Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نماذج التفاعل بين الجينات والبيئة لكشف آليات الحساسية في مرض باركنسون

Published: January 7, 2014 doi: 10.3791/50960
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

Summary

يمكن أن تولد يسوزيميس ليبوكسيجيناز (LOX) المنتجات التي قد تزيد أو تقلل من الاشتعال العصبي والتوليد العصبي. ويمكن لدراسة التفاعل بين الجينات والبيئة تحديد الآثار المحددة ل LOX isozyme. باستخدام نموذج 1-ميثيل-4-فينيل-1,2,3,6-رباعي هيدروبيريدين (MPTP) من تلف النيغروستريتال في اثنين من خطوط تحويل وراثيا نقص LOX isozyme يسمح للمقارنة بين مساهمة زوزيمي LOX على سلامة الدوبامين والالتهاب.

Abstract

وقد تورط نشاط ليبوكسيجيناز (LOX) في الاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر، ولكن آثاره في مرض باركنسون (PD) المسببة للأمراض هي أقل فهما. نماذج التفاعل بين الجينات والبيئة لها فائدة في كشف تأثير مسارات خلوية محددة في السمية التي قد لا يمكن ملاحظتها باستخدام نموذج مرض وراثي أو سام فقط وحده. لتقييم ما إذا كان LOX isozymes متميزة تسهم بشكل انتقائي في التنكس العصبي PD ذات الصلة، يمكن الطعن في الفئران المعدلة وراثيا(أي 5-LOX و 12/15-LOX ناقص) مع السم الذي يحاكي إصابة الخلية والموت في الاضطراب. هنا نصف استخدام السم العصبي، 1-ميثيل-4-فينيل-1،2،3،6-رباعي هيدرودريدين (MPTP)، الذي ينتج آفة نيجروستريتال لتوضيح المساهمات المتميزة من إيزوزيميس LOX إلى التنكس العصبي المتعلقة PD. استخدام MPTP في الماوس، والرئيسيات غير البشرية، راسخة لتلخيص الضرر nigrostriatal في PD. يتم قياس مدى الآفات الناجمة عن MPTP من خلال تحليل HPLC للدوبامين ونواتج الأيض وتحليله شبه الكمي لللطخة الغربية لم المخطط لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، وهو الإنزيم المقيد لمعدل تخليق الدوبامين. لتقييم العلامات الالتهابية ، والتي قد تظهر حساسية LOX انتقائية ، يتم إجراء البروتين الحمضي الرجفان الدبقية (GFAP) والكيمياء المناعية Iba-1 على أقسام الدماغ التي تحتوي على نيغرا substantia ، ويتم إجراء تحليل لطخة GFAP الغربية على متجانسات سترياتال. يمكن أن يوفر هذا النهج التجريبي رؤى جديدة في التفاعلات بين الجينات والبيئة الكامنة وراء الانحطاط النيغروستريتال وPD.

Introduction

استخدام نماذج التفاعل بين الجينات والبيئة يوفر نهجا لمحاكاة عوامل الخطر التي من المرجح أن تؤثر على مرض باركنسون مجهول السبب (PD) ويتيح فرصة لتمييز الرؤى الميكانيكية التي من غير المرجح أن يتم توضيحها باستخدام نظام وراثي أو سام وحده1,2. هنا نوضح هذه النقطة ونصف تطبيق نموذج الماوس 1-ميثيل-4-فينيل-1,2,3,6-رباعي هيدروبيريدين (MPTP) من الضمور النيغروستريتال3 لفهم انتقائية سمية ليبوكسيجيناز (LOX) نشاط الإيزيمي على الاشتعال العصبي والسمية4. في حين تم تقييم دور لLOX isozymes على نطاق واسع في الاضطرابات الطرفية5,6 وكذلك مرض CNS بما في ذلك السكتة الدماغية7 ومرض الزهايمر8,9, دور عائلة الايزوزيم في وظيفة nigrostriatal والانحطاط المتعلقة PD ليست مفهومة جيدا والدراسة يبرر. وMPTP neurotoxin يدل على انحطاط تفضيلي للمسار nigrostriatal ويتلخص في استنفاد الدوبامين سترياتال وفقدان الخلايا الدوبامين النيجرال التي تكمن وراء الإعاقات الحركية في المرضى PD10. في حين أن هذا النموذج لا يستنسخ الكادر الكامل من السلوكيات PD غير الحركية والحركية وصريح α-synuclein إيجابية علم الأمراض الجسم ليوي, فقد كان من المفيد لتوضيح الأهداف الميكانيكية الرواية التي تسهم في الضرر nigrostriatal والاختبار في مرحلة مبكرة الترجمية كما هو أفضل نموذج غير الباضعة المميزة المتاحة لإنتاج موثوق بها وفاة الخلايا النيجرال يرافقه فقدان الدوبامين ستريانال11-15. الاستخدام الواسع للفأرة MPTP، مع نماذج تتراوح بين الحادة، تحت الحادة إلىالمزمنة 16-18،وقد سمح لتوحيد الجرعات أن يؤدي إلى أضرار خفيفة إلى شديدة nigrostriatal19،20 مع تفعيل آليات مختلفة من السمية اعتمادا على نظام العلاج18،21،22. وبالتالي، فإن هذا يسمح "نافذة من الآفات" أن تكون مستهدفة التي قد تؤدي إلى تعزيز أو تقليل إصابة النيغروستريتال اعتمادا على العامل العلاجي أو نموذج المعدلة وراثيا المستخدمة23-25.

ومن الضروري أيضا لإجراء دراسات بيولوجية تحويلية واكتشافية التقنيات المستخدمة لتقييم الضرر والأدلة التي توفرها هذه الأساليب. لنموذج الماوس MPTP, المقاييس المقررة لتقييم الآفات هي قياس علامات لهجة الدوبامين سترياتال, بما في ذلك الدوبامين والأيض من قبل HPLC, وتحليل بقعة الغربية من هيدروكسيلاز التيروزين (TH), إنزيم الحد من معدل في تخليق الدوبامين, ومؤشرات الأحداث التنكسية مثل التنشيط الدبقية باستخدام تحليل لطخة الغربية والكيمياء المناعية4. على الرغم من أن هذه هي الكلاسيكية الكيميائية العصبية، والبيوكيميائية، والإجراءات النسيجية، والتقنيات توفير قراءات حاسمة وقابلة للاستنساخ على مدى الضرر داخل المسار الدوبامين nigrostriatal، تشير إلى آليات السمية، وثبت أن أدوات قيمة في فهم الأحداث التنكسية في PD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يجب أن تتم الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية وطرق العناية بالحيوان من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC). أجريت الدراسة الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها IACUC التابعة ل SRI International.

1. اقتناء وصيانة الفئران LOX ناقص

  1. شراء 5-LOX-ناقصة أو 12/15-LOX-نقص الفئران وسلالة كل منها والضوابط المتطابقة مع الجنس في سن 7-8 أسابيع والسماح لعدة أيام للتأقلم مع منشأة بعد الوصول.
  2. الحفاظ على الفئران في المساكن الجماعية على دورة 12 ساعة ضوء الظلام وإعطاء الغذاء ومياه الشرب الإعلانية libitum.

2. احتياطات MPTP، التخزين، التحضير، إزالة التلوث والتخلص

ملاحظة: وقد ثبت التسمم MPTP من التعرض عن طريق الوريد في البشر أن يسبب باركنسون10; MPTP هو ليبوفيلي للغاية ويمكن بسهولة عبور حاجز الدم في الدماغ26. وينبغي اتخاذ تدابير احترازية لضمان المناولة المأمونة وإزالة السموم والتخلص منها. التمثيل الغذائي ينطوي على خطوات متعددة بما في ذلك التحويل إلى 1-ميثيل-4-فينيل-2,3-dihydropyridinium بواسطة إنزيم مونوامين أوكسيداز B (MAO-B)27. يمكن استخدام مثبطات MAO-B في حالة التسمم البشري العرضي.

  1. التأكد من أن الموظفين لديهم التدريب المناسب على السلامة والتعامل قبل استخدام MPTP كما تمليه لجنة الصحة والسلامة في المؤسسة. يجوز لكل مؤسسة وضع وتنفيذ إجراءات التشغيل القياسية الخاصة بها لاستخدام MPTP ، استنادا إلى توصيات محددة بشكل شامل في الأدبيات17،22.
  2. قبل التحضير، دون معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بما في ذلك ما يلي: معطف المختبر المتاح أو بدلة الجسم الكامل، قفازات النتريل المزدوجة، قناع الجراحية، غطاء الشعر، نظارات السلامة، ويغطي الأحذية المتاح. وينبغي ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء إعداد MPTP، ونموذج الحقن و 72 ساعة بعد الحقن عند التعامل مع الحيوانات و / أو الفراش.
  3. إجراء العمليات الحسابية قبل التحضير. وينبغي اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية لكميات الزواية؛ وعادة ما يستخدم تسليم 100-150 ميكرولتر للفئران 25-30 غرام.
    1. لإعداد محلول MPTP 3 ملغ /مل في المالحة، وتطبيق عامل تصحيح (1.211 MPTP-HCl: 1.0 MPTP قاعدة حرة)؛ تركيز MPTP-HCl في السيارة المالحة هو 3.633 ملغ / مل.
    2. إعداد جميع المعدات والإمدادات والكواشف اللازمة لإعداد MPTP وإزالة التلوث التسرب المحتملة قبل التعامل مع السم العصبي.
  4. إزالة قارورة مصدر MPTP-HCl من موقع التخزين المناسب.
    ملاحظة: يجب الاحتفاظ MPTP في RT في قارورة مغلقة داخل حاوية ثانوية وتخزينها داخل خزانة مؤمنة، المسمى "MPTP".
    1. تغطية المنطقة المحيطة المقاييس مع منصات أو مناشف ورقية مبللة مع محلول التبييض 10٪ للحد من خطر من مسحوق مسكوب. احتفظ بالأنسجة ومحلول التبييض بنسبة 10٪ في مكان قريب كإجراء وقائي.
    2. باستخدام توازن تحليلي يقع في غطاء الدخان، تزن 50 ملغ من MPTP-HCl في قارورة زجاجية مع احتواء الثانوية التي تحتوي على 10٪ الأنسجة غارقة في التبييض. تسمية قارورة الزجاج "MPTP" مع التركيز والتاريخ.
    3. قارورة مصدر وثيق ومسح الخارج مع التبييض 10٪.
  5. أضف ببطء 13.763 مل من المالحة المعقمة إلى القارورة واغلق تماما للخلط. (الحل هو 3.633mg/ml MPTP-HCl.)
    1. في غطاء محرك السيارة، قم بتعقيم محلول MPTP بعناية عن طريق الترشيح باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر في قارورة حقن تحمل علامة داخل حاوية ثانوية مع أنسجة غارقة في التبييض بنسبة 10٪. تنظيف أي تسرب مع الأنسجة المنقوعة التبييض.
    2. التخلص بعناية من حادة وقارورة في حاوية الخطر البيولوجي المسمى بشكل مناسب. الحفاظ على حل MPTP في قارورة في الحاوية الثانوية مع الأنسجة المنقوعة بالتبييض لنقلها إلى غرفة إجراء الحيوانات.
      ملاحظة: لا حل MPTP الأوتوكلاف للتعقيم كما تبخيره هو خطر استنشاق.
  6. عودة قارورة مصدر MPTP إلى الحاوية الثانوية ومكان في موقع التخزين. إزالة التلوث ملعقة، مقياس تحليلي وسطح غطاء محرك السيارة لمدة 10 دقيقة باستخدام التبييض 10٪.

3. إدارة MPTP

  1. إعداد أقفاص المتاح مع الأغطية المثقبة microisolator القياسية التي تحتوي على بطانات البوليستر المصفاة ملحوظ "MPTP" (ناقص شواء الغذاء الأسلاك)، بطانات قفص المتاح، حبيبات الطعام قبل الرطب وهيدرجيل كمصدر للمياه. وزن جميع الحيوانات وحجم قياسي من 3 ملغ / مل MPTP في المالحة المطلوبة لحقن 15 ملغ / كغ.
    ملاحظة: الأيض MPTP يمكن الكشف عنها في إفرازات لمدة 3 أيام بعد الحقن28,29; ومع ذلك ، تفرز الفئران MPTP n-oxide ، وهي مشتقة غير سامة لا تعبر الأغشية بسبب الزهريةالمائية 30.
    1. ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية المذكورة أعلاه وعقد الفئران على لوحة امتصاص المتاح، وحقن السيارة المالحة أو محلول MPTP لجرعة 15 ملغم / كغ في تجويف داخل الصفاق (أي p.)، يوميا لمدة 4 أيام مع حقنة أنبوبية قياس 26 المتاح.
    2. لا خلاصة حقنة بعد الاستخدام; التخلص في حاوية مخصصة ومسمي MPTP حادة المخاطر البيولوجية. الحفاظ على 10٪ التبييض والأنسجة القريبة لتنظيف أي بالتنقيط عرضي.
  2. وضع الحيوانات حقنها مع MPTP في أقفاص المتاح، ما يصل إلى 5 الفئران في القفص الواحد، ومنزل على رفوف مفتوحة. لا تستخدم الرفوف التهوية.
    1. وضع MPTP استخدام لافتات على الرف الذي يحتوي على الفئران وباب غرفة السكن حتى 72 ساعة بعد الحقن الماضي.
      ملاحظة: تأكد من أن درجة حرارة غرفة السكن تتراوح بين 22.2 - 24.4درجة مئوية، حيث تعاني الفئران من انخفاض حرارة عابر يصل إلى 12h بعد تسمم MPTP. 31
    2. إزالة التلوث سطح العمل مع التبييض بعد كل استخدام (انظر الخطوة 2.8)، والتخلص من بقايا MPTP الحل بإضافة حجم يعادل 10٪ التبييض، وتجاهل محتويات والنفايات السائلة الخطرة بيولوجيا.
    3. تجاهل جميع معدات الوقاية الشخصية المستخدمة في سلة التخلص المخصصة. إذا لزم الأمر، رش مع تبييض 10٪ قبل التخلص منها.
  3. تحقق من الحيوانات بانتظام وتحديث الغذاء والماء مصدر يوميا خلال نموذج الحقن و 72 ساعة بعد الحقن الماضي. ملاحظة: على الرغم من أنه لا يتوقع حدوث تلوث في المنطقة المحيطة مباشرة خارج القفص، فإن هذه المنطقة تعامل بمحلول التبييض كإجراء وقائي (كما هو موضح في الخطوة 2-8). يجب توخي الحذر عند التعامل مع جميع الفئران والمعدات خلال هذه الفترة.
    1. بعد ثلاثة أيام من الحقن الأخير، تخلص من جميع الأقفاص والبطانات في كيس المخاطر البيولوجية المسمى بشكل مناسب. استئناف استخدام معدات الوقاية الشخصية العادية والسكن العادي للحيوانات؛ إزالة لافتات الباب والجرف.

4. حصاد الأنسجة

  1. قتل الحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم 7 أيام بعد الحقن MPTP الماضي. تشريح الدماغ على الفور على الجليد باستخدام قالب الدماغ المبردة مسبقا مع فتحات 1 ملم في الطائرة التاجية.
  2. تشريح المخطط من شريحة الدماغ الأمامي 2 مم سميكة على مستوى المفوض الأمامي.
    1. إزالة المناطق القشرية وشبه القشرية المحيطة باستخدام مشرط. أنسجة سترياتال تجميد المفاجئة من كل نصف الكرة الأرضية في أنبوب طرد دقيق منفصل 1.5 مل للتحليل الكيميائي العصبي أو الكيميائي الحيوي.
  3. كتلة ميدبراين / hindbrain في الطائرة التاجية على مستوى تحت المهاد الأمامي والأنسجة الغمر الإصلاح في محلول مائي 4٪ الفورمالديهايد.

5. معالجة الأنسجة

  1. عملية الكيمياء الحيوية
    1. تجانس الأنسجة المخططة من نصف الكرة الأرضية واحد باستخدام جهاز تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية في 200-μL تريس-EDTA تحلل العازلة (25mM تريس قاعدة، 1mM EDTA، 1:100 بروتياز والكوكتيلات المثبطة فوسفاتاز) ل10 نبضات في 10-12 هرتز والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4سC في 1000xg.
    2. يستنشق بعناية supernatant، وإعادة تشكيل بيليه في العازلة تحلل 150 ميكرولتر. وتستخدم كسور للتحليل الكيميائي الحيوي من قبل SDS-PAGE والنشاف الغربية.
      ملاحظة: استخدام بروتياز وفوسفاتاز العازلة التي تحتوي على مثبطات في غضون 1 ساعة من التحضير بسبب عدم الاستقرار في المحاليل المائية.
  2. عملية الكيمياء العصبية
    1. استخدم المخطط الذي تم تشريحه من نصف الكرة الأرضية الآخر من كل عينة مخزنة عند -80 درجة مئوية ل HPLC. تذوب الأنسجة سترياتال في أنابيب الميكروفون على الجليد، إضافة 500-ميكرولتر 0.3N حمض بيركلوريك (PCA) وتجانس باستخدام sonicator.
      ملاحظة: لجعل 100 مل من PCA 0.3N, قياس 90 مل ddH2O, إضافة إلى اسطوانة تخرج 100 مل, إضافة 2.58 مل من 70٪ PCA, وجلب إلى علامة 100 مل. يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت العينة في 4°C لمدة تصل إلى شهر واحد.
    2. سونيكاتي الأنسجة سترياتال في 500-ميكرولتر الجليد الباردة 0.3N PCA، ل10 نبضات في 10-12 هرتز ومكان على الجليد. لضمان التجانس، عينات سونيكاتي للمرة الثانية لمدة 10 ثانية، ثم الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة في 4سC في 16100xg.
    3. على الفور decant supernatant إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية. الهواء الجافة كسر بيليه في غطاء محرك السيارة.
    4. الحفاظ على supernatant في -80 درجة مئوية حتى استخدامها لقياس الدوبامين والأيض، 3،4-حمض ديهيدروكيفينيليستيك (DOPAC) وحمض الهوموفانيليك (HVA) من قبل HPLC مع الكشف عن الكهروكيميائية.
    5. مرة واحدة جافة، وإعادة تشكيل كسر بيليه في 0.5N NaOH (500 ميكرولتر)، وs sonicate لفترة وجيزة. تخزين إعادة تشكيلها بيليه كسر في 4°C حتى استخدامها لتحديد البروتين الكلي باستخدام طريقة لوري.
  3. عملية الكيمياء المناعية
    1. الغمر إصلاح كتل منتصف وهندستها الدماغ بين عشية وضحاها في محلول مائي 4٪ الفورمالديهايد و cryoprotect في حلول السكروز متدرج (10٪ في المالحة الفوسفات العازلة (0.01 M PBS; 0.138 م NaCl، 0.0027 M KCl، وddH2O، درجة الحموضة 7.4) لمدة 24 ساعة، ثم 30٪ في PBS حتى تغرق الأنسجة) عند 4 درجة مئوية. لطخة لفترة وجيزة كتل cryoprotected لإزالة محلول السكروز الزائدة، وتجميد على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. تقسيم ميكروتوم من كتل الدماغ التي تحتوي على منتصف وعقل متأخر في cryostat.
      1. إزالة الأنسجة من -80 درجة مئوية، والاعتدال في -16 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في cryostat، وجبل في وسائل الإعلام تضمين الأنسجة.
      2. جمع المقاطع التاجية في سمك 40 ميكرومتر في محلول بروتين التبريد (0.01M PBS مع 30٪ السكروز، 30٪ جلايكول الإيثيلين، درجة الحموضة 7.4) في -16 درجة مئوية. جمع الأنسجة بشكل متسلسل في 6 أنابيب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق على فترات 240 أم وتخزينها في -20 درجة مئوية.

6. الانتفاخ المناعي

  1. تحديد تركيز البروتين في كسر النتوءات الفائقة (أعدت على النحو المبين في القسم 5.1) من قبل المقايسة BCA.
  2. حساب التخفيف المطلوب لكل عينة لتسفر عن 10 ميكروغرام لكل بئر تسليمها في 20 ميكرولتر من الحجم.
  3. تمييع البروتين الفائق مع 4X Laemmli العازلة وخالص التجانس لتسفر عن 10 ميكروغرام البروتين في محلول 1X Laemmli العازلة. حساب المثال:
    1. تحديد التركيز النهائي للبروتين والحجم المطلوب. في هذه الحالة، مطلوب 10 ميكروغرام في 20 ميكرولتر (0.5 ملغم/مل).
    2. تحديد الحجم النهائي للمحلول البروتين اللازمة. على الرغم من أن 20 ميكرولتر مطلوبة للتحميل، يجب إعداد حجم إضافي (30 ميكرولتر).
    3. منذ الحجم النهائي والتركيز معروفة، وتركيز البروتين الكسر الفائق هو معروف (يحددها المقايسة BCA)، وحساب حجم البروتين الفائق المطلوب باستخدام المعادلة:
      Vsupernatant = (Vالنهائي × جيمالنهائي)/C فائقة
      وهكذا، لتركيز البروتين فائقة من 1.5 ملغ / مل،
      Vفائقة = (30 ميكرولتر × 0.5 ملغم/مل)/1.5 ملغ/مل
      Vفائقة = 10 ميكرولتر
    4. حساب كمية 4X Laemmli العازلة المطلوبة لتحقيق تركيز 1x في 30 ميكرولتر من حجم (30 ميكرولتر / 4 = 7.5 ميكرولتر). ملاحظة: يجب تخفيف 4X Laemmli العازلة إلى قوة 1X في إعداد العينة.
    5. حساب كمية من العازلة التجانس المطلوبة لتحقيق حجم إلى 30 ميكرولتر (والحصول على تركيز البروتين النهائي المطلوب من 0.5 ملغ / مل):
    6. إعداد عينة عن طريق الدوامة ثم pipetting 10 ميكرولتر من البروتين الفائق في 12.5 ميكرولتر من العازلة التجانس. إضافة 7.5 ميكرولتر من العازلة Laemmli 4X للحصول على حل عمل عينة 30 ميكرولتر وتركيز 0.5 ملغم / مل.
  4. إعداد جميع العينات باستخدام الإجراء الموصوف، دوامة ويغلي لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيق العلوي لمنع التسرب والفتح بسبب الضغط أثناء الغليان.
  5. بعد 5 دقائق، ضع على الفور على الجليد. تحميل 20 ميكرولتر من عينة حل العمل لكل هلام جيدا (10 ميكروغرام من البروتين). عينات بروتين منفصلة من قبل SDS-PAGE على هلام تريس غليسين 12٪.
    1. استخدام سلم البروتين الملون مسبقا لتأكيد الأوزان الجزيئية. تشغيل العازلة هو 25 mM تريس قاعدة، 192 mM الجليسين، 0.1٪ SDS، وddH2O، pH 8.3.
    2. بروتينات منفصلة عن طريق الكهتروفورسيس: تعمل عند 80 فولت لمسح الآبار (10 دقائق) و 125 فولت (حوالي ساعة واحدة؛ حتى ينفصل سلم البروتين تماما) لحل البروتينات.
  6. إجراء نقل البروتين إلى النيتروسليلوز باستخدام غشاء نيتروسيلولوس 0.2 ميكرومتر في مخزن نقل تريس الجليسين (25 mM Tris، 192 mM glycine، 0.04٪ SDS، 20٪ الميثانول وddH2O، pH 8.3) بين عشية وضحاها لمدة 40 فولت في 4 درجة مئوية.
  7. غسل البقع نيتروسيلولوس في 1x تريس المالحة (TS; 25mM تريس, 0.9٪ NaCl في ddH2O, درجة الحموضة 7.4) لمدة 10 دقيقة في RT. lncubate في بونسو S لمدة 5 دقائق ثم شطف في ddH2O لتوفير التحقق الخام من تحميل البروتين المكافئ. مسح الصورة ضوئيا للاحتفاظ بسجل لدفتر الملاحظات وإزالة الاحتواء باستخدام PBS.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، اغسل البقعة في ميلي-كيو أو ddH2O التي تحتوي على HCl (0.2٪) لحوالي 5 دقائق. تفحص للسجل. إزالة بقعة بونسو S من الغشاء عن طريق خطوة الحضانة اللاحقة (أي مكان في العازلة حجب).
  8. كتلة البقع في 5٪ مسحوق الحليب غير الدهني في TS لمدة 1 ساعة في RT واحتضان 24h في 4 درجة مئوية مع أرنب المضادة للتيروزين هيدروكسيلاز (1:1000)، المضادةβ-أكتين (1:200)؛ المضادة لGFAP (1:1000) في 5٪ الحليب TS.
  9. غسل البقع 3 × 5 دقيقة في TS مع 0.05٪ توين-20 و 1 × 5 دقيقة في TS، ثم احتضان في الأجسام المضادة الثانوية HRP-المقترنة (1:5000 في TS تحتوي على الحليب 5٪)، مطابقة لأنواع الأولية، لمدة 2 ساعة في RT.
  10. إعداد الركيزة chemiluminescent باستخدام كميات متساوية من حلول الإنارة والبيروكسيد وتطبيق لمدة 1-3 دقيقة. في غرفة مظلمة، ضع لطخة في كم بلاستيكي للتعرض للفيلم وفضح الفيلم. ثم يتم تطوير الفيلم باستخدام معالج أوتوماتيكي.
  11. بقع الشريط مع العازلة تجريد المتاحة تجاريا في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وغسل 3x 10 دقيقة في TS مع 0.05٪ توين-20، و 1x 10 دقيقة في TS ومن ثم إعادة بروب لتحميل السيطرة أو غيرها من البروتين من الفائدة.
  12. قياس الإشارات بواسطة برنامج Image J لقياسات الكثافة البصرية وتطبيعها إلى التحكم الداخلي في التحميل β-actin.

7. الكيمياء العصبية

  1. يتم إعداد الأنسجة للتحليل كما هو موضح أعلاه في القسم 5.2. يرجى الرجوع إلى الجدول 1 لوصفة المرحلة المتنقلة.
    ملاحظة: يجب أن تكون جميع الكواشف ≥99.0٪ نقية ودرجة HPLC. ضمان سلامة العازلة مع نظيفة، والأواني الزجاجية مخصصة والحانات اثارة. وينبغي استخدام العازلة المرحلة المتنقلة في غضون سبعة أيام من التحضير.
    1. وزن فوسفات ديهيدروجين وحمض الستريك، إضافة 1 لتر من DDH2O ومزيج في اسطوانة تخرج 2-L. تصفية الحل من خلال غشاء GSTF 0.22-μm.
      ملاحظة: هذا يزيد من استخراج الملوثات في الفوسفات وحمض الستريك، مما يساعد على تقليل التيارات الخلفية.
    2. إضافة OSA تليها الحل أسيتونيتريل وEDTA. إضافة درجة HPLC DDH2O إلى حوالي 1900 مل قبل ضبط درجة الحموضة إلى 3.0 مع حمض الفوسفوريك.
    3. إضافة درجة HPLC DDH2O إلى علامة 2-L، ثم تصب في قارورة 2-L. إضافة شريط اثارة مخصصة، وdgas المرحلة المتنقلة عن طريق تحريكه تحت فراغ لمدة 10 دقائق >.
  2. إعداد معايير الدوبامين, و DOPAC و HVA للمنحنيات القياسية. يتم إعداد حلول المخزون من المعايير في 1 ملغ / مل في 0.3 N PCA.
    1. وزن 12.4 ملغ من الدوبامين-HCl, وإضافة 10.0 مل من 0.3 N PCA لجعل 1 ملغ/مل الدوبامين.
    2. وزن 10.0 ملغ من DOPAC, وإضافة 10.0 مل من 0.3 N PCA لجعل 1 ملغ / مل DOPAC.
    3. وزن 10.0 ملغ HVA, وإضافة 10.0 مل من 0.3 N PCA لجعل 1 ملغ / مل HVA.
  3. إعداد حلول معيار العمل من حلول المخزون. وتستخدم معايير من خمس نقاط لتوليد منحنى التركيز.
    1. لقياس الدوبامين سترياتال, إعداد تركيزات قياسية من 12.5 نانوغرام / مل, 25 نانوغرام / مل, 50 نانوغرام / مل, 100 نانوغرام / مل, و 200 نانوغرام / مل.
    2. لsriatal DOPAC، وإعداد تركيزات قياسية من 2.5 نانوغرام / مل، 5 نانوغرام / مل، 10 نانوغرام / مل، 20 نانوغرام / مل، و 40 نانوغرام / مل.
    3. بالنسبة إلى سداسي الأطراف سداسي الأطراف، قم بإعداد تركيزات قياسية تبلغ 5 نانوغرام/مل، و10 نانوغرام/مل، و20 نانوغرام/مل، و40 نانوغرام/مل، و80 نانوغرام/مل.
    4. توليد معايير من خمس نقاط: تمييع 1 ملغ / مل محلول مخزون الدوبامين إلى 5 ميكروغرام / مل باستخدام 0.3N PCA. تمييع 1 ملغ / مل DOPAC حل الأسهم إلى 1 ميكروغرام / مل باستخدام 0.3N PCA، وتمييع 1 ملغ / مل محلول الأسهم HVA إلى 2 ميكروغرام / مل باستخدام 0.3N PCA.
    5. نقل 1 مل من الدوبامين 5 ميكروغرام / مل، 1 مل من 1 ميكروغرام / مل DOPAC، و 1 مل من 2 ميكروغرام / مل HVA في قارورة حجمية 25 مل وجلب الحجم إلى علامة 25 مل مع 0.3 N PCA.
      ملاحظة: تحتوي المعايير المختلطة في القارورة الحجمية على أعلى تركيز لمعايير النقاط الخمس: 200 نانوغرام/مل من الدوبامين، و40 نانوغرام/مل من DOPAC، و80 نانوغرام/مل من HVA.
    6. نقل 1 مل من المعايير المختلطة إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة نظيفة 1.5 مل. تنفيذ 1:1 المخفف التسلسلي أربع مرات لتوليد المعايير اللاحقة من أربع نقاط.
      1. على سبيل المثال، إلى 250 ميكرولتر من المعايير المختلطة، أضف 250 ميكرولتر من العينة العازلة ودوامة بدقة لإنتاج معايير مختلطة بنسبة 50٪ من التركيزات الأصلية؛ تكرار العملية حتى يتم تحقيق التخفيف المطلوب.
  4. إعداد نظام HPLC (مضخة، أوتومبلر، عكس المرحلة العمود (C18، 150×3.2 ملم، 3 ميكرومتر)). تطهير المضخة مع مرحلة متنقلة جديدة لتحل محل جميع الحلول السابقة في نظام HPLC وفقاعات الهواء المحاصرين مع مرحلة المحمول الطازجة. قم بتبريد الكواتومبلر إلى 4 درجات مئوية. قم بتدفئة العمود إلى 35 درجة مئوية، مما يقلل من الضغط الكلي.
    1. تعيين الجهد في -150 mV و 220 mV للأقطاب الكهربائية الأولى والثانية من الكاشف الكهروكيميائية، على التوالي. توازن النظام لمدة 2 ساعة على الأقل، وبين عشية وضحاها بشكل مثالي، مع مرحلة المحمول بمعدل تدفق 0.2 مل / دقيقة.
      ملاحظة: أثناء التوازن يجب تشغيل الخلايا ومراقبة قراءة الأساس. تشير القراءة المستقرة إلى أن النظام جاهز للاستخدام. لمدة ساعتين من مرحلة التوازن، والسماح للمرحلة المتنقلة للذهاب إلى حاوية النفايات بدلا من إعادة تدويرها. بعد هذه الفترة، يمكن إعادة تدوير المرحلة المتنقلة بين عشية وضحاها لتحقيق التوازن.
    2. بمجرد اكتمال التوازن، قم بتعديل معدل تدفق المرحلة المتنقلة إلى 0.6 مل/دقيقة. حقن 20 ميكرولتر من كل من المعايير من خمس نقاط.
  5. تذوب عينات سترياتال على الجليد، وحقن 2 × 20 ميكرولتر من كل عينة في نظام HPLC. استخدام المعايير في البداية وعشوائية في جميع أنحاء كل مجموعة من العينات سترياتال.
  6. استخدام البرنامج لتحليل المنطقة تحت الدوبامين, DOPAC, وقمم HVA التي تنتجها المعايير والعينات. تحديد التحليلات حسب وقت الاحتفاظ وقياسها من خلال مقارنة المنطقة تحت الذروة بمساحة منحنى 5 نقاط لمعيارها المقابل.
  7. إعداد جزء بيليه كما هو موضح في القسم 5.2.3. إجراء فحص البروتين لوري على بيليه سترياتال. ملاحظة: هذا المقايسة سوف قياس كمية البروتين الموجودة في عينات سترياتال في ملغ / مل; وتستخدم هذه المعلومات لتحديد تركيز نانوغرام / ملغ من التحليل.

8. الكيمياء المناعية

  1. GFAP/TH الفلورة المناعية المزدوجة
    1. إزالة الأنابيب التي تحتوي على منتصف الدماغ المقطعية من -20 درجة مئوية الفريزر وجلب إلى RT. إزالة أقسام الأنسجة التي تحتوي على نيغرا substantia من محلول التبريد في صينية تحتوي على برنامج تلفزيوني.
    2. ضع أقسام الأنسجة في إدراج البوليسترين مع قيعان شبكة البوليستر للكيمياء المناعية العائمة الحرة. غسل 3 × 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    3. نقل المقاطع إلى لوحة 96 جيدا مع حل كتلة 180 ميكرولتر (5٪ مصل الحمير العادي، 1٪ PVP، 1٪ BSA و 0.3٪ تريتون X-100 في PBS) في كل بئر. احتضان 40 دقيقة في RT.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الغسيل والحضانة مع هياج خفيف على شاكر.
    4. نقل المقاطع إلى الآبار التي تحتوي على محلول الأجسام المضادة الأولي (180 ميكرولتر لكل بئر). احتضان في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية، أرنب المضادة GFAP (1:1000) والأغنام المضادة للTH (1:400) المخفف في برنامج تلفزيوني مع 1٪ BSA و 0.3٪ TX-100، لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية. IgG من الأنواع الأولية بمثابة السيطرة السلبية على المناعة.
    5. احتضان في كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية (1:200 حمار المضادة للأرانب 568 و 1:200 FITC حمار المضادة للأغنام في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ TX-100). استخدام احباط لحماية الحل من الضوء أثناء التحضير والحضانة. احتضان في RT لمدة 2 ساعة.
      1. للسيطرة السلبية، أقسام الحضانة في IgG من الأنواع الأولية المخفف إلى نفس التركيز المستخدم للأجسام المضادة الأولية.
      2. غسل 2 × برنامج تلفزيوني و 1 × TS لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT. ماونت أقسام الأنسجة على الشرائح بالإضافة إلى الشرائح في تصاعد المتوسطة مع وصمة عار Hoechst و coverslip.
    6. احتضان في كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية (1:200 حمار المضادة للأرانب 568 و 1:200 FITC حمار المضادة للأغنام في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ TX-100). استخدام احباط لحماية الحل من الضوء أثناء التحضير والحضانة. احتضان في RT لمدة 2 ساعة.
    7. غسل 2 × برنامج تلفزيوني و 1 × TS لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT. ماونت أقسام الأنسجة على الشرائح بالإضافة إلى الشرائح في تصاعد المتوسطة مع وصمة عار Hoechst و coverslip.
    8. حماية الشرائح من الضوء والأكسدة حتى التصوير عن طريق تخزين في مربع الشريحة في 4 درجة مئوية.
    9. تحليل السيطرة السلبية أولا لتحديد مستوى الخلفية من الفلورسينس، ثم تقييم لالخمول المناعي الإيجابي باستخدام المجهر الفلورسنت.
  2. الكيمياء المناعية Iba1 مع هطول الأمطار الكروموجين
    1. إزالة الأنابيب التي تحتوي على منتصف الدماغ المقطعية من -20 درجة مئوية الفريزر وجلب إلى RT. إزالة أقسام الأنسجة التي تحتوي على نيغرا substantia من محلول التبريد في صينية تحتوي على برنامج تلفزيوني.
    2. ضع أقسام الأنسجة في إدراج البوليسترين للكيمياء المناعية العائمة الحرة. غسل أقسام 3 × 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني، ووضع أقسام مباشرة في لوحة 12 جيدا تحتوي على ما قبل ساخنة 10 mM حمض الستريك monohydrate، درجة الحموضة 9.0، 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، لاسترجاع epitope.
    3. لوحة باردة 20 دقيقة في RT. أقسام العودة لإدراج وغسل 3 × 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    4. نقل المقاطع إلى لوحة 96 بئر تحتوي على محلول حجب 180 ميكرولتر (10٪ مصل الماعز العادي، 1٪ BSA في PBS) لكل بئر، واحتضان 40 دقيقة في RT.
    5. نقل المقاطع إلى الآبار التي تحتوي على 180 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية المخففة (1:1000 في 1٪ BSA-PBS). حضانة بين عشية وضحاها في 4°C.
    6. نقل المقاطع إلى إدراج. غسل 3 × 5 دقيقة برنامج تلفزيوني وتطبيق الأجسام المضادة الثانوية البيوتينية (1:200 في 1.5٪ مصل طبيعي-PBS) لمدة 1 ساعة في RT.
    7. إعداد حل ABC 30 دقيقة قبل الاستخدام. غسل 3 × 5 دقيقة برنامج تلفزيوني ونقل إلى حل ABC لمدة 1 ساعة في RT.
    8. إعداد حل DAB في غطاء محرك السيارة. غسل 2x 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني و 1x 5 دقيقة في TS، واحتضان أقسام في DAB.
      1. تطوير لمدة 3-4 دقائق. يجب أن تظل السيطرة السلبية خفيفة اللون.
        ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان كما DAB هو مادة مسرطنة معروفة. وينبغي الحفاظ على حل من برمنغنات البوتاسيوم 0.2M في DDH2O لإزالة التلوث على مقربة في حالة التنقيط العرضي.
    9. شطف أقسام لفترة وجيزة في DDH2O، ثم في TS 3 × 5 دقيقة. جبل أقسام على الشرائح بالإضافة إلى الهواء الجاف بين عشية وضحاها في غطاء محرك السيارة الدخان.
    10. إزالة التلوث DAB النفايات مع حجم متساو من برمنغنات البوتاسيوم 0.2M في ddH2O، دوامة، واحتضان في غطاء الدخان بين عشية وضحاها قبل تخزين في سلة المهملات DAB المسمى بشكل مناسب في غطاء الدخان.
      ملاحظة: لا يزيل محلول التبييض خصائص الطفرات في DAB.
      1. إزالة التلوث من العناصر التي سيتم إعادة استخدامها (أي إدراج البوليسترين) وغسلها بالمنظفات.
    11. الجفاف / مضادةلاحتواء طفيفة مع كريسيل البنفسجي (السيرة الذاتية). جميع خطوات الجفاف / الغسيل هي 3 دقائق: الإيثانول 70٪، 95٪، 100٪، 95٪، ddH2O، CV (30 ثانية)، ddH20 × 2، 95٪ الإيثانول + حمض الخليك الجليدي (0.1٪) x 2، الإيثانول 100٪، والزيلين.
    12. Coverlip في distyrene-toluene-xylene تصاعد المتوسطة والجافة في غطاء محرك السيارة الدخان.
    13. لاحظ النشاط المناعي الإيجابي بواسطة المجهر الخفيف. IgG من الأنواع الأولية بمثابة السيطرة السلبية على المناعة.

9. الإحصاءات

  1. تقييم الاختلافات بين الوسائل من خلال تحليل الفرق في اتجاه واحد (ANOVA) لمقارنة الاختلافات بين النمط الجيني و ANOVA ثنائي الاتجاه لمقارنة الاختلافات بين النمط الجيني والعلاج السام. استخدام تحليل توكي HSD بعد مخصص عندما لوحظت الاختلافات من خلال اختبار ANOVA(ص≤0.05).
    ملاحظة: يتم إجراء التجارب (مع n = 6-9 فئران/مجموعة) مرتين على الأقل لضمان إمكانية إعادة الإنتاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذا النموذج التعرض للسموم يمكن أن تنتج كبيرة ويمكن الكشف عنها 20٪ استنفاد الدوبامين سترياتال في MPTP- مقابل الحيوانات التي تحقن المالحة. من المهم ملاحظة أن الكثير من MPTP المختلفة قد تسفر عن آفات أكثر أو أقل قليلا. وبالتالي ، من أجل دقة أفضل ، يوصى بإجراء تجربة أولية على فئران النمط البري قبل استخدامها في المعدلات عندما يتم استخدام الكثير من السموم العصبية الجديدة. استخدام الآفات خفيفة إلى معتدلة يسمح لتأثير المتحول إلى أن يلاحظ; قد تنتج آفة شديدة "تأثير الكلمة" مع إصابة قوية جدا لتوهين أو الضرر بحيث يحجب تأثير تغيير وراثي ضار. وكانت آثار MPTP على الدوبامين سترياتال مختلفة بشكل ملحوظ في الفئران 5-LOX isozyme ناقص, ولكن ليس 12/15-LOX الفئران نقص الايزوزيم (الشكل 1). وعلاوة على ذلك, مع هذه الأساليب, كنا قادرين على تمييز فرق كبير في مستويات الدوبامين بسبب نقص 5-LOX في الفئران المالحة المعالجة (الشكل 1).

Immunoblotting لTH وGFAP يسمح لتأكيد الضرر والاشتعال العصبي، على التوالي، على مستوى المخطط في الفئران البرية، وهو التأثير الذي تضاءل في المخطط 5-LOX نقص الايزوزيم(الشكلين 3A و 3B). الآفة هو أيضا ملحوظ على مستوى النيغرا تحتستانتيا (الشكل 2A و 2B). في نفس الفئران ، يمكن ملاحظة استنفاد الخلايا العصبية الإيجابية TH وزيادة النشاط المناعي GFAP باستخدام وضع العلامات المناعية المزدوجة التسمية(الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، رفع ملحوظ تنشيط microglial(أي Iba1 النشاط المناعي) في wildtype، ولكن ليس 5-LOX isozyme ناقص، الفئران هو واضح في نيغرا substantia بعد التعرض MPTP(الشكل 2B). وبالتالي ، يمكن أن يوفر نموذج MPTP أداة مفيدة لتقييم تأثير الاستعداد الوراثي للانحطاط والالتهاب الزنجي.

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 LOX الآثار الانتقائية isozyme على الدوبامين سترياتال بعد التحدي MPTP. (أ) استخدمت متجانسات سترياتال لقياس الدوبامين (DA) من قبل HPLC من WT و 5-LOX-/- littermates نظرا المالحة أو MPTP (ن = 6-8/group). ‡، يمثل تأثيرا كبيرا بسبب النمط الجيني؛ ص<0.05. *، يمثل تأثيرا كبيرا بسبب النمط الجيني والعلاج؛ ص<0.05. لم يلاحظ أي فرق كبير بسبب العلاج في الفئران 5-LOX-/- (n.s.) مما يشير إلى أن MPTP لم تنتج استنفاد DA سترياتال في هذا الخط المعدل وراثيا. (ب) استخدمت متجانسات سترياتال لقياس DA في WT و 12/15-LOX-/- littermates نظرا المالحة أو MPTP (ن = 6-9/group). لم يلاحظ فرق كبير في مستويات DA بسبب النمط الجيني. ولوحظ انخفاض كبير، ومشابه، بسبب العلاج MPTP في كلا النمطين الجينيين. *، ص<0.01. تظهر البيانات على أنها متوسط ± SEM.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم 5-LOX آثار isozyme على TH nigral وastroglia بعد التحدي MPTP. (أ) تم إجراء تلطيخ Immunofluorescence لTH (FITC؛ الأخضر) وGFAP (568؛ الأحمر) مناعيات في أقسام الدماغ nigral من WT و 5-LOX-/- littermates نظرا المالحة أو MPTP. يظهر عدد أقل من أجسام الخلايا الإيجابية TH (*) والخمول المناعي المعزز ل GFAP في مجموعة WT-MPTP. تم الكشف عن شريط = 25 ميكرومتر (ب) علم الأنسجة المناعية الكيميائية للإيبا-1 على microglia باستخدام DAB (الكروماتجين البني)؛ كانت مقاطع مضادة من قبل كريسيل البنفسجي. تم تقييم أقسام Nigral من WT و 5-LOX-/- زملاء القمامة المعالجين بالمحلول الملحي أو MPTP. يتم ملاحظة Microglia مع أجسام الخلايا العشوائية وعمليات التفريع الطويلة في نيجرا substantia من الفئران المعالجة بالملح (رؤوس الأسهم). تم ملاحظة microglia المنشط مع أجسام الخلايا المستديرة والعمليات القصيرة السميكة في نيغرا substantia من الفئران المعالجة MPTP (السهام). شريط = 10 ميكرومتر.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن 5-LOX آثار isozyme على TH سترياتال والتهابات بعد إهانة سامة. (أ) تم قياس مستويات بروتين سترياتال TH بشكل شبه كمي من خلال تحليلات البقع الغربية للتجانس من WT و 5-LOX-/- littermates نظرا للمالحة أو MPTP (ن = 6-8 /group). تم تطبيع النشاط المناعي ، الذي يقاس بالكثافة البصرية ، إلى β أكتين. *، ص<0.05. (ب) وبالمثل، تم قياس GFAP بشكل شبه كمي من خلال التحليلات الغربية للتجانس الستريتال من WT و 5-LOX-/- littermates المعطاة مع المالحة أو MPTP (ن = 6-8/group) وتطبيعها إلى β-actin. *، ص<0.05. تتم الإشارة إلى البيانات على أنها متوسط ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

سمح لنا تصميم دراسة التفاعل بين الجينات والبيئة هذه بالحصول على معلومات جديدة حول الطبيعة المزدوجة ل 5-LOX isozyme في المسار النيغروستريتال. من خلال أداء HPLC لقياس مونوامينات سترياتال بعد المعالجة المالحة أو MPTP في المعدلات التي تفتقر إلى 5-LOX isozyme وزمالات القمامة البرية الخاصة بهم ، تمكنا من ملاحظة أن نقصه يبدو وقائيا في ظل ظروف سامة(الشكل 1)، ولكن في ظل الظروف العادية ، يقلل نقص الإنزيم من مستويات الدوبامين المخططة وقد يكون ضارا. وهكذا، ونحن قادرون على إثبات أن 5-LOX isozyme يساهم في لهجة الدوبامين سترياتال في ظل الظروف العادية، ولكن يمكن أن تسهم في الضرر بعد التحديالسامة 4.

في حين ينبغي أن يضفي مزيد من التقييم رؤى ميكانيكية جديدة في دور LOX isozymes في سمية النيغروستريتال ، كشفت تحليلات البقع الغربية(الشكل 3)وكذلك الدراسات الكيميائية المناعية (الشكل 2)أن علامات التضخم العصبي كانت ، على الأقل جزئيا ، مخففة في الفوج 5-LOX ناقص الإيزوزيم المعرض ل MPTP. هذه النتائج، وذلك باستخدام التقنيات الكيميائية الحيوية الكلاسيكية والهسولوجية، تشير إلى دور حاسم من المنتجات 5-LOX في التقوية من تنشيط الدقيقة والذطرية4.

اعتمادا على التفاعل بين الجينات والبيئة التي تم التحقيق فيها ، يمكن تحليل القراءات المرضية بالإضافة إلى التنشيط الدبقية. من أهمية خاصة في PD هو فقدان الخلايا العصبية الدوبامين في نيجرا substantia وتراكم المرضية المحتملة وتجميع α سينوكلين. على طول هذا الخط ، تم رصد تأثير التعرض السام في الفئران المعدلة وراثيا مع فرط التعبير α سينوكلين من خلال تقييم موت الخلايا النيجرال(أي باستخدام عد الخلايا غير المتحيزة) وترسب α سينوكلين غير القابل للذوبان32-35.

جرعة MPTP المستخدمة في النموذج الموصوف هنا تنتج آفة خفيفة مع إصابة بسيطة ، ولكنها كبيرة ، سترياتال (الشكل 1) وتنشيط الدبقية في كل من المخطط ونقرا substantia (الشكلان 2 و 3). عادة, وتستخدم جرعات أعلى من السامة لإنتاج فقدان الخلايا الدوبامين nigral قوية واستنفاد الدوبامين سترياتال23,24,32,36-38,39. ومن المهم ملاحظة أن سمية MPTP يمكن أن تختلف بين البائعين والكثير؛ وبالتالي قد تحتاج الجرعات إلى تعديل لإنتاج الآفة المطلوبة. وعلاوة على ذلك، فإن العوامل الأخرى التي يجب النظر فيها هي سلالة وجنس الحيوانات المستخدمة في الدراسات. وقد أظهرت الحساسية الانتقائية للسم العصبي في سلالات خلفية متميزة من الفئران ، وهي ظاهرة ترجع ، على الأقل جزئيا ، إلى الاختلافات في تنشيط المسارات دون الخلوية التي تتوسط الانحطاط ، بما في ذلك JNK و c-Jun36-39. كما أبلغ عن وجود اختلافات تعتمد على الجنس في سمية MPTP40,41، وقد تسهم في التباين في الدراسات باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي يستخدم فيها كلا الجنسين لخطوط التكاثر السيئة. في مثل هذه الحالة ، يعد استخدام عناصر التحكم في النوع البري المطابق للجنس أمرا حاسما4. قد تفسر هذه الآثار المرتبطة بالجنس الفرق في الآفات الملاحظة في فئران WT بين التجارب التي تختبر تأثير الفئران الناقصة 5-و 12/15-LOX التي استخدم فيها جنس واحد لخط واحد وكلا الجنسين للآخر(الشكل 1). بالنسبة لدراسات التفاعل بين الجينات والبيئة، لا ينصح بتحدي MPTP الذي ينتج عنه إصابة شديدة(على سبيل المثال >80٪ انخفاض في الدوبامين المخطط) لأن هذا قد يخفي تأثيرا وراثيا محتملا.

في حين أن التعرض MPTP تنتج موت الخلية nigral3,42, استنفاد الدوبامين سترياتال3, معقد أناتثبيط 43-45, وتنشيط glial46,47 التي تم الإبلاغ عنها في PD الإنسان, في الماوس ، وهو انحطاط تدريجي ببطء التي تنتج باركنسونية مستقرة(أي العجز الحركي) والأمراض الصريحة α سينوكلين(أي أجسام ليوي ونيوريتس) تماما تلخيص السمات المميزة للمرض لا يحدث في النموذج. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن الماوس MPTP قد لعبت دورا حاسما في فهم المسارات دون الخلوية التي تسهم في التنكس العصبي ذات الصلة PD. التباين في نماذج التعرض ، على سبيل المثال ، قد كشف عن تفعيل آليات متميزة للسمية: التعرض للجرعة المنخفضة ، تحت الحاد يعزز موت الخلايا المبرمج48 مع استجابة مناعية محدودة49 في حين أن العلاج الحاد بجرعات أعلى ينتج تنشيطا صغيرا ملحوظا50. وينبغي في الواقع النظر في هذه العوامل عند استخدام نموذج دراسات الفعالية، وينبغي، فيما يتصل بالدراسة الحالية، كشف أثر عامل خطر وراثي محتمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يوجد شيء للكشف عنه.

Acknowledgments

وقد مولت هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة NIGMS 056062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01 counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt 7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

Tags

الطب، العدد 83، MPTP، الدوبامين، Iba1، TH، GFAP، ليبوكسيجيناز، المعدلة وراثيا، التفاعلات الجينية البيئية، الماوس، مرض باركنسون، التنكس العصبي، الاشتعال العصبي
نماذج التفاعل بين الجينات والبيئة لكشف آليات الحساسية في مرض باركنسون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R.,… More

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter