. Forbered alt udstyr, forsyninger og reagenser, der er nødvendige for MPTP-forberedelse og potentiel udslipsdekontaminering, inden neurotoksinet håndteres.
  4. Fjern MPTP-HCl-kildeglas fra den korrekte lagerplacering.
    Bemærk: MPTP skal vedligeholdes på RT i et lukket hætteglas i en sekundær beholder og opbevares i et låst kabinet med navnet "MPTP".
    1. Dæk området omkring skalaer med puder eller papirhåndklæder dæmpet med 10% blegemiddelopløsning for at reducere risikoen fra spildt pulver. Hold væv og 10% blegemiddelopløsning i nærheden som en sikkerhedsforanstaltning.
    2. Ved hjælp af en analytisk balance placeret i en røghætte, vejer 50 mg MPTP-HCl i glas hætteglas med sekundær indeslutning indeholder 10% blegemiddel-gennemblødt væv. Mærk glasglasset "MPTP" med koncentration og dato.
    3. Luk kildeglas og tør ydersiden med 10% blegemiddel.
  5. Tilsæt langsomt 13,763 ml steril saltvand til hætteglas og luk helt til blanding. (Løsningen er 3,633 mg/ml MPTP-HCl).
    1. I emhætten steriliseres MPTP-opløsningen omhyggeligt ved filtrering ved hjælp af et 0,22 μm filter i mærket injektionsglas i en sekundær beholder med 10% blegemiddel-gennemblødt væv. Rengør spild med blegemiddel-gennemblødt væv.
    2. Forsigtigt bortskaffes skarpe og hætteglas i korrekt mærket biohazard beholder. Hold MPTP-opløsningen i hætteglasset i den sekundære beholder med blegemiddel-gennemblødt væv til transport til dyret procedurerum.
      Bemærk: Autoklave MPTP-opløsning til sterilisering, da dens fordampning er en indåndingsfare.
  6. Returner MPTP-kildeglasset til den sekundære beholder, og placer det på lagerplaceringen. Dekontaminere spatel, analytisk skala og hætte overflade i 10 min ved hjælp af 10% blegemiddel.

3. MPTP-administration

  1. Forbered engangsbure med standardmikroisolatorperforerede låg, der indeholder polyesterfiltrerede foringer mærket "MPTP" (minus trådfødegrill), engangsburforinger, forgånede fødevarepiller og hydrogel som vandkilde. Afveje alle dyr og registrere volumen på 3 mg/ml MPTP i saltvand, der kræves til 15 mg/kg injektion.
    Bemærk: MPTP-metabolitter kan påvises i ekskrementer i 3 dage efterinjektionen 28,29; mus udskiller dog MPTP n-oxid, et ikke-giftigt derivat, der ikke krydser membraner på grund af dets hydrofilicitet30.
    1. Iført alle de ovennævnte PERSONLIGE VÆRNEmidler og ved at holde mus over en engangsabsorptionspude injiceres saltvandskøretøjet eller MPTP-opløsningen til 15 mg/kg-dosis i intraperitonealhulen (i.p.) dagligt i 4 dage med en engangs tuberkulinsprøjte med 26 sporvidde.
    2. Opsummer ikke sprøjten efter brug. bortskaffes i en dedikeret og mærket MPTP biofarlig skarpe beholder. Vedligehold 10% blegemiddel og væv i nærheden for at rense eventuelle utilsigtede drypper.
  2. Placer dyr injiceret med MPTP i engangsbure, op til 5 mus pr. Bur, og hus på åbne stativer. Brug ikke ventilerede stativer.
    1. Placer MPTP brug plakater på rack, der indeholder mus og bolig værelse dør indtil 72 timer efter sidste injektion.
      Bemærk: Sørg for, at temperaturen i staldlokalet er mellem 22,2 og 24,4oC, da mus oplever forbigående hypotermi op til 12 timer efter MPTP-forgiftning. 31 år
    2. Dekontaminere arbejdsfladen med blegemiddel efter hver brug (se trin 2.8), bortskaffe sidesten MPTP-opløsning ved tilsætning af et volumen svarende til 10% blegemiddel, og kassér indhold som biofarligt flydende affald.
    3. Kassér alle brugte PERSONLIGE VÆRNEmidler i en dedikeret bortskaffelsesbeholder. Hvis det er nødvendigt, spray med 10% blegemiddel før bortskaffelse.
  3. Kontroller dyrene regelmæssigt, og opdater føde- og vandkilden dagligt under injektionsparadigmet og 72 timer efter den sidste injektion. Bemærk: Selv om der ikke forventes kontaminering i området umiddelbart omkring ydersiden af buret, behandles denne region med blegemiddelopløsningen som en sikkerhedsforanstaltning (som beskrevet i trin 2.8). Vær forsigtig, når du håndterer alle mus og udstyr i denne periode.
    1. Tre dage efter den sidste injektion, bortskaffe alle bure og liners i passende mærket biohazard taske. Genoptage brugen af almindeligt PV og normalt opstaldning for dyr fjerne dør- og hyldeskilte.

