Summary
脂氧酶 （LOX） 异酶可以产生可能增加或减少神经发炎和神经退化的产品。基因-环境相互作用研究可以识别LOX异位素特异性效应。使用1-甲基-4-苯-1，2，3，6-四氢皮里丁（MPTP）模型的硝基丙烯损伤在两个LOX异酶缺乏转基因线允许比较LOX异位素对多巴胺完整性和炎症的贡献。
Abstract
脂氧酶 （LOX） 活动与神经退行性疾病（如阿尔茨海默氏症）有关，但其对帕金森病 （PD） 发病机理的影响鲜为人知。基因-环境相互作用模型在揭开特定细胞通路毒性的影响方面有用，单凭遗传或毒性疾病模型是无法观察到的。要评估是否不同的LOX异位体有选择地有助于PD相关的神经退化，转基因（即 5-LOX和12/15-LOX缺乏）小鼠可以挑战一种毒素，模仿细胞损伤和死亡的紊乱。在这里，我们描述了使用神经毒素，1-甲基-4-苯-1，2，3，6-四氢胆碱（MPTP），它产生一个尼古斯特里亚病变，阐明LOX异位体对与PD相关的神经退化的独特贡献。在小鼠和非人类灵长类动物中使用MPTP是重新概括PD中硝基体损伤的既定证据。MPTP 诱发病变的程度通过 HPLC 对多巴胺及其代谢物的分析以及对酪氨酸羟基酶 （TH） 纹状体的半定量西方污点分析来衡量，该纹状体是多巴胺合成的限速酶。为了评估炎症标记，这可能证明LOX异酶选择性敏感性，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Iba-1免疫组织化学在含有亚坦蒂亚尼格拉的大脑部分进行，GFAP西斑分析在纹状同源物上进行。这种实验方法可以为基因-环境相互作用提供新的见解，这些相互作用是尼古菌变性和PD的基础。
Introduction
使用基因-环境相互作用模型提供了一种方法，模仿可能影响特发性帕金森病（PD）的危险因素，并提供了一个机会来辨别机械学的见解，不太可能通过单独使用遗传或毒性系统来阐明1，2。在这里，我们说明了这一点，并描述了应用1-甲基-4-苯-1，2，3，6-四氢皮里丁（MPTP）小鼠模型的硝基质变性3，以更好地了解脂氧酶（LOX）异酶活性的神经发炎和毒性4的选择性。虽然LOX同位素的作用已被广泛评估在外周疾病5，6以及CNS疾病，包括中风7和阿尔茨海默病8，9，同位素家族的作用，在硝基质功能和退化相关的PD是不太清楚的，值得研究。MPTP神经毒素表现出乳胶病原体通路的优先退化，并重新概括了纹状多巴胺耗竭和尼格勒多巴胺细胞损失，这是PD患者10运动损伤的基础。虽然这种模型没有复制非运动和运动PD行为和坦率的α-核素阳性Lewy身体病理学的全干部， 它一直有助于阐明新的机械靶点，有助于尼古斯特菌损伤和早期转化测试，因为它是最好的特征非侵入性模型，可用于可靠地产生硝基细胞死亡伴随着纹状多巴胺损失11-15。广泛使用MPTP小鼠，其范式从急性，亚急性到慢性16-18，已允许标准化的给药，导致轻度至重度硝基层损伤19，20与激活不同的毒性机制，这取决于治疗方案18，21，22。因此，这允许一个"病变窗口"的目标，可能会导致增强或减少硝基质损伤取决于治疗剂或转基因模型使用23-25。
对于转化和发现生物学研究来说，同样必要的是用于评估损伤的技术以及这些方法提供的证据。对于 MPTP 鼠标模型， 评估病变的既定指标是测量纹状多巴胺语气的标记物，包括HPLC的多巴胺及其代谢物，以及西方斑点分析酪氨酸羟基酶（TH），多巴胺合成中的限速酶，以及利用西式污点分析和免疫化学4的胶质活化等退行事件指标。虽然这些是经典的神经化学、生化和组织学程序，但这些技术提供了关于黑鬼多巴明神经通路内损伤程度的关键和可重复读数，表明毒性机制，并被证明是了解PD退行性事件的宝贵工具。
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Protocol
注：所有动物程序和动物护理方法均应经该机构的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。此处描述的研究是按照 SRI 国际 IACUC 制定的准则进行的。
1. 收购和维护缺乏LOX的老鼠
- 在 7-8 周时购买 5-LOX 缺陷或 12/15-LOX 缺乏小鼠以及相应的菌株和性别匹配对照组，并在抵达后留出几天时间适应设施。
- 将老鼠保持在12小时的光暗循环中，并给予食物和饮用水。
2. MPTP 的预防措施、储存、准备、净化和处置
注：MPTP因静脉注射而陶醉在人类身上已证明会导致帕金森病10：MPTP是高度嗜脂的，可以很容易地跨越血脑屏障26。应采取预防措施，确保安全处理、排毒和处置。其新陈代谢涉及多个步骤，包括由酶单胺氧化酶B（MAO-B）27转化为1-甲基-4-苯-2，3-二氧化二氮。MAO-B抑制剂可用于意外人类陶醉。
- 确保人员在使用经机构健康和安全委员会规定的 MPTP 之前接受适当的安全和处理培训。各机构可根据第17、22号文献中全面概述的建议，制定和实施本标准的使用MPTP的操作程序。
- 在准备之前，不要使用适当的个人防护装备（PPE），包括：一次性实验室外套或全身套装、双亚硝酸盐手套、外科口罩、护发罩、安全护目镜和一次性鞋套。在准备 MPTP、注射模式和处理动物和/或床上用品时应佩戴适当的 PPE 和 72 h 注射后。
- 在准备前执行计算。应遵循剂量的体制准则：100-150 μl的交付通常用于25-30克小鼠。
- 要在盐碱中准备 3 毫克/毫升 MPTP 解决方案，请应用校正因子（1.211 MPTP-HCl：1.0 MPTP 免费基数）;盐水车中MPTP-HCl的浓度为3.633毫克/毫升。
- 在处理神经毒素之前，准备 MPTP 制备和潜在溢出净化所需的所有设备、用品和试剂。
- 从适当的存储位置删除 MPTP-HCl 源小瓶。
注意：MPTP 应保留在 RT 的次要容器内的封闭小瓶中，并存储在标有"MPTP"的锁定柜内。- 用垫子或纸巾覆盖天平周围的区域，用 10% 漂白剂溶液进行阻尼，以降低溢出粉末的风险。保持组织和10%漂白溶液附近作为预防措施。
- 使用位于烟罩中的分析平衡，将 50 毫克 MPTP-HCl 放入玻璃瓶中，并含有 10% 漂白浸泡组织的二次密封。将玻璃瓶贴上浓度和日期的标签"MPTP"。
- 关闭源小瓶，用10%漂白剂擦拭外部。
- 慢慢将 13.763 毫升无菌盐水加入小瓶中，并完全关闭以进行混合。（解决方案为 3.633 毫克/毫升 MPTP-HCl.）
- 在发动机罩中，使用 0.22μm 过滤器过滤到带有 10% 漂白浸泡组织的次要容器内的标记注射小瓶中，仔细消毒 MPTP 溶液。用漂白剂浸泡的组织清洁任何溢出物。
- 小心处理利器和小瓶在适当标记的生物危害容器。将 MPTP 溶液保存在次容器的瓶中，用漂白纸巾运送到动物手术室。
注意：不要自动将MPTP溶液解为灭菌，因为其蒸发是吸入危险。
- 将 MPTP 源小瓶返回其次要容器并放置在存储位置。使用 10% 漂白剂去污铲、分析尺度和罩面 10 分钟。
3. MPTP 管理
- 准备一次性笼子与标准微隔离器穿孔盖包含聚酯过滤衬里标记为"MPTP"（减去线食品烧烤），一次性笼内衬，湿前食品颗粒和水凝胶作为水源。称重所有动物，在15毫克/千克注射所需的盐水中达到3毫克/毫升MPTP的记录体积。
注：MPTP代谢物在注射28、29后3天内可在排泄物中检测：然而，小鼠排泄MPTP n氧化物，一种无毒衍生物，不会交叉膜，因为它的亲水性30。- 穿着上面列出的所有PPE，将鼠标放在一次性吸收垫上，将盐水车或MPTP溶液注射到15毫克/千克剂量的腹腔（即p.），每天使用一次性26口径的结肉素注射器4天。
- 使用后不要回顾注射器：处置到专用和标记的 Mptp 生物危害锐利容器。保持10%的漂白剂和附近的组织，以清洁任何意外滴水。
- 将注射MPTP的动物放在一次性笼子里，每个笼子最多5只老鼠，并放在开放的架子上。不要使用通风机架。
- 将 MPTP 使用标语牌放在机架上，内含鼠标和住房房门，直到上次注射后 72 小时。
注意：确保房间温度在22.2-24.4°C之间，因为小鼠在MPTP醉酒后会经历高达12h的短暂体温过低。31 - 每次使用后用漂白剂净化工作表面（见第 2.8 步），通过添加相当于 10% 漂白剂的体积处理剩余的 MPTP 解决方案，并丢弃作为生物危害液体废物的内容。
- 将所有已使用的 PPE 丢弃在专用处置箱中。如有必要，在处置前用10%漂白剂喷洒。
- 将 MPTP 使用标语牌放在机架上，内含鼠标和住房房门，直到上次注射后 72 小时。
- 定期检查动物，并在注射模式期间和上次注射后 72 小时每天刷新食物和水源。注意：虽然预计紧接在笼子外围的区域不会受到污染，但作为预防措施，使用漂白剂溶液处理此区域（如第 2.8 步所述）。在此期间，在处理所有小鼠和设备时应小心谨慎。
- 最后一次注射三天后，将所有笼子和衬里放在贴有适当标签的生物危害袋中。恢复使用常规PPE和动物的正常住房;取出门和架子标语牌。
4. 组织收获
- 在上次MPTP注射7天后，通过子宫颈脱位对动物实施安乐死。立即使用在日冕平面上有1毫米槽的预冷脑模具解剖冰上的大脑。
- 从前脑切片 2 毫米厚的纹状体中分离纹状体，位于前小卖部的水平上。
- 使用手术刀去除周围的皮质和皮下区域。在单独的1.5毫升微中微管中，从每个半球的抓冻结纹状体组织进行神经化学或生化分析。
- 在冠状平面上阻塞中脑/后脑，在4%甲醛水溶液中前下丘脑和浸入固定组织的水平。
5. 组织处理
- 生物化学过程
- 使用 200-μL Tris-EDTA 裂解缓冲器（25mM Tris base） 中的超声波细胞干扰器，实现来自一个半球的纹状组织均质化， 1m EDTA， 1：100 蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒） 10 脉冲在 10-12 Hz 和离心 10 分钟在 4oC 在 1000xg.
- 小心吸气超自然，并在150-μl裂解缓冲器中重建颗粒。分数用于 SDS-PAGE 和西方印迹的生化分析。
注意：由于水溶液不稳定，在制备后1小时内使用含蛋白酶和磷酸酶的缓冲液。
- 神经化学过程
- 利用从其他半球解剖的纹状体，从每个样品存储在 -80°C 的 HPLC。在冰上的微富管中解冻纹状组织，加入500-μl 0.3N高氯酸（PCA），并使用声波器实现均质化。
注意：要制作 100 毫升 0.3N PCA，测量 90 毫升 ddH2O，添加到 100 毫升分级气缸中，添加 2.58 毫升 70% PCA，并达到 100 毫升标记。此样品缓冲器可在 4°C 下存储长达一个月。 - 500-μl冰冷0.3N PCA中的声波石质组织，在10-12赫兹处用于10个脉冲，并放置在冰上。为了确保同质性，声波样品第二次10秒，然后离心机12分钟在4oC在16，100xg。
- 立即将超自然物降格为 1.5 毫升微中性管，并储存在 -80°C。 空气干燥发动机罩中的颗粒分数。
- 将超标保持在 -80°C，直到 HPLC 通过电化学检测用于测量多巴胺及其代谢物、3，4-二羟基苯酸 （DOPAC） 和同烷酸 （HVA）。
- 干燥后，用 0.5N NaOH （500 μL） 重新构造颗粒分数，并短暂地发出声波。将重组后的颗粒分数储存在 4°C，直到使用 Lowry 方法确定总蛋白质。
- 利用从其他半球解剖的纹状体，从每个样品存储在 -80°C 的 HPLC。在冰上的微富管中解冻纹状组织，加入500-μl 0.3N高氯酸（PCA），并使用声波器实现均质化。
- 免疫化学过程
- 浸入修复中脑和后脑块过夜在4%甲醛水溶液和低温保护分级蔗糖溶液（10%在磷酸盐缓冲盐水（0.01 M PBS; 0.138 M NaCl， 0.0027 M KCl， 和 ddH2O， pH 7.4） 24 h， 然后 30% 在 PBS， 直到组织下沉） 在 4°C. 短暂地污点低温保护块，以去除多余的蔗糖溶液，冻结在干冰上，并储存在-80°C，直到使用。
- 在冷冻统计器中包含中脑和后脑的大脑块的微托姆剖面。
- 从 -80°C 中取出组织，在 -16°C 下在低温状态下平衡 1 小时，并安装在组织嵌入介质中。
- 将 40-μm 厚度的日冕部分收集到低温保护溶液中（0.01M PBS，30% 蔗糖，30% 乙二醇，pH 7.4）在 -16°C。 以 240-um 间隔将组织连续收集到 6 1.5 毫升微中微富格管中，并储存在 -20°C。
6. 免疫印迹
- 通过 BCA 检测确定纹状体超自然成分中的蛋白质浓度（如第 5.1 节所述）。
- 计算每个样品所需的稀释，以 20 μl 的体积每口油井产生 10μg。
- 稀释超自然蛋白质，使用 4X 莱姆利缓冲和均质缓冲，在 1X 莱姆利缓冲液中产生 10 μg 蛋白质。示例计算：
- 确定所需的蛋白质和体积的最终浓度。在这种情况下，需要 10 μg 在 20 μl （0.5 毫克/毫升） 。
- 确定所需的蛋白质溶液的最终体积。虽然加载需要 20 μl，但应准备额外的体积（30 μl）。
- 由于最终体积和浓度已知，蛋白质超自然成分的浓度已知（由 BCA 检测确定），因此使用等式计算所需的蛋白质超纳特的体积：
V超自然 = （V最终 x C决赛） /C 超纳坦特
因此，对于1.5毫克/毫升的超自然蛋白质浓度，
V超自然 = （30 微克 x 0.5 毫克/毫升）/1.5 毫克/毫升
V超自然 =10μl - 计算在 30 μl 体积（30 μl / 4 = 7.5 μl）中产生 1 倍浓度所需的 4 倍 Laemmli 缓冲器的量。注意：4X 莱姆利缓冲器必须在样品制备中稀释为 1 倍强度。
- 计算将体积达到 30 μl 所需的同质化缓冲器量（并获得所需的最终蛋白质浓度 0.5 毫克/毫升）：
- 通过漩涡准备样品，然后将10μl的蛋白质超自然体输送到12.5微l的同质化缓冲器中。添加 7.5 微l 的 4X 莱姆利缓冲区，用于 30-μl 样品工作解决方案和 0.5 毫克/毫升浓度。
- 使用描述的程序准备所有样品，漩涡和煮沸 5 分钟。
注意：使用螺丝顶微中微管防止沸腾过程中因压力而泄漏和打开。 - 5分钟后，立即放在冰上。每口凝胶井（10微克蛋白质）装载20μl的样品工作溶液。SDS-PAGE在12%的三甘氨酸凝胶上分离蛋白质样本。
- 使用预先染色的蛋白质阶梯来确认分子重量。运行缓冲区为 25 mM 三元碱基、192 m 胶氨酸、0.1% SDS 和 ddH2O，pH 8.3。
- 电泳分离蛋白质：以80 V运行以清除井（10分钟）和125 V（约1小时;直到蛋白质梯子完全分离），以解决蛋白质。
- 在三合院转移缓冲区（25 mM Tris，192 mM甘氨酸，0.04%SDS，20%甲醇和ddH2O，pH 8.3）中使用蛋白到硝基纤维素转移，在4°C下过夜40 V。
- 在 1x Tris 盐水 （TS; 25mM Tris， 0.9% NaCl 在 ddH2O， pH 7.4） 中洗硝基纤维素斑点 10 分钟， 在庞绍 S 的 Rt. lncubate 5 分钟， 然后在 ddh2O 中冲洗， 以提供等效蛋白质加载的粗略验证。扫描图像以保留笔记本记录，并使用 PBS 进行除污。
注意：或者，在包含HCl的米利-Q或ddH2O中清洗污点（0.2%）约5分钟。扫描以记录。通过后续的孵化步骤（即放置在阻塞缓冲区中）从膜上去除庞绍 S 污渍。 - 在 RT 将 5% 非脂肪奶粉中的斑点在 TS 中阻塞 1 小时，在 4oC 处用兔子抗酪氨酸羟基酶 （1：1000）、 抗β-actin（1：200） 孵育 24h：5% 牛奶 Ts 中的抗 Gfap （1：1000） 。
- 在TS中用0.05%的补间-20和1 x 5分钟在TS中清洗斑点3 x 5分钟，然后在HRP组合的二次抗体中孵育（含有5%牛奶的TS中为1：5000），与原发性品种匹配，在RT中孵育2小时。
- 使用等量的发光醇和过氧化物溶液制备化疗素基板，并申请1-3分钟。在暗室中，将污点放在塑料袖子中，以便薄膜曝光并暴露在胶片中;然后使用自动处理器开发薄膜。
- 带条斑点与市售剥离缓冲在37°C 30分钟，洗3x 10分钟在TS与0.05%Tween-20，1x 10分钟在TS，然后重新复制加载控制或其他感兴趣的蛋白质。
- 通过图像 J 软件量化信号以进行光学密度测量，并正常化为内部加载控制 β- actin。
7. 神经化学
- 如第5.2节所述，准备了用于分析的组织。有关移动阶段配方，请参阅表 1。
注意：所有试剂必须是纯≥99.0%和HPLC级。确保缓冲区完整性与清洁，专用玻璃器皿和搅拌棒。移动相缓冲应在准备后七天内使用。- 称量磷酸二氢酸和柠檬酸，加入 1 升 ddH2O，混合在 2 升分级气缸中。通过 0.22-μm GSTF 膜过滤溶液。
注意：这最大限度地提取磷酸盐和柠檬酸中的污染物，这有助于最大限度地减少背景电流。 - 添加OSA，然后是前三甲基和EDTA解决方案。在用磷酸将pH值调整到3.0之前，将HPLC级ddH2O添加到约1900毫升。
- 将 HPLC 等级ddH 2O 添加到 2-L 标记中，然后倒入 2 升烧瓶中。添加专用搅拌棒，在真空中搅拌10分钟，使其达到移动阶段>。
- 称量磷酸二氢酸和柠檬酸，加入 1 升 ddH2O，混合在 2 升分级气缸中。通过 0.22-μm GSTF 膜过滤溶液。
- 准备多巴胺标准，以及 DOPAC 和 HVA 标准曲线。标准库存解决方案在 0.3 N PCA 中以 1 毫克/毫升的速度准备。
- 重 12.4 毫克多巴胺-HCl，并添加 10.0 毫升 0.3 N PCA，使 1 毫克/毫升多巴胺。
- 重量 10.0 毫克的 DOPAC，并添加 10.0 毫升 0.3 N PCA，使 1 毫克/毫升多太平洋。
- 重量 10.0 毫克 HVA，并添加 10.0 毫升 0.3 N PCA，使 1 毫克/毫升 HVA。
- 从库存解决方案中准备工作标准解决方案。五点标准用于生成浓度曲线。
- 用于测量纹状多巴胺，准备标准浓度为 12.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml 和 200 ng/ml。
- 对于纹状体 DOPAC，准备标准浓度为 2.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml 和 40 ng/ml。
- 对于纹状HVA，准备标准浓度为5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml和80 ng/ml。
- 生成五点标准：使用 0.3N PCA 将 1 毫克/毫升多巴胺库存溶液稀释到 5 μg/ml。使用 0.3N PCA 将 1 毫克/毫升 DOPAC 库存溶液稀释到 1 μg/ml，使用 0.3N PCA 将 1 毫克/毫升 HVA 库存溶液稀释到 2 μg/ml。
- 将 1 毫升 5 微克/毫升多巴胺、1 毫升 1μg/ml DOPAC 和 1 毫升 2μg/ml HVA 转移到 25 毫升体积烧瓶中，并将体积达到 25 毫升标记，具有 0.3 N PCA。
注意：体积烧瓶中的混合标准包含五点标准的最高浓度：200 ng/ml多巴胺、40 ng/ml DOPAC 和 80 ng/ml HVA。 - 将 1 毫升混合标准转移到清洁的 1.5 毫升微中福管中。执行 1：1 连续稀释四次，生成随后的四点标准。
- 例如，在混合标准的 250 μl 中，彻底添加 250 μl 的样品缓冲器和涡流，以原始浓度的 50% 产生混合标准：重复过程，直到实现所需的稀释。
- 准备 HPLC 系统（泵、自动采样器、反相柱（C18、150× 3.2 毫米、3μm）） 。使用新的移动相清除泵，以替换 HPLC 系统中的所有先前解决方案，并将气泡与新鲜移动相位进行捕获。将自动采样器冷却至 4°C。 将柱子加热至 35°C，从而降低总压力。
- 电化学探测器的第一和第二个电极的电压分别为-150mV和220mV。将系统平衡至少 2 小时，理想情况下是一夜之间，移动相位的流速为 0.2 毫升/分钟。
注意：在均衡过程中，细胞应处于打开状态，基线读数应受到监控。稳定的读数表示系统已准备就绪。在均衡阶段的两个小时中，允许移动阶段进入废物容器，而不是重新循环。在此期间之后，移动相可在一夜之间回收以实现平衡。 - 均衡完成后，将移动相流速调整为0.6ml/min。每五点标准注射 20μl。
- 电化学探测器的第一和第二个电极的电压分别为-150mV和220mV。将系统平衡至少 2 小时，理想情况下是一夜之间，移动相位的流速为 0.2 毫升/分钟。
- 在冰上解冻纹状样品，并将每个样品的 2 x 20 μl 注入 HPLC 系统。在每组纹状样品的开头和随机使用标准。
- 使用该软件分析标准和样品产生的多巴胺、DOPAC 和 HVA 峰值下的区域。通过将峰值下的区域与其相应标准的 5 点曲线的区域进行比较，通过保留时间和测量来识别分析。
- 按照第 5.2.3 节所述准备颗粒分数。在纹状颗粒上执行低蛋白检测。注意：此检测将测量纹状体样本中毫克/毫升中蛋白质的含量：此信息用于确定分析的 ng/mg 浓度。
8. 免疫化学
- GFAP/TH双免疫荧光
- 从 -20°C 冰柜中取出含有部分中脑的管子，并带到 RT. 从含有 PBS 的托盘中去除含有亚坦丁尼格拉的组织部分。
- 将组织部分放在聚苯乙烯插入物中，并插入聚酯网状底部，用于自由浮动免疫化学。在PBS中清洗3 x 5分钟。
- 每口井中均将 180-μl 块溶液（5% 普通驴血清、1% PVP、1% BSA 和 0.3% Triton X-100 在 PBS 中）转移到 96 井板。在 Rt 孵化 40 分钟。
注意：所有洗涤和孵化步骤均在摇床上轻搅拌执行。 - 将部分转移到含有主要抗体溶液的井中（每口井 180 μl）。在原发性抗体鸡尾酒中孵化，兔子抗GFAP（1：1000）和绵羊抗TH（1：400）在PBS中稀释，BSA为1%，TX-100为0.3%，在4°C时为24小时。 来自主要物种的IgG作为负免疫控制。
- 在二次抗体鸡尾酒中孵化（1：200 驴防兔 568 和 1：200 FITC 驴防羊在 PBS 与 0.1% TX-100）。在制备和孵化过程中使用铝箔保护溶液免受光线的照射;在RT孵育2小时。
- 对于负控制，在IgG中孵育部分，从稀释到与主要抗体相同的浓度。
- 在RT.安装介质上分别清洗2 x PBS和1 x TS 5分钟。安装介质中的滑梯上各有7分钟，并带有霍克斯特污渍和盖滑。
- 在二次抗体鸡尾酒中孵化（1：200 驴防兔 568 和 1：200 FITC 驴防羊在 PBS 与 0.1% TX-100）。在制备和孵化过程中使用铝箔保护溶液免受光线的照射;在RT孵育2小时。
- 在RT.安装介质上分别清洗2 x PBS和1 x TS 5分钟。安装介质中的滑梯上各有7分钟，并带有霍克斯特污渍和盖滑。
- 通过在 4°C 的滑梯盒中存储，保护幻灯片免受光线和氧化，直到成像。
- 首先分析负控制以确定荧光的背景水平，然后使用荧光显微镜评估阳性免疫活性。
- Iba1 免疫化学与色度降水
- 从 -20°C 冰柜中取出含有部分中脑的管子，并带到 RT. 从含有 PBS 的托盘中去除含有亚坦丁尼格拉的组织部分。
- 将组织部分放在聚苯乙烯插入物中，用于自由浮动免疫化学。在 PBS 中清洗 3 x 5 分钟，并将部分直接放入 12 井板中，其中含有预热 10 mM 柠檬酸单水合物、pH 9.0、80°C 30 分钟，用于表皮检索。
- 酷板 20 分钟在 Rt. 返回部分插入和洗 3 x 5 分钟在 Pbs 。
- 将部分转移到包含 180-μl 阻塞溶液的 96 井板（10% 普通山羊血清，PBS 中 1% BSA），并在 RT 孵育 40 分钟。
- 将部分转移到含有 180-μl 稀释原抗体的井中（1%BSA-PBS 中的 1：1000）。在 4°C 下过夜孵化。
- 将部分传输到插入。洗3 x 5分钟PBS，并在RT应用生物素化二次抗体（1：200在1.5%正常血清-PBS）1小时。
- 使用前 30 分钟准备 ABC 解决方案。在RT上清洗3 x 5分钟PBS并传输到ABC解决方案1小时。
- 在引擎盖中准备 DAB 解决方案。在PBS中清洗2x 5分钟，在TS中洗1x 5分钟，在DAB中孵化部分。
- 发展3-4分钟。负控应保持浅色。
注意：在烟雾罩中执行此步骤，因为 DAB 是一种已知的致病原体。在发生意外滴水时，应保持 ddH 2 O 中0.2M高锰酸钾的溶液，用于净化。
- 发展3-4分钟。负控应保持浅色。
- 在ddH2O中短暂冲洗部分，然后在 TS 3 x 5 分钟内冲洗部分。安装部分加幻灯片和空气干燥过夜在烟雾罩。
- 在ddH2 O、涡流中，用等量的0.2M高锰酸钾净化DAB废物，并在烟罩中过夜孵化，然后储存在烟罩中贴有适当标签的DAB垃圾箱中。
注意：漂白液不能消除DAB的诱变特性。- 去污物品重复使用（即聚苯乙烯插入），用洗涤剂清洗。
- 脱水/与葡萄酸（CV）轻轻脱水/防水。所有脱水/洗涤步骤为3分钟：乙醇70%，95%，100%，95%，ddH2O，CV（30秒），ddH20 x 2，95%乙醇+冰川醋酸（0.1%）x 2，100%乙醇和二甲苯。
- 盖在脱脂-甲苯-二甲苯安装介质和干燥的烟熏罩。
- 通过光显微镜观察阳性免疫活性。来自主要物种的IgG作为负免疫控制。
9. 统计
- 通过对方差 （ANOVA） 的单向分析来评估手段之间的差异，比较基因型和双向 ANOVA 之间的差异，以比较基因型和毒性治疗之间的差异。利用 Tukey 的 HSD 后临时分析，当 ANOVA 测试观察到差异时（p≤0.05）。
注意：至少进行两次实验（使用 n = 6-9 小鼠/组），以确保可重复性。
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Representative Results
这种毒素暴露模式可在MPTP与盐水注射动物中产生显著且可检测到的20%纹状多巴胺耗竭。需要注意的是，不同数量的MPTP可能会产生轻微的或多或少的病变：因此，为了提高精度，建议在使用新的大量神经毒素之前，在转基因中对野生型小鼠进行初步实验。使用轻度至中度病变，可以观察转基因的影响：严重的病变可能会产生"地板效应"，伤害过于严重，无法衰减或破坏，从而掩盖有害基因改变的影响。MPTP对纹状多巴胺的影响在5-LOX异酶缺乏小鼠中明显不同，但12/15-LOX等离子缺乏小鼠（图1）则没有显著不同。此外，通过这些方法，我们能够辨别出多巴胺水平的显著差异，因为盐处理小鼠的5-LOX缺乏（图1）。
TH和GFAP的免疫抑制允许分别在野生类型小鼠的纹状体水平上确认损伤和神经发炎，这种效应在5-LOX异酶缺乏纹状体（图3A 和 3B）中减弱。病变也可辨别在亚坦蒂亚尼格拉（图2A 和 2B）的水平。在同一小鼠中，使用双标签免疫荧光标签（图2A）观察到TH阳性神经元的耗竭和GFAP免疫活性增加。此外，在野生类型中显着升高的微胶质活化（即 Iba1免疫活性），但不是5-LOX异酶缺乏，小鼠在MPTP暴露后在亚斯坦蒂亚尼格拉（图2B）中明显。因此，MPTP模型可以提供一个有用的工具来评估遗传倾向对黑鬼退化和炎症的影响。
图1。在MPTP挑战后，LOX对纹状多巴胺有选择性作用。（A） HPL从WT和5-LOX-/-给予盐水或MPTP（n=6-8/组）的垃圾使用纹状同质素来测量多巴胺（DA）。‡，由于基因型，显著的影响：p<0.05。*，由于基因型和治疗，标志着显著的影响;p<0.05。在5-LOX-/-小鼠（n.s.）中没有注意到由于治疗而产生的显著差异，表明MPTP没有在这个转基因系中产生纹状DA耗竭。（B）使用纹状同质物测量WT中的DA和12/15-LOX-/-给予盐水或MPTP（n=6-9/组）的垃圾伴侣。未观察到由于基因型导致的 DA 水平显著差异。两种基因型都注意到了由于MPTP治疗而显著且类似的减少。*，p<0.01。 数据显示为平均± SEM。
图2。5-LOX在MPTP挑战后对硝基TH和天文胶的影响。（A）在WT和5-LOX-/-给予盐水或MPTP的黑鬼大脑部分对TH（FITC;绿色）和GFAP（568;红色）免疫活性进行了免疫荧光染色。在WT-MPTP组中，TH阳性细胞体（*）和增强的GFAP免疫活性明显减少。酒吧 = 25 μm. （B）使用 DAB （棕色色谱） 检测出微胶质 Iba-1 的免疫化学组织学：部分被克雷西尔紫罗兰计数器。评估了WT和5-LOX-/-用盐水或MPTP处理的垃圾伴侣的尼格拉尔部分。微胶质与被冲毁的细胞体和长期的分支过程观察到亚斯坦蒂亚尼格拉从盐水处理的小鼠（箭头）。激活的微胶质与圆细胞体和短，增厚的过程，观察到从MPTP处理的小鼠（箭头）的亚斯坦蒂亚尼格拉。酒吧=10微米。
图3。5-LOX对纹状TH的影响和有毒侮辱后的炎症。（A）通过西方对来自WT和5-LOX-/-给予盐水或MPTP（n=6-8/组）的同质化的西色体分析，对纹状TH蛋白水平进行了半定量测量。以光学密度测量的免疫活性被正常化为β行为素。*，p<0.05。 （B）同样，GFAP是通过西方污点分析WT和5-LOX-/-用盐水或MPTP（n=6-8/组）给予的同质化，并正常化为β行为物进行半定量测量的。*，p<0.05。 数据被注明为平均± SEM。
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Discussion
这种基因-环境相互作用研究的设计使我们能够获得关于5-LOX同位素在硝基质通路中的双重性质的新信息。通过执行HPLC测量盐水或MPTP治疗后，缺乏5-LOX异丙胺及其野生类型的垃圾伴侣的转基因药物的纹状单胺，我们能够注意到，其缺乏似乎在有毒条件下是保护性的（图1），但在正常情况下，缺乏酶会降低纹状多巴胺水平，并可能有害。因此，我们能够证明，5-LOX同位素有助于纹状多巴明神经在正常条件下，但可以造成损害后，有毒物质挑战4。
虽然进一步评估应有助于对LOX同位素在硝基毒性中的作用提供新的机械见解，但西方污点分析（图3）以及免疫组织化学研究（图2）显示，神经发炎标记至少部分地在暴露于MPTP的5-LOX异构体缺乏型群体中减弱。这些发现，使用经典的生化和病理学技术，表明5-LOX产品在微和天体胶质活化4的电能化中的关键作用。
根据所调查的基因-环境相互作用，除了胶质激活之外，还可能分析病理读数。在PD中特别重要的是在亚坦蒂亚尼格拉中失去多巴明神经元，以及潜在的病理积累和α-核素的聚集。沿着这条线，通过评估尼古细胞死亡（即 使用不偏不倚的固态细胞计数）和不溶性α-核素沉积32-35，监测了具有α-核素过度表达的转基因小鼠的毒性暴露的影响。
此处描述的范式中使用的 MPTP 剂量会产生轻微的病变，在纹状体和亚坦蒂亚尼格拉 （图 2和3）中产生轻微的病变，并导致轻微但显著的纹状损伤 （图 1）和胶质激活。通常，高剂量的毒剂用于产生强大的尼格勒多巴胺细胞损失和纹状多巴胺耗竭23，24，32，36-38，39。需要注意的是，MPTP 的毒性可能因供应商和批次而异：因此，剂量可能需要调整，以产生所需的病变。此外，必须考虑的其他因素是用于研究的动物的应变和性别。选择性对神经毒素的敏感性已在小鼠的不同背景菌株中表现出来，这种现象至少部分是由于促进退化的亚细胞通路的激活差异，包括JNK和c-Jun36-39。据报道，MPTP毒性的性别依赖差异也已报告为40，41，并可能有助于使用转基因小鼠的研究变化，其中两性都用于不良繁殖系。在这种情况下，使用性匹配的野生类型控制是至关重要的4。这种与性别相关的影响可能是WT小鼠在测试5-和12/15-LOX缺陷小鼠影响的实验之间观察到的病变差异的原因，其中一种性别用于一条线，另一种性别用于另一条线（图1）。对于基因-环境相互作用研究，不建议进行产生严重损伤的MPTP挑战（例如，纹状多巴胺减少80%>），因为这可能掩盖可能的遗传效应。
虽然MPTP暴露产生硝基细胞死亡3，42，纹状多巴胺耗竭3，复杂的I抑制43-45，胶质活化46，47， 已经报告在人类PD， 在小鼠中，产生稳定帕金森病（即 运动缺陷）和坦率的α-核素病理学（即 Lewy身体和中性体）的缓慢渐进退化在模型中不会发生完全回顾该疾病的标志特征。然而，必须指出，MPTP小鼠在理解导致PD相关神经退化的细胞下通路方面发挥了关键作用。例如，暴露范式的变化揭示了不同毒性的机制的激活：低剂量、亚急性暴露促进凋亡细胞死亡48， 免疫反应有限49， 而高剂量的急性治疗产生明显的微胶质活化50。事实上，在利用该模型进行疗效研究时，应考虑这些因素，与当前研究相关，以揭开潜在遗传危险因素的影响。
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Disclosures
没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由国家卫生研究院NIGMS 056062资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | for PD modeling |
| 4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | for immersion fixation |
| Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC acid extraction |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | for tissue homogenization |
| Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | for tissue homogenization |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | for tissue homogenization |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P5726 | for tissue homogenization |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | for Lowry protein assay |
| Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | for cryoprotection |
| Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | for IHC |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce/Thermo | 23225 | for protein determination |
| Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | for SDS-PAGE |
| Novex Sharp Prestained Protein Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | protein ladder |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for SDS-PAGE |
| Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | for SDS-PAGE |
| Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent | American MasterTech Scientific | SPM1057C | methanol for transfer |
| Sodium chloride (NaCl), ACS reagent | Sigma-Aldrich | S9888 | saline and buffers |
| Nonfat dry milk powder | Carnation | n/a | for immunoblotting |
| Ponceau S solution in 5% acetic acid | Sigma-Aldrich | P7170 | for immunoblotting |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal | Chemicon/Millipore | AB1542 | for immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | for immunoblotting |
| Anti-β Actin, rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | for immunoblotting |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal | Chemicon/Millipore | AB5804 | for immunofluorescence |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal | Covance Inc. | SMI-22R | for immunoblotting |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunoblotting |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated | Fisher Scientific | 31462 | for immunofluorescence |
| goat anti-sheep, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31480 | for immunofluorescence |
| goat anti-mouse, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31430 | for immunofluorescence |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce/Thermo | 34078 | for immunoblotting |
| CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in | Pierce/Thermo | 34089 | for immunoblotting |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Pierce/Thermo | 21059 | for immunoblotting |
| Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | C1909 | for IHC |
| Normal Donkey Serum | Millipore | S30-100ML | for IHC |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | for IHC |
| Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized | Sigma-Aldrich | A3294 | for IHC |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | for IHC |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | for IHC |
| Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | for IHC |
| VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | for IHC |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | for IHC |
| VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) | Vector Laboratories | PK-4001 | for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions ) |
| DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use) |
| Hydrogen peroxide, 30% | Sigma-Aldrich | 216763 | for quench step in IHC |
| Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | for IHC |
| Cresyl Violet Solution, Regular Strength | FD Neurotechnologies | PS102-01 | counterstain for Iba1 IHC |
| 95% Ethanol, reagent alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | dehydration for IHC |
| 100% Absolute ethanol | Mallinckrodt | 7019-10 | dehydration for IHC |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | destaining for IHC |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | clearing agent for IHC |
| DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | mounting medium for DAB IHC |
| O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium | American MasterTech Scientific | EMOCTCS | embeddium medium for cryostat cutting |
| Potassium permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | to decontaminate DAB solution |
| Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | for HPLC |
| 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | for HPLC |
| Homovanillic acid (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | for HPLC |
| Perchloric acid (PCA) - 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Sigma-Aldrich | 71504 | for HPLC |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | for HPLC |
| 1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | for HPLC |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | for HPLC |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 | for HPLC |
| HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) | Millipore | for HPLC | |
| 0.22 µm GSTF membrane | Millipore | for filtration | |
| Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC |
| Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414R | |
| ESA MD-150 reverse-phase column | ESA | ||
| HPLC Pump (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | |
| HPLC Autosampler (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | |
| Electrochemical detector | ESA | Coulochem III | |
| Guard Cell | ESA | 5020 | |
| Analytical Cell | ESA | 5011A | |
| Chromeleon software | Dionex | ||
| Eclipse E400 | Nikon | E400 | light/fluorescent microscope |
| Disposable mouse cage | Ancare | N10HT | |
| Microfilter top | Ancare | N10MBT | |
| 5-LOX- deficient mice | The Jackson Laboratory | 004155 | |
| 12/15-LOX-deficient mice | The Jackson Laboratory | 002778 |
References
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