4. Høst af væv

  1. Aflive dyr ved livmoderhalskræft dislokation 7 dage efter den sidste MPTP injektion. Disseker straks hjernen på is ved hjælp af forkølet hjerneform med 1 mm slots i koronaplanet.
  2. Disseker striatum fra en forhjernen skive 2-mm tyk på niveau med den forreste commissure.
    1. Fjern omkringliggende kortikale og subkortikale områder ved hjælp af en skalpel. Snap-fryse striatal væv fra hver halvkugle i en separat 1,5-ml mikrocentrifuge rør til neurokemisk eller biokemisk analyse.
  3. Bloker midbrain/hindbrain i koronarplanet på niveau med forreste hypothalamus og nedsænkningsfikseringsvæv i 4% formaldehyd vandig opløsning.

5. Vævsbehandling

  1. Proces for biokemi
    1. Homogenisere striatalvæv fra en halvkugle ved hjælp af en ultralydscelleforstyrrende i 200-μL Tris-EDTA lysis buffer (25mM Tris base, 1mM EDTA, 1:100 protease og fosfatase hæmmer cocktails) for 10 impulser ved 10-12 Hz og centrifuged i 10 min ved 4oC ved 1000xg.
    2. Aspirer forsigtigt supernatanten, og rekonstruer pellet i 150-μl lysis buffer. Fraktioner bruges til biokemisk analyse af SDS-PAGE og vestlig blotting.
      Bemærk: Brug protease- og fosfatasehæmmerholdig buffer inden for 1 time efter præparatet på grund af ustabilitet i vandige opløsninger.
  2. Proces for neurokemi
    1. Udnyt striatum dissekeret fra en anden halvkugle fra hver prøve, der opbevares ved -80 °C for HPLC. Tø striatalvæv i mikrofugerør på is tilsættes 500-μl 0,3N perchlorsyre (PCA) og homogeniseres ved hjælp af sonicator.
      Bemærk: For at fremstille 100 ml 0,3N PCA skal der måles 90 ml ddH2O, tilsættes til en 100 ml gradueret cylinder, tilsættes 2,58 ml 70% PCA og bringes til 100 ml mærke. Denne prøvebuffer kan opbevares ved 4°C i op til en måned.
    2. Sonicate striatal væv i 500-μl iskold 0,3N PCA, for 10 impulser ved 10-12 Hz og sted på is. For at sikre homogenitet, sonikere prøver en anden gang i 10 sek, derefter centrifuge i 12 min ved 4oC ved 16.100xg.
    3. Dekanter straks supernatant til 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 °C. Lufttørre pellet fraktion i hætten.
    4. Supernatanten opbevares ved -80°C, indtil det anvendes til måling af dopamin og dets metabolitter, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) og homovanillsyre (HVA) af HPLC med elektrokemisk detektion.
    5. Når pelletfraktionen er tør, rekonstitueres den i 0,5N NaOH (500 μL) og sonicate kortvarigt. Opbevar rekonstitueret pelletfraktion ved 4 °C, indtil det anvendes til bestemmelse af det samlede protein ved hjælp af Lowry-metoden.
  3. Proces for immunhistokemi
    1. Nedsænknings-fix mellem- og baghjerneblokke natten over i 4% formaldehyd vandig opløsning og kryobeskyttet i graduerede saccharoseopløsninger (10% i fosfatbufferet saltvand (0,01 M PBS; 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl, og ddH2O, pH 7,4) i 24 timer, derefter 30% i PBS, indtil vævet synker) ved 4 ° C. Kort skamplet kryobeskyttede blokke for at fjerne overskydende saccharoseopløsning, fryse på tøris og opbevares ved -80 °C indtil brug.
    2. Mikrotome opdeling af hjerneblokke, der indeholder mellem- og baghjerne i en kryostat.
      1. Fjern væv fra -80 °C, ekvilibrere ved -16 °C i 1 time i kryostat, og montere i væv indlejring medier.
      2. Koronasektioner med en tykkelse på 40-μ m i kryoprotectantopløsning (0,01 M PBS med 30% saccharose, 30% ethylenglycol, pH 7,4) ved -16°C. Opsamling af væv serielt i 6 1,5 ml mikrocentrifugerør med 240-um intervaller og opbevares ved -20 °C.

6. Immunoblotting

  1. Proteinkoncentrationen i striatal supernatantfraktion (tilberedt som beskrevet i punkt 5.1) bestemmes ved BCA-analyse.
  2. Der skal beregnes fortynding, for at hver prøve kan give 10 μg pr. godt leveret i 20 μl volumen.
  3. Supernatantprotein fortyndes med 4X Laemmli buffer og homogeniseringsbuffer for at give 10 μg protein i 1X Laemmli bufferopløsning. Eksempel på beregning:
    1. Bestem den endelige koncentration af protein og volumen, der kræves. I dette tilfælde kræves 10 μg i 20 μl (0,5 mg/ml).
    2. Bestem det endelige volumen af den nødvendige proteinopløsning. Selv om der kræves 20 μl til lastning, skal der fremstilles ekstra volumen (30 μl).
    3. Da det endelige volumen og koncentrationen er kendt, og koncentrationen af proteinet supernatant fraktion er kendt (bestemt af BCA assay), beregne mængden af protein supernatant kræves ved hjælp af ligningen:
      Vsupernatant = (Vfinal x Cendelig)/C supernatant
      For en supernatant proteinkoncentration på 1,5 mg/ml
      Vsupernatant = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      Vsupernatant = 10 μl
    4. Der beregnes en mængde på 4X Laemmli-buffer, der kræves for at give en koncentration på 1x i 30 μl volumen (30 μl / 4 = 7,5 μl). Bemærk: 4X Laemmli-bufferen skal fortyndes til 1X styrke i prøveforberedelsen.
    5. Den mængde homogeniseringsbuffer, der kræves for at bringe volumen til 30 μl (og opnå den ønskede endelige proteinkoncentration på 0,5 mg/ml) beregnes:
    6. Prøven fremstilles ved hvirvelstrøm og derefter pipetter 10 μl proteinproteinprotein i 12,5 μl homogeniseringsbuffer. Der tilsættes 7,5 μl 4X Laemmli-buffer til en arbejdsopløsning med 30 μl prøve og en koncentration på 0,5 mg/ml.
  4. Forbered alle prøver ved hjælp af beskrevne procedurer, vortex og kog i 5 min.
    Bemærk: Brug skrue-top mikrocentrifuge rør for at forhindre lækage og åbning på grund af tryk under kogning.
  5. Efter 5 minutter skal du straks placere på is. 20 μl prøveopløsning pr. gelbrønd (10 μg protein) indlæses. Adskil proteinprøver med SDS-PAGE på en 12% Tris-glycin gel.
    1. Brug en forfarvet proteinstige til bekræftelse af molekylvægte. Løbebuffer er 25 mM Tris-base, 192 mM glycin, 0,1% SDS og ddH2O, pH 8,3.
    2. Separate proteiner ved elektroforese: Kør ved 80 V for at rydde brøndene (10 min) og 125 V (ca. 1 time; indtil proteinstigen er fuldt adskilt) for at løse proteinerne.
  6. Der udføres overførsel af protein til nitrocellulose ved hjælp af 0,2 μm nitrocellulosemembran i Tris-glycinoverførselsbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,04% SDS, 20% methanol og ddH2O, pH 8,3) natten over i 40 V ved 4 °C.
  7. Vask nitrocellulosepletter i 1x Tris saltvand (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl i ddH2O, pH 7,4) i 10 min ved RT. incubat i Ponceau S i 5 min derefter skylles i ddH2O for at give en grov kontrol af tilsvarende proteinbelastning. Scan billede for at bevare rekord for bærbare pc'er og destain ved hjælp af PBS.
    Bemærk: Alternativt vaskes skamplet i Milli-Q eller ddH2O indeholdende HCl (0,2%) i ca. 5 min. Søg efter rekord. Tag Ponceau S-pletten ud af membranen ved efterfølgende inkubationstrin (dvs. sted i blokeringsbufferen).
  8. Blokpletter i 5% fedtfrit mælkepulver i TS i 1 time ved RT og inkuber 24 timer ved 4ºC med kanin anti-tyrosin hydroxylase (1:1000),anti-β-actin (1:200); anti-GFAP (1:1000) i 5% mælk-TS.
  9. Vask blots 3 x 5 min i TS med 0,05% Tween-20 og 1 x 5 min i TS, derefter inkuberes i HRP-konjugeret sekundært antistof (1:5000 i TS indeholder 5% mælk), matchet til arten af den primære, for 2 timer ved RT.
  10. Forbered chemiluminescent substrat ved hjælp af lige store mængder luminol og peroxid løsninger og anvende i 1-3 min. I et mørkekammer skal du placere blot i et plastikærme til filmeksponering og udsætte for film; film udvikles derefter ved hjælp af en automatisk processor.
  11. Strip blots med kommercielt tilgængelige stripning buffer ved 37 ° C i 30 min, vask 3x 10 min i TS med 0,05% Tween-20, og 1x 10 min i TS og derefter reprobe for lastning kontrol eller andet protein af interesse.
  12. Kvantificere signalerne fra Image J-software til optiske tæthedsmålinger og normalisere til den interne indlæsningskontrol β-actin.

7. Neurokemi

  1. Væv til analyse fremstilles som beskrevet ovenfor i punkt 5.2. Se tabel 1 for mobil fase opskrift.
    Bemærk: Alle reagenser skal være ≥99,0% rene og af HPLC-kvalitet. Sørg for bufferintegritet med rene, dedikerede glasvarer og rørestænger. Mobil fasebuffer skal udnyttes inden for syv dage efter forberedelsen.
    1. Dihydrogenphosphat og citronsyre afvejes, tilsættes 1 L ddH2O og blandes i en 2-L gradueret cylinder. Opløsningen filtreres gennem en 0,22-μm GSTF-membran.
      Bemærk: Dette maksimerer udvindingen af forurenende stoffer i fosfat og citronsyre, hvilket hjælper med at minimere baggrundsstrømme.
    2. Tilsæt OSA efterfulgt af acetonitrile og EDTA løsning. Hplc-kvalitet ddH2O til ca. 1900 ml, inden pH-afdelingen justeres til 3,0 med fosforsyre.
    3. Tilsæt HPLC-klasse ddH2O til 2-L-mærket, og hæld derefter i en 2-L kolbe. Tilsæt en dedikeret rørestang, og afgas den mobile fase ved at omrøre den under vakuum i > 10 minutter.
  2. Forbered standarderne for dopamin, og DOPAC og HVA for standard kurver. Stamopløsninger af standarder fremstilles ved 1 mg/ml i 0,3 N PCA.
    1. Der afvejes 12,4 mg dopamin-HCl, og der tilsættes 10,0 ml 0,3 N PCA for at fremstille 1 mg/ml dopamin.
    2. Der afvejes 10,0 mg DOPAC, og der tilsættes 10,0 ml 0,3 N PCA for at fremstille 1 mg/ml DOPAC.
    3. Der afvejes 10,0 mg HVA, og der tilsættes 10,0 ml 0,3 N PCA for at fremstille 1 mg/ml HVA.
  3. Forbered standardløsninger fra lagerløsningerne. Fempunktsstandarder bruges til at generere en koncentrationskurve.
    1. Til måling af striatal dopamin fremstilles standardkoncentrationer på 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml og 200 ng/ml.
    2. For striatal DOPAC fremstilles standardkoncentrationer på 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml og 40 ng/ml.
    3. For striatal HVA fremstilles standardkoncentrationer på 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml og 80 ng/ml.
    4. Der må frembringes fempunktsstandarder: 1 mg/ml dopaminbestandopløsning fortyndes til 5 μg/ml ved hjælp af 0,3N PCA. 1 mg/ml DOPAC-stamopløsning fortyndes til 1 μg/ml ved hjælp af 0,3N PCA, og der fortyndes 1 mg/ml HVA-stamopløsning til 2 μg/ml ved hjælp af 0,3N PCA.
    5. Der overføres 1 ml μg/ml dopamin, 1 ml 1 μg/ml DOPAC og 1 ml 2 μg/ml HVA i en 25 ml målekolbe, og volumen til 25 ml mærke med 0,3 N PCA.
      Bemærk: De blandede standarder i målekolben indeholder den højeste koncentration af fempunktsstandarderne: 200 ng/ml dopamin, 40 ng/ml DOPAC og 80 ng/ml HVA.
    6. 1 ml af de blandede standarder overføres til rene 1,5 ml mikrocentrifugerør. Udfør 1:1 seriel fortynding fire gange for at generere de efterfølgende firepunktsstandarder.
      1. F.eks. tilsættes 250 μl af de blandede standarder 250 μl prøvebuffer og vortex grundigt for at producere blandede standarder ved 50% af de oprindelige koncentrationer; gentage processen, indtil de ønskede fortyndinger er opnået.
  4. Forbered HPLC-systemet (pumpe, autosampler, kolonne i omvendt fase (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). Rens pumpen med frisk mobil fase for at erstatte alle tidligere løsninger i HPLC-systemet og fanget luftbobler med frisk mobil fase. Afkøl autosampleren til 4°C. Varm kolonnen til 35 °C, hvilket reducerer det samlede tryk.
    1. Indstil spændingen til henholdsvis -150 mV og 220 mV for den første og anden elektroder i den elektrokemiske detektor. Ekvilibrere systemet i mindst 2 timer og ideelt natten over med den mobile fase med en strømningshastighed på 0,2 ml/min.
      Bemærk: Under ækvilibreringen skal cellerne være tændt, og basisaflæsningen skal overvåges. Stabil aflæsning indikerer, at systemet er klar til brug. I de to timer af ækvilibreringsfasen skal den mobile fase gå ind i en affaldsbeholder i stedet for at recirkulere den. Efter denne periode kan den mobile fase genbruges natten over til ekvilibrering.
    2. Når ækvilibreringen er afsluttet, justeres den mobile fasestrømshastighed til 0,6 ml/min. Der injiceres 20 μl af hver af fempunktsstandarderne.
  5. Striatale prøver optøs på is, og der indsprøjtes 2 x 20 μl af hver prøve i HPLC-systemet. Udnyt standarder i begyndelsen og tilfældigt i hvert sæt striatale prøver.
  6. Brug softwaren til at analysere området under dopamin, DOPAC og HVA toppe produceret af standarder og prøver. Identificer analysater efter retentionstid og mål ved at sammenligne det område, der er myldret, med 5-punktskurven for den tilsvarende standard.
  7. Pelletfraktionen fremstilles som beskrevet i punkt 5.2.3. Udfør en Lowry proteinanalyse på striatal pellet. Bemærk: Denne analyse vil måle mængden af protein, der er til stede i striatalprøverne i mg/ml; disse oplysninger anvendes til bestemmelse af analysandkoncentrationen.

8. Immunohistochemistry

  1. GFAP/TH dobbelt immunfluorescens
    1. Fjern rør, der indeholder sektionsopdelt mellemhjern fra -20°C fryser, og bring vævssektioner, der indeholder substantia nigra, ud af kryopræserveringsopløsningen i en bakke, der indeholder PBS.
    2. Placer vævssektioner i polystyrenindsatser med polyesternetbunde til fritflydende immunokemi. Vask 3 x 5 min i PBS.
    3. Overfør sektioner til 96-brønds plade med 180-μl blokopløsning (5% normalt æselserum, 1% PVP, 1% BSA og 0,3% Triton X-100 i PBS) i hver brønd. Inkuber 40 min på RT.
      Bemærk: Alle vaske- og inkubationstrin udføres med let omrøring på shaker.
    4. Sektioner overføres til brønde, der indeholder den primære antistofopløsning (180 μl pr. brønd). Inkuberes i primær antistofcocktail, kaninanti-GFAP (1:1000) og fåreanti-TH (1:400) fortyndet i PBS med 1% BSA og 0,3% TX-100, i 24 timer ved 4 °C. IgG fra den primære art tjener som den negative immundæmpende kontrol.
    5. Inkuber i sekundær antistofcocktail (1:200 æsel anti-kanin 568 og 1:200 FITC æsel anti-får i PBS med 0,1% TX-100). Brug folie til at beskytte opløsningen mod lys under forberedelse og inkubation; inkuberes ved RT i 2 timer.
      1. For en negativ kontrol skal afsnit i IgG inkuberes fra primærarten fortyndet til samme koncentration som for de primære antistoffer.
      2. Vask 2 x PBS og 1 x TS i 5 min hver på RT. Mount væv sektioner på plus dias i montering medium med Hoechst plet og coverlip.
    6. Inkuber i sekundær antistofcocktail (1:200 æsel anti-kanin 568 og 1:200 FITC æsel anti-får i PBS med 0,1% TX-100). Brug folie til at beskytte opløsningen mod lys under forberedelse og inkubation; inkuberes ved RT i 2 timer.
    7. Vask 2 x PBS og 1 x TS i 5 min hver på RT. Mount væv sektioner på plus dias i montering medium med Hoechst plet og coverlip.
    8. Beskyt lys og oxidation, indtil de bliver billeddiagnostik, ved at opbevare dem i en glidekasse ved 4°C.
    9. Analyser den negative kontrol først for at bestemme baggrundsniveauet for fluorescens, og evaluer derefter for positiv immunoreaktivitet ved hjælp af fluorescerende mikroskopi.
  2. Iba1 immunohistochemistry med kromagen nedbør
    1. Fjern rør, der indeholder sektionsopdelt mellemhjern fra -20°C fryser, og bring vævssektioner, der indeholder substantia nigra, ud af kryopræserveringsopløsningen i en bakke, der indeholder PBS.
    2. Placer vævssektioner i polystyrenindsatser for fritflydende immunokemi. Vask sektion 3 x 5 min i PBS, og læg sektioner direkte i 12-brønds plade, der indeholder forvarmet 10 mM citronsyre monohydrat, pH 9,0, 80 °C i 30 min, til epitopudtagning.
    3. Afkøl plade 20 min ved RT. Returner sektioner til skær og vask 3 x 5 min i PBS.
    4. Afsnit overføres til 96-brøndsplade, der indeholder 180-μl blokeringsopløsning (10% normalt gedeserum, 1% BSA i PBS) pr. brønd, og inkuber 40 min ved RT.
    5. Der overføres sektioner til brønde, der indeholder 180-μl fortyndet primært antistof (1:1000 i 1% BSA-PBS). Inkuber natten over ved 4 °C.
    6. Overfør sektioner til indsættelser. Vask 3 x 5 min PBS og påfør biotinyleret sekundært antistof (1:200 i 1,5% normalt serum-PBS) i 1 time ved RT.
    7. Forbered ABC-opløsningen 30 minutter før brug. Vask 3 x 5 min PBS og overfør til ABC løsning i 1 time ved RT.
    8. Forbered DAB-opløsning i emhætte. Vask 2x 5 min i PBS og 1x 5 min i TS, og inkuber sektioner i DAB.
      1. Udvikle sig til 3-4 min. Negativ kontrol skal forblive lys i farven.
        Bemærk: Udfør dette trin i røghætten, da DAB er et kendt kræftfremkaldende stof. En opløsning på 0,2 M kaliumpermanganat i ddH2O til dekontaminering bør opretholdes i nærheden i tilfælde af utilsigtede dryp.
    9. Skyl sektioner kort i ddH2O, derefter i TS 3 x 5 min. Monter sektioner på plus rutsjebaner og lufttørre natten over i røghætte.
    10. Dekontaminere DAB affald med en lige stor mængde på 0,2 M kalium permanganat i ddH2O, vortex, og inkuberes i en røghætte natten før opbevaring i passende mærket DAB affald bin i røghætte.
      Bemærk: Blegemiddelopløsningen eliminerer ikke DAB's mutagene egenskaber.
      1. Dekontaminere genstande, der skal genbruges (dvs. polystyrenindsatser) og vaskes med vaskemiddel.
    11. Dehydrer/counterstain let med Cresyl violet (CV). Alle dehydrerings-/vasketrin er 3 min:ethanol 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 sekunder), ddH20 x 2, 95% ethanol + glacial eddikesyre (0,1%) x 2, 100% ethanol og xylen.
    12. Coverslip i distyren-toluen-xylen montering medium og tør i røg hætte.
    13. Overhold positiv immunoreaktivitet ved et let mikroskop. IgG fra den primære art tjener som den negative immundæmpende kontrol.

9. Statistik

  1. Vurder forskelle mellem midler ved envejsanalyse af varians (ANOVA) for at sammenligne forskelle mellem genotype og ved tovejs ANOVA for at sammenligne forskelle mellem genotype og toksikant behandling. Udnyt Tukey's HSD post hoc-analyse, når forskelle observeres ved ANOVA test (p≤0,05).
    Bemærk: Forsøg (med n = 6-9 mus/gruppe) udføres mindst to gange for at sikre reproducerbarhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette toksineksponeringsparadigme kan producere en betydelig og påviselig 20% striatal dopaminudtømning hos MPTP- vs. saltvandsindsprøjtede dyr. Det er vigtigt at bemærke, at forskellige masser af MPTP kan give lidt mere eller mindre læsion; For bedre præcision anbefales således et indledende forsøg med wildtypemus inden brug i transgenik, når en ny masse neurotoksin udnyttes. Brugen af mild til moderat læsion gør det muligt at observere transgenets virkning; en alvorlig læsion kan producere en 'gulveffekt' med skade, der er for robust til at dæmpe eller så skadelig, at den overskygger effekten af en skadelig genetisk ændring. Virkningerne af MPTP på striatal dopamin var signifikant forskellige hos 5-LOX isozym-mangelfulde mus, men ikke 12/15-LOX isozym-mangelfulde mus (Figur 1). Desuden var vi med disse metoder i stand til at skelne en betydelig forskel i dopaminniveauer på grund af 5-LOX-manglen hos saltvandsbehandlede mus (figur 1).

Immunoblotting for TH og GFAP gjorde det muligt at bekræfte skader og neuroinflammation på henholdsvis striatumniveau hos mus af vildtype, en effekt, der blev formindsket i 5-LOX isozym-mangelfuld striatum (Figur 3A og 3B). Læsionen kan også ses på substantia nigra-niveau(figur 2A og 2B). Hos de samme mus kan udtømning af TH-positive neuroner og øget GFAP-immunoreaktivitet observeres ved hjælp af dobbeltmærket immunfluorescerende mærkning (Figur 2A). Desuden er der markant forhøjet mikroglial aktivering (dvs. Iba1 immunoreaktivitet) i vildtype, men ikke 5-LOX isozym-mangelfuld, mus er tydelig i substantia nigra efter MPTP-eksponering (Figur 2B). Således kan MPTP-modellen give et nyttigt værktøj til at vurdere virkningen af genetisk disposition for nigral degeneration og betændelse.

Figure 1
Figur 1. LOX isozym-selektive virkninger på striatal dopamin efter MPTP udfordring. (A) Striatal homogenater blev anvendt til at måle dopamin (DA) af HPLC fra WT og 5-LOX-/- littermates givet saltvand eller MPTP (n=6-8/group). ‡, markerer en betydelig effekt på grund af genotype p<0.05. *, markerer en betydelig effekt på grund af genotype og behandling; p<0.05. Der blev ikke konstateret nogen signifikant forskel på grund af behandlingen hos 5-LOX-/- mus (n.s.), hvilket indikerer, at MPTP ikke producerede striatal DA-udtømning i denne transgene linje. (B) Striatal homogenater blev anvendt til at måle DA i WT og 12/15-LOX-/- littermates givet saltvand eller MPTP (n=6-9/group). Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i DA-niveauer på grund af genotype. En betydelig og lignende reduktion på grund af MPTP-behandling blev bemærket i begge genotyper. *, s.<0.01. Data vises som middelværdi ± SEM.

Figure 2
Figur 2. 5-LOX isozym virkninger på nigral TH og astroglia efter MPTP udfordring. (A) Immunfluorescensfarvning for TH (FITC; grøn) og GFAP (568; rød) immunoreaktiver blev udført i nigral hjernesektioner fra WT og 5-LOX-/- littermates givet saltvand eller MPTP. Færre TH-positive cellelegemer (*) og forbedret GFAP immunoreaktivitet er synlige i WT-MPTP-gruppen. Bar = 25 μm. (B) Immunohistokemisk histologi for Iba-1 på microglia blev påvist ved hjælp af DAB (brunt kromvand); sektioner blev modstællet af Cresyl violet. Nigral sektioner fra WT og 5-LOX-/- littermates behandlet med saltvand eller MPTP blev vurderet. Microglia med forgrenede cellelegemer og lange forgreningsprocesser observeres i substantia nigra fra saltvandsbehandlede mus (pilehoveder). Aktiveret mikroglia med afrundede cellelegemer og korte, fortykkede processer blev observeret i substantia nigra fra MPTP-behandlede mus (pile). Bar = 10 μm.

Figure 3
Figur 3. 5-LOX isozym virkninger på striatal TH og inflammatorisk efter toksisk fornærmelse. (A) Striatal TH-proteinindholdet blev semiktalt kvantitativt målt ved western blot-analyser af homogenat fra WT og 5-LOX-/- littermates given saltvand eller MPTP (n=6-8/group). Immunoreaktivitet, målt ved optisk tæthed, blev normaliseret til β-actin. *, s.<0.05. (B) På samme måde blev GFAP semikativt målt ved western blot-analyser af striatal homogenat fra WT og 5-LOX-/- littermates givet med saltvand eller MPTP (n=6-8/group) og normaliseret til β-actin. *, s.<0.05. Data noteres som middel ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udformningen af denne interaktionsundersøgelse om genmiljø gav os mulighed for at få nye oplysninger om 5-LOX isozymets dobbelte karakter i nigrostriatalvejen. Ved at udføre HPLC til måling af striatale monoaminer efter saltvands- eller MPTP-behandling i transgenik, der mangler 5-LOX-isozymet og deres littermates af vildtype, kunne vi konstatere, at dens mangel synes at være beskyttende under toksiske forhold (figur 1), men under normale forhold reducerer manglen på enzymet striatal dopaminniveauer og kan være skadelig. Således er vi i stand til at påvise, at 5-LOX isozym bidrager til striatal dopaminergisk tone under normale forhold, men kan bidrage til skader efter toksikant udfordring4.

Selv om yderligere evaluering bør give ny mekanistisk indsigt i LOX-isozymers rolle i nigrostriatal toksicitet, viste western blot-analyser (figur 3) samt immunohistokemiske undersøgelser (figur 2), at neuroinflammationsmarkører i det mindste delvis blev svækket i den 5-LOX isozym-mangelfulde kohorte, der blev udsat for MPTP. Disse fund, ved hjælp af klassiske biokemiske og histologiske teknikker, indikerer en kritisk rolle af 5-LOX-produkter i potensering af mikro- og astro-glial aktivering4.

Afhængigt af den undersøgte interaktion mellem gen og miljø kan patologiske udlæsninger ud over glialaktivering analyseres. Af særlig betydning i PD er tab af dopaminergiske neuroner i substantia nigra og potentielt patologisk akkumulering og sammenlægning af α-synuclein. Langs denne linje er virkningen af toksisk eksponering hos transgene mus med α-synuclein overexpression blevet overvåget ved evaluering af nigral celledød (dvs. ved hjælp af upartisk stereologiske celletælling) og uopløselige α-synuclein deposition32-35.

Den MPTP-dosis, der anvendes i det her beskrevne paradigme, giver en mild læsion med beskeden, men betydelig, striatal skade (figur 1) og glialaktivering i både striatum og substantia nigra (Figur 2 og 3). Typisk, højere doser af toksikant bruges til at producere robuste nigral dopaminergiske celle tab og striatal dopamin udtømning23,24,32,36-38,39. Det er vigtigt at bemærke, at MPTP's toksicitet kan variere mellem leverandører og partier; det kan derfor være nødvendigt at justere doserne for at frembringe den ønskede læsion. Desuden er andre faktorer, der skal tages i betragtning, belastningen og kønnet hos dyr, der anvendes til undersøgelserne. Selektiv følsomhed over for neurotoksinet er blevet påvist i forskellige baggrundsstammer af mus, et fænomen, der i det mindste delvis skyldes forskelle i aktivering af subcellulære veje, der mæglede degeneration, herunder JNK og c-Jun36-39. Kønsafhængige forskelle i MPTP-toksicitet er også blevet rapporteret40,41og kan bidrage til variabilitet i undersøgelser ved hjælp af transgene mus, hvor begge køn anvendes til dårlige avlslinjer. I et sådant tilfælde er brugen af sexmatchede wildtype-kontrollerkritisk 4. Sådanne kønsrelaterede virkninger kan forklare forskellen i læsion, der er observeret i WT-musene mellem forsøg, der tester virkningen af 5- og 12/15-LOX-mangelfulde mus, hvor det ene køn blev anvendt til den ene linje og begge køn for den anden (figur 1). I forbindelse med interaktionsundersøgelser mellem gener og miljø anbefales en MPTP-udfordring, der forårsager alvorlig skade(f.eks. >80% reduktion i striatal dopamin), ikke, da dette kan maskere en mulig genetisk effekt.

Mens MPTP eksponering producerer nigral celledød3,42, striatal dopamin udtømning3, kompleks I hæmning43-45, og glial aktivering46,47, der er blevet rapporteret i human PD, hos musen, en langsomt progressiv degeneration, der producerer stabil parkinsonisme(dvs. motoriske underskud) og ærlig α-synuclein patologi(dvs. Lewy organer og neuritter) fuldt sammenfattende kendetegnende træk ved sygdommen ikke forekommer i modellen. Det er dog vigtigt at bemærke, at MPTP-musen har spillet en afgørende rolle i forståelsen af subcellulære veje, der bidrager til PD-relateret neurodegeneration. Variation i eksponeringsparadigmer har for eksempel afsløret aktivering af forskellige toksicitetsmekanismer: lavdosis, subakut eksponering fremmer apoptotisk celledød48 med et begrænset immunrespons49, mens akut behandling med højere doser producerer markant mikroglial aktivering50. Sådanne faktorer bør overvejes, når modellen for effektivitetsundersøgelser anvendes, og, som er relevante for den aktuelle undersøgelse, for at afsløre virkningen af en potentiel genetisk risikofaktor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der er intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health NIGMS 056062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01 counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt 7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

Tags

Medicin MPTP dopamin Iba1 TH GFAP lipoxygenase transgene gen-miljø interaktioner mus Parkinsons sygdom neurodegeneration neuroinflammation
Gene-miljø Interaktion Modeller til unmask modtagelighed mekanismer i Parkinsons sygdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R.,… More

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter