Summary
Lipoxygenase (LOX) isozymen kunnen producten genereren die neuro-inflammatie en neurodegeneratie kunnen verhogen of verminderen. Een gen-omgeving interactiestudie kan LOX isozym-specifieke effecten identificeren. Met behulp van het 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model van nigrostriatale schade in twee LOX isozym-deficiënte transgene lijnen maakt het mogelijk om de bijdrage van LOX-isozymen aan dopaminerge integriteit en ontsteking te vergelijken.
Abstract
Lipoxygenase (LOX) activiteit is betrokken bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, maar de effecten ervan bij de ziekte van Parkinson (PD) pathogenese zijn minder begrepen. Gen-omgeving interactiemodellen hebben nut bij het ontmaskeren van de impact van specifieke cellulaire routes in toxiciteit die mogelijk niet worden waargenomen met behulp van een alleen genetisch of toxicant ziektemodel alleen. Om te evalueren of verschillende LOX-isozymen selectief bijdragen aan PD-gerelateerde neurodegeneratie, kunnen transgene(d.w.z. 5-LOX en 12/15-LOX-deficiëntie) muizen worden uitgedaagd met een toxine dat celletsel en de dood in de aandoening nabootst. Hier beschrijven we het gebruik van een neurotoxine, 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), dat een nigrostriatale laesie produceert om de verschillende bijdragen van LOX-isozymen aan neurodegeneratie gerelateerd aan PD op te helderen. Het gebruik van MPTP bij muizen en niet-menselijke primaten is goed ingeburgerd om de nigrostriatale schade bij PD samen te vatten. De omvang van mptp-geïnduceerde laesie wordt gemeten door HPLC-analyse van dopamine en zijn metabolieten en semi-kwantitatieve westerse vlekanalyse van striatum voor tyrosinehydroxylase (TH), het snelheidsbeperkend enzym voor de synthese van dopamine. Om ontstekingsmarkers te beoordelen, die LOX isozymselectieve gevoeligheid kunnen aantonen, worden gliafibrillair zuur eiwit (GFAP) en Iba-1 immunohistochopathie uitgevoerd op hersensecties die substantia nigra bevatten, en GFAP Western blot-analyse wordt uitgevoerd op striatale homogenaten. Deze experimentele aanpak kan nieuwe inzichten verschaffen in gen-omgevingsinteracties die ten grondslag liggen aan nigrostriatale degeneratie en PD.
Introduction
Het gebruik van gen-omgevingsinteractiemodellen biedt een benadering om risicofactoren na te bootsen die waarschijnlijk de idiopathische ziekte van Parkinson (PD) beïnvloeden en biedt de mogelijkheid om mechanistische inzichten te onderscheiden die waarschijnlijk niet zullen worden opgehelderd door het gebruik van een genetisch of toxicant systeem alleen1,2. Hier illustreren we dit punt en beschrijven we de toepassing van het 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) muismodel van nigrostriatale degeneratie3 om de selectiviteit van lipoxygenase (LOX) isozyme-activiteit op neuro-inflammatie en toxiciteit4beter te begrijpen . Hoewel een rol voor LOX-isozymen op grote schaal is geëvalueerd bij perifere aandoeningen5,6 en de ziekte van CZS, waaronder beroerte7 en de ziekte van Alzheimer8,9,is de rol van de familie van isozymen in nigrostriatale functie en degeneratie gerelateerd aan PD niet goed begrepen en rechtvaardigt studie. Het MPTP-neurotoxine toont preferentiële degeneratie van de nigrostriatale route en vat de striatale dopaminedepletie en het nigrale dopaminerge celverlies samen dat ten grondslag liggen aan motorische stoornissen bij PD-patiënten10. Hoewel dit model niet de volledige cadre van niet-motorisch en motorisch PD-gedrag en frank α-synucleïne-positieve Lewy-lichaamspathologie reproduceert, is het nuttig geweest om nieuwe mechanistische doelen op te helderen die bijdragen aan nigrostriatale schade en voor translationele tests in een vroeg stadium, omdat het het best gekarakteriseerde niet-invasieve model is dat beschikbaar is om op betrouwbare wijze nigrale celdood te produceren, vergezeld van striataal dopamineverlies11-15. Breed gebruik van de MPTP-muis, met paradigma's variërend van acuut, subacute tot chronisch16-18, heeft het mogelijk gesteld om de dosering te standaardiseren om te resulteren in milde tot ernstige nigrostriatale schade19,20 met activering van verschillende toxiciteitsmechanismen, afhankelijk van het behandelingsregime18,21,22. Bijgevolg maakt dit het mogelijk om een 'venster van laesie' te richten dat kan leiden tot versterkt of verminderd nigrostriatal letsel, afhankelijk van het therapeutische middel of het transgene model dat23-25wordt gebruikt.
Ook essentieel voor translationele en ontdekkingsbiologiestudies zijn de technieken die worden gebruikt om schade te beoordelen en het bewijs dat dergelijke methoden leveren. Voor het MPTP-muismodel zijn gevestigde statistieken om laesies te evalueren meting van markers van striatale dopaminerge toon, inclusief dopamine en zijn metabolieten door HPLC, en westerse vlekanalyse van tyrosinehydroxylase (TH), het snelheidsbeperkende enzym in dopaminesynthese, en indicatoren van degeneratieve gebeurtenissen zoals gliaactivering met behulp van westerse vlekanalyse en immunohistochrie4. Hoewel dit klassieke neurochemische, biochemische en histologische procedures zijn, bieden de technieken kritische en reproduceerbare uitlezingen over de omvang van de schade binnen de nigrostriatale dopaminerge route, wijzen ze op toxiciteitsmechanismen en zijn ze waardevolle hulpmiddelen gebleken bij het begrijpen van degeneratieve gebeurtenissen in PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle dierprocedures en dierverzorgingsmethoden moeten worden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Usage Committee (IACUC) van de instelling. De hier beschreven studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door de IACUC van SRI International.
1. Verwerving en onderhoud van LOX-deficiënte muizen
- Koop 5-LOX-deficiënte of 12/15-LOX-deficiënte muizen en respectievelijke stam- en geslachtsgematchte controles op de leeftijd van 7-8 weken en laat enkele dagen toe voor acclimatisatie aan de faciliteit na aankomst.
- Houd muizen in groepshuisvesting op een licht-donkere cyclus van 12 uur en geef voedsel en drinkwater ad libitum.
2. MPTP voorzorgsmaatregelen, opslag, voorbereiding, ontsmetting en verwijdering
Opmerking: Het is aangetoond dat MPTP-intoxicatie door intraveneuze blootstelling bij mensen parkinsonisme veroorzaakt10; MPTP is zeer lipofiel en kan gemakkelijk de bloed - hersenbarrière passeren26. Er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om een veilige hantering, ontgifting en verwijdering te waarborgen. Het metabolisme omvat meerdere stappen, waaronder conversie naar 1-methyl-4-fenyl-2,3-dihydropyridinium door het enzym monoamineoxidase B (MAO-B)27. MAO-B-remmers kunnen worden gebruikt in geval van accidentele menselijke intoxicatie.
- Zorg ervoor dat het personeel de juiste veiligheids- en hanteringstraining heeft voordat u MPTP gebruikt, zoals voorgeschreven door het Gezondheids- en Veiligheidscomité van de instelling. Elke instelling kan haar eigen standaardbedrijfsprocedures voor het gebruik van MPTP vaststellen en toepassen , op basis van aanbevelingen die uitvoerig zijn uiteengezet in de literatuur17,22.
- Gebruik vóór de voorbereiding geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's), waaronder de volgende: wegwerplabjas of volledig lichaamspak, dubbele nitrilhandschoenen, chirurgisch masker, haarbedekking, veiligheidsbril en wegwerpschoenhoezen. De juiste PBM moet worden gedragen tijdens de bereiding van MPTP, het injectieparadigma en 72 uur na injectie bij het hanteren van dieren en/of beddengoed.
- Voer berekeningen uit voorafgaand aan de voorbereiding. Er moeten institutionele richtsnoeren voor doseringsvolumes worden gevolgd; levering van 100-150 μl wordt meestal gebruikt voor muizen van 25-30 g.
- Om een MPTP-oplossing van 3 mg/ml in zoutoplossing te bereiden, past u een correctiefactor toe (1.211 MPTP-HCl: 1.0 MPTP-vrije basis); de concentratie MPTP-HCl in zoutoplossing is 3,633 mg/ml.
- Bereid alle apparatuur, benodigdheden en reagentia voor die nodig zijn voor mptp-voorbereiding en mogelijke lekkagedecontaminatie voordat u het neurotoxine behandelt.
- Verwijder mptp-hcl bron flacon van de juiste opslaglocatie.
Opmerking: MPTP moet bij RT worden onderhouden in een gesloten flacon in een secundaire container en worden opgeslagen in een vergrendelde kast met het label "MPTP".- Bedek de omgevingsweegschalen met pads of papieren handdoeken bevochtigd met 10% bleekoplossing om het risico op gemorst poeder te verminderen. Houd uit voorzorg weefsels en 10% bleekoplossing in de buurt.
- Weeg met behulp van een analytische balans in een zuurkast 50 mg MPTP-HCl in een glazen flacon met secundaire insluiting die 10% met bleekwater doordrenkt weefsel bevat. Label de glazen flacon "MPTP" met concentratie en datum.
- Sluit de bronflacon en veeg de buitenkant af met 10% bleekmiddel.
- Voeg langzaam 13,763 ml steriele zoutoplossing toe aan de flacon en sluit volledig voor het mengen. (Oplossing is 3.633mg/ml MPTP-HCl.)
- Steriliseer in de kap de MPTP-oplossing zorgvuldig door filtratie met behulp van een filter van 0,22 μm in gelabelde injectieflacon in een secundaire container met 10% met bleekwater doordrenkt weefsel. Reinig elke lekkage met bleekwater.
- Gooi scherpen en flacon voorzichtig weg in een biogevaarlijke container met het juiste etiket. Onderhoud mptp-oplossing in flacon in de secundaire container met bleekwater doordrenkt weefsel voor transport naar de procedurekamer van dieren.
Opmerking: autoclaaf mptp-oplossing niet voor sterilisatie, omdat de verdamping ervan een inhalatiegevaar is.
- Breng mptp-bronflacon terug naar de secundaire container en plaats deze op de opslaglocatie. Ontsmet spatel, analytische schaal en kapoppervlak gedurende 10 minuten met 10% bleekmiddel.
3. MPTP-toediening
- Bereid wegwerpkooien met standaard microisolator geperforeerde deksels met polyester gefilterde liners gemarkeerd met "MPTP" (minus draadvoedselgrill), wegwerpkooivoeringen, pre-natte voedselkorrels en hydrogel als waterbron. Weeg alle dieren en registreer het volume van 3 mg/ml MPTP in zoutoplossing die nodig is voor injectie met 15 mg/kg.
Opmerking: MPTP-metabolieten zijn detecteerbaar in excreta gedurende 3 dagen na injectie28,29; muizen scheiden echter MPTP n-oxide uit, een niet-toxisch derivaat dat geen membranen kruist vanwege zijn hydrofilie30.- Draag alle hierboven genoemde PBM's en houd muizen vast boven een wegwerpabsorptiekussen, injecteer een zoutvoertuig of MPTP-oplossing voor een dosis van 15 mg/kg in de intraperitoneale holte (i.p.), dagelijks gedurende 4 dagen met een wegwerpspuit met 26 gauge tuberculine.
- Spuit niet opnieuw inkapsen na gebruik; gooi ze weg in een speciale en gelabelde MPTP biogevaarlijke sharps container. Houd 10% bleekmiddel en weefsels in de buurt om eventuele accidentele druppels te reinigen.
- Plaats dieren geïnjecteerd met MPTP in wegwerpkooien, tot 5 muizen per kooi, en huis op open rekken. Gebruik geen geventileerde rekken.
- Plaats MPTP-plakkaten op het rek met muizen en de deur van de behuizing tot 72 uur na de laatste injectie.
Opmerking: zorg ervoor dat de temperatuur van de woonkamer tussen 22,2 - 24,4oC ligt, omdat muizen voorbijgaande onderkoeling ervaren tot 12 uur na MPTP-intoxicatie. 32 - Ontsmet het werkoppervlak na elk gebruik met bleekmiddel (zie stap 2.8), gooi de overgebleven MPTP-oplossing weg door toevoeging van een volume-equivalent van 10% bleekmiddel en gooi de inhoud weg als biogevaarlijk vloeibaar afval.
- Gooi alle gebruikte PBM's weg in een speciale afvalbak. Spuit indien nodig met 10% bleekmiddel voor verwijdering.
- Plaats MPTP-plakkaten op het rek met muizen en de deur van de behuizing tot 72 uur na de laatste injectie.
- Controleer dieren regelmatig en ververs de voedsel- en waterbron dagelijks tijdens de injectie en 72 uur na de laatste injectie. Opmerking: hoewel er geen verontreiniging wordt verwacht in het gebied direct rond de buitenkant van de kooi, wordt dit gebied uit voorzorg behandeld met de bleekoplossing (zoals beschreven in stap 2.8). Wees voorzichtig bij het hanteren van alle muizen en apparatuur tijdens deze periode.
- Gooi drie dagen na de laatste injectie alle kooien en voeringen weg in een biogevaarlijke zak met het juiste etiket. Hervat het gebruik van gewone PBM's en normale huisvesting voor dieren; deur- en plankbordjes verwijderen.
4. Weefsel oogsten
- Euthanaseer dieren door cervicale dislocatie 7 dagen na de laatste MPTP-injectie. Ontleed onmiddellijk hersenen op ijs met behulp van voorgekoelde hersenvorm met 1 mm sleuven in het coronale vlak.
- Ontleed het striatum van een voorhersenenschijf van 2 mm dik ter hoogte van de voorste commissuur.
- Verwijder omliggende corticale en subcorticale gebieden met behulp van een scalpel. Snap-freeze striataal weefsel van elke hemisfeer in een aparte 1,5 ml microcentrifugebuis voor neurochemische of biochemische analyse.
- Blokkeer midbrain/hindbrain in het coronale vlak ter hoogte van anterieure hypothalamus en onderdompelingsfix weefsel in 4% formaldehyde waterige oplossing.
5. Weefselverwerking
- Proces voor biochemie
- Homogeniseer striataal weefsel van één hemisfeer met behulp van een ultrasone celverstoorder in 200-μL Tris-EDTA-lysisbuffer (25mM Tris-basis, 1mM EDTA, 1:100 protease en fosfataseremmercocktails) voor 10 pulsen bij 10-12 Hz en gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij 4oC bij 1000xg.
- Aspireer het supernatant voorzichtig en reconstitueer de pellet in een 150-μl lysisbuffer. Breuken worden gebruikt voor biochemische analyse door SDS-PAGE en Western blotting.
Opmerking: gebruik protease en fosfataseremmer-bevattende buffer binnen 1 uur na bereiding als gevolg van instabiliteit in waterige oplossingen.
- Proces voor neurochemie
- Gebruik striatum ontleed van andere hemisfeer van elk monster opgeslagen bij -80 °C voor HPLC. Ontdooi striatale weefsels in microfuge buizen op ijs, voeg 500-μl 0,3N perchloric acid (PCA) toe en homogeniseer met behulp van sonicator.
Opmerking: Om 100 ml 0,3N PCA te maken, meet u 90 ml ddH2O, voegt u toe aan een maatcilinder van 100 ml, voegt u 2,58 ml 70% PCA toe en brengt u de 100 ml-markering. Deze monsterbuffer kan maximaal een maand bij 4°C worden bewaard. - Sonicaat striataal weefsel in 500-μl ijskoud 0,3N PCA, voor 10 pulsen bij 10-12 Hz en op ijs plaatsen. Om homogeniteit te garanderen, soniceer monsters een tweede keer gedurende 10 seconden en centrifugeer vervolgens gedurende 12 minuten bij 4oC bij 16.100xg.
- Decanteer supernatant onmiddellijk tot 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80°C. Droog de pelletfractie aan de lucht in de kap.
- Houd het supernatant op -80°C tot gebruik voor meting van dopamine en zijn metabolieten, 3,4-dihydroxyfenynazijnzuur (DOPAC) en homovanillic zuur (HVA) door HPLC met elektrochemische detectie.
- Eenmaal droog, reconstitueer de pelletfractie in 0,5N NaOH (500 μL) en soniceer kort. Bewaar gereconstitueerde pelletfractie bij 4°C tot gebruik voor bepaling van het totale eiwit volgens de Lowry-methode.
- Gebruik striatum ontleed van andere hemisfeer van elk monster opgeslagen bij -80 °C voor HPLC. Ontdooi striatale weefsels in microfuge buizen op ijs, voeg 500-μl 0,3N perchloric acid (PCA) toe en homogeniseer met behulp van sonicator.
- Proces voor immunohistochie
- Immersion-fix mid- en hind-brain blokken 's nachts in 4% formaldehyde waterige oplossing en cryoprotect in gesorteerde sacharose oplossingen (10% in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (0,01 M PBS; 0,138 M NaCl,0,0027M KCl, en ddH 2 O, pH 7,4) gedurende 24 uur, dan 30% in PBS. Kort vlek cryobeschermde blokken om overtollige sacharose-oplossing te verwijderen, bevriezen op droog ijs en bewaren bij -80 °C tot gebruik.
- Microtome doorsnede van hersenblokken met midden- en achterhersenen in een cryostaat.
- Verwijder weefsels van -80°C, equilibreren bij -16°C gedurende 1 uur in cryostaat en monteer in weefselinbeddingsmedia.
- Verzamel coronale secties met een dikte van 40 μm in cryoprotectant oplossing (0,01M PBS met 30% sacharose, 30% ethyleenglycol, pH 7,4) bij -16°C. Verzamel weefsel serieel in 6 microcentrifugebuizen van 1,5 ml met intervallen van 240 um en bewaar bij -20°C.
6. Immunoblotting
- Bepaal de eiwitconcentratie in striatale supernatantfractie (bereid zoals beschreven in rubriek 5.1) door middel van BCA-test.
- Bereken de verdunning die nodig is voor elk monster om 10 μg per put te leveren in 20 μl volume.
- Verdun supernatans eiwit met 4X Laemmli buffer en homogenisatie buffer om 10 μg eiwit op te leveren in 1X Laemmli bufferoplossing. Voorbeeld berekening:
- Bepaal de uiteindelijke concentratie van eiwitten en volume die nodig is. In dit geval is 10 μg in 20 μl (0,5 mg/ml) vereist.
- Bepaal het uiteindelijke volume van de benodigde eiwitoplossing. Hoewel 20 μl nodig is voor het laden, moet extra volume worden bereid (30 μl).
- Aangezien het uiteindelijke volume en de concentratie bekend zijn en de concentratie van de eiwitsupernatantfractie bekend is (bepaald door de BCA-test), berekent u het volume van het benodigde eiwitsupernatant met behulp van de vergelijking:
Vsupernatant = (Vfinale x Cfinale)/C supernatant
Bij een supernatans eiwitconcentratie van 1,5 mg/ml
Vsupernatans = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
Vsupernatans = 10 μl - Bereken de hoeveelheid 4X Laemmli-buffer die nodig is om een 1x-concentratie in 30 μl volume (30 μl / 4 = 7,5 μl) op te leveren. Opmerking: 4X Laemmli-buffer moet worden verdund tot 1x sterkte in het monsterpreparaat.
- Bereken de hoeveelheid homogenisatiebuffer die nodig is om het volume op 30 μl te brengen (en de gewenste uiteindelijke eiwitconcentratie van 0,5 mg/ml te verkrijgen):
- Bereid het monster voor door vortexen en spuit vervolgens 10 μl eiwitsupernatans in 12,5 μl homogenisatiebuffer. Voeg 7,5 μl 4X Laemmli-buffer toe voor een monsteroplossing van 30 μl en een concentratie van 0,5 mg/ml.
- Bereid alle monsters volgens de beschreven procedure, vortex en kook gedurende 5 minuten.
Opmerking: Gebruik microcentrifugebuizen met schroeftop om lekkage en opening als gevolg van druk tijdens het koken te voorkomen. - Na 5 min, onmiddellijk op ijs leggen. Laad 20 μl monsteroplossing per gelput (10 μg eiwit). Afzonderlijke eiwitmonsters door SDS-PAGE op een 12% Tris-glycine gel.
- Gebruik een voorbevlekte eiwitladder voor bevestiging van moleculaire gewichten. Running buffer is 25 mM Tris-base, 192 mM glycine, 0,1% SDS en ddH2O, pH 8,3.
- Afzonderlijke eiwitten door elektroforese: loop op 80 V om de putten te zuiveren (10 min) en 125 V (ongeveer 1 uur; totdat de eiwitladder volledig is gescheiden) om de eiwitten op te lossen.
- Voer eiwit-naar-nitrocellulose overdracht uit met behulp van 0,2 μm nitrocellulose membraan in Tris-glycine transferbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,04% SDS, 20% methanol en ddH2O, pH 8,3) 's nachts bij 40 V bij 4°C.
- Was nitrocellulosevlekken in 1x Tris zoutoplossing (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl in ddH2O, pH 7,4) gedurende 10 min bij RT. incubate in Ponceau S gedurende 5 min en spoel vervolgens af in ddH2O om een ruwe verificatie van gelijkwaardige eiwitbelasting te bieden. Scan de afbeelding om de record voor notebook te behouden en vast te houden met PBS.
Opmerking: U kunt ook vlek wassen in Milli-Q of ddH2O met HCl (0,2%) gedurende ongeveer 5 minuten. Scan naar record. Verwijder ponceau s-vlek uit het membraan door de volgende incubatiestap (d.w.z. plaats in de blokkeerbuffer). - Blokkeer vlekken in 5% vetvrij melkpoeder in TS gedurende 1 uur bij RT en incubeer 24 uur bij 4ºC met konijn anti-tyrosine hydroxylase (1:1000),anti-β-actine (1:200); anti-GFAP (1:1000) in 5% melk-TS.
- Was vlekken 3 x 5 min in TS met 0,05% Tween-20 en 1 x 5 min in TS, incubeer vervolgens in HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1:5000 in TS met 5% melk), afgestemd op de soort van de primaire, gedurende 2 uur bij RT.
- Bereid chemiluminescent substraat met gelijke hoeveelheden lichtgevende en peroxide-oplossingen en breng gedurende 1-3 minuten aan. Plaats in een donkere kamer vlek in een plastic hoes voor filmblootstelling en stel bloot aan film; film wordt vervolgens ontwikkeld met behulp van een automatische processor.
- Stripvlekken met in de handel verkrijgbaar stripbuffer bij 37°C gedurende 30 min, was 3x 10 min in TS met 0,05% Tween-20, en 1x 10 min in TS en reprobe dan voor beladingscontrole of ander interessant eiwit.
- Kwantificeer de signalen door Image J software voor optische dichtheid metingen en normaliseer naar de interne beladingsregeling β–actin.
7. Neurochemie
- Weefsel voor analyse wordt bereid zoals hierboven beschreven in rubriek 5.2. Raadpleeg tabel 1 voor het recept voor mobiele fasen.
Opmerking: Alle reagentia moeten ≥99,0% zuiver en van HPLC-kwaliteit zijn. Zorg voor bufferintegriteit met schoon, speciaal glaswerk en roerstangen. Mobiele fasebuffer moet binnen zeven dagen na de voorbereiding worden gebruikt.- Weeg het dihydrogeenfosfaat en citroenzuur, voeg 1 L ddH2O toe en meng in een 2-L gegradueerde cilinder. Filtreer de oplossing door een GSTF-membraan van 0,22 μm.
Opmerking: Dit maximaliseert de extractie van verontreinigingen in het fosfaat en citroenzuur, wat helpt om achtergrondstromen te minimaliseren. - Voeg de OSA toe gevolgd door de acetonitril en EDTA oplossing. Voeg HPLC-klasse ddH2O toe aan ongeveer 1900 ml voordat u de pH aanpast tot 3,0 met fosforzuur.
- Voeg HPLC-klasse ddH2O toe aan de 2-L-markering en giet deze vervolgens in een kolf van 2 L. Voeg een speciale roerstaaf toe en ontgass de mobiele fase door deze > 10 minuten onder vacuüm te roeren.
- Weeg het dihydrogeenfosfaat en citroenzuur, voeg 1 L ddH2O toe en meng in een 2-L gegradueerde cilinder. Filtreer de oplossing door een GSTF-membraan van 0,22 μm.
- Bereid de normen voor dopamine en DOPAC en HvA voor op standaardcurves. Standaardoplossingen worden bereid met 1 mg/ml in 0,3 N PCA.
- Weeg 12,4 mg dopamine-HCl en voeg 10,0 ml 0,3 N PCA toe om 1 mg/ml dopamine te maken.
- Weeg 10,0 mg DOPAC en voeg 10,0 ml 0,3 N PCA toe om 1 mg/ml DOPAC te maken.
- Weeg 10,0 mg HVA en voeg 10,0 ml 0,3 N PCA toe om 1 mg/ml HVA te maken.
- Bereid werkende standaardoplossingen voor vanuit de voorraadoplossingen. Vijfpuntsnormen worden gebruikt om een concentratiecurve te genereren.
- Bereid voor de meting van striatale dopamine standaardconcentraties van 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml en 200 ng/ml voor.
- Bereid voor striatale DOPAC standaardconcentraties van 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml en 40 ng/ml.
- Bereid voor striatale HVA standaardconcentraties van 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml en 80 ng/ml.
- Genereer vijfpuntsnormen: verdun 1 mg/ml dopaminevoorraadoplossing tot 5 μg/ml met 0,3N PCA. Verdun 1 mg/ml DOPAC-stamoplossing tot 1 μg/ml met 0,3N PCA en verdun 1 mg/ml HVA-stamoplossing tot 2 μg/ml met 0,3N PCA.
- Breng 1 ml 5 μg/ml dopamine, 1 ml 1 μg/ml DOPAC en 1 ml 2 μg/ml HVA over in een maatkolf van 25 ml en breng het volume op 25 ml met 0,3 N PCA.
Opmerking: De gemengde normen in de volumetrische kolf bevatten de hoogste concentratie van de vijfpuntsnormen: 200 ng/ml dopamine, 40 ng/ml DOPAC en 80 ng/ml HVA. - Breng 1 ml van de gemengde normen over in schone microcentrifugebuizen van 1,5 ml. Voer vier keer 1:1 seriële verdunning uit om de daaropvolgende vierpuntsnormen te genereren.
- Voeg bijvoorbeeld tot 250 μl van de gemengde normen 250 μl monsterbuffer en vortex grondig toe om gemengde normen te produceren bij 50% van de oorspronkelijke concentraties; herhaal het proces totdat de gewenste verdunningen zijn bereikt.
- Bereid het HPLC-systeem voor (pomp, autosampler, omgekeerde fasekolom (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). Reinig de pomp met een nieuwe mobiele fase om alle eerdere oplossingen in het HPLC-systeem en opgesloten luchtbellen te vervangen door een frisse mobiele fase. Koel de autosampler af tot 4°C. Verwarm de kolom tot 35°C, wat de totale druk vermindert.
- Stel de spanning in op -150 mV en 220 mV voor respectievelijk de eerste en tweede elektroden van de elektrochemische detector. Equilibreert het systeem gedurende ten minste 2 uur, en idealiter 's nachts, met de mobiele fase bij een debiet van 0,2 ml/min.
Opmerking: Tijdens equilibratie moeten de cellen worden ingeschakeld en moet de basislijnmeting worden gecontroleerd. Stabiele aflezing geeft aan dat het systeem klaar is voor gebruik. Laat de mobiele fase gedurende de twee uur van de equilibratiefase in een afvalcontainer gaan in plaats van deze te recirculeren. Na deze periode kan de mobiele fase 's nachts worden gerecycled voor equilibratie. - Zodra de equilibratie is voltooid, past u het mobiele fasedebiet aan op 0,6 ml/min. Injecteer 20 μl van elk van de vijfpuntsnormen.
- Stel de spanning in op -150 mV en 220 mV voor respectievelijk de eerste en tweede elektroden van de elektrochemische detector. Equilibreert het systeem gedurende ten minste 2 uur, en idealiter 's nachts, met de mobiele fase bij een debiet van 0,2 ml/min.
- Ontdooi striatale monsters op ijs en injecteer 2 x 20 μl van elk monster in het HPLC-systeem. Gebruik standaarden aan het begin en willekeurig in elke set striatale monsters.
- Gebruik de software om het gebied onder dopamine, DOPAC en HVA pieken geproduceerd door de normen en monsters te analyseren. Identificeer analyten op retentietijd en meet door het piekgebied te vergelijken met dat van de 5-puntscurve voor de overeenkomstige standaard.
- Bereid pelletfractie zoals beschreven in punt 5.2.3. Voer een Lowry eiwittest uit op de striatale pellet. Opmerking: Deze test meet de hoeveelheid eiwit in de striatale monsters in mg/ml; deze informatie wordt gebruikt om de ng/mg-concentratie analyt te bepalen.
8. Immunohistochie
- GFAP/TH dubbele immunofluorescentie
- Verwijder buisjes met doorsnede midbrain uit de vriezer van -20°C en breng ze naar RT. Verwijder weefselsecties met substantia nigra uit cryopreservatieve oplossing in een bak met PBS.
- Plaats weefselsecties in polystyreen inzetstukken met polyester mesh bodems voor vrij zwevende immunochemie. Was 3 x 5 min in PBS.
- Breng secties over naar 96-put plaat met 180-μl blokoplossing (5% normaal ezelsserum, 1% PVP, 1% BSA en 0,3% Triton X-100 in PBS) in elke put. Incubeer 40 min bij RT.
Opmerking: Alle was- en incubatiestappen worden uitgevoerd met lichte agitatie op de shaker. - Breng secties over naar putten die de primaire antilichaamoplossing bevatten (180 μl per put). Incubeer in primaire antilichaamcocktail, konijn anti-GFAP (1:1000) en schapen anti-TH (1:400) verdund in PBS met 1% BSA en 0,3% TX-100, gedurende 24 uur bij 4°C. IgG van de primaire soort dient als de negatieve immunostaining controle.
- Incubeer in secundaire antilichaamcocktail (1:200 ezel anti-konijn 568 en 1:200 FITC ezel anti-schapen in PBS met 0,1% TX-100). Gebruik folie om de oplossing te beschermen tegen licht tijdens de bereiding en incubatie; incubeer bij RT gedurende 2 uur.
- Voor een negatieve controle, incubeer secties in IgG van de primaire soort verdund tot dezelfde concentratie als gebruikt voor de primaire antilichamen.
- Was 2 x PBS en 1 x TS gedurende elk 5 min bij RT. Monteer weefselsecties op plus dia's in montagemedium met Hoechst-vlek en afdeklip.
- Incubeer in secundaire antilichaamcocktail (1:200 ezel anti-konijn 568 en 1:200 FITC ezel anti-schapen in PBS met 0,1% TX-100). Gebruik folie om de oplossing te beschermen tegen licht tijdens de bereiding en incubatie; incubeer bij RT gedurende 2 uur.
- Was 2 x PBS en 1 x TS gedurende elk 5 min bij RT. Monteer weefselsecties op plus dia's in montagemedium met Hoechst-vlek en afdeklip.
- Bescherm dia's tegen licht en oxidatie tot beeldvorming door ze op te slaan in een schuifdoos bij 4°C.
- Analyseer eerst de negatieve controle om het achtergrondniveau van fluorescentie te bepalen en evalueer vervolgens op positieve immunoreactiviteit met behulp van fluorescerende microscopie.
- Iba1 immunohistochie met chromageenprecipitatie
- Verwijder buisjes met doorsnede midbrain uit de vriezer van -20°C en breng ze naar RT. Verwijder weefselsecties met substantia nigra uit cryopreservatieve oplossing in een bak met PBS.
- Plaats weefselsecties in polystyreen inserts voor vrij zwevende immunochemie. Was de secties 3 x 5 min in PBS en plaats de secties rechtstreeks in een 12-putplaat met voorverwarmd 10 mM citroenzuurmonohydraat, pH 9,0, 80°C gedurende 30 minuten, voor het ophalen van epitoop.
- Koelplaat 20 min bij RT. Breng de secties terug naar de inzetstukken en was 3 x 5 min in PBS.
- Breng secties over naar een plaat met 96 putjes met 180-μl blokkeeroplossing (10% normaal geitenserum, 1% BSA in PBS) per put en incubeer 40 min bij RT.
- Breng secties over naar putten die 180-μl verdund primair antilichaam bevatten (1:1000 in 1% BSA-PBS). Incubeer 's nachts bij 4°C.
- Secties overbrengen naar wisselplaten. Was 3 x 5 min PBS en breng biotinylated secundair antilichaam (1:200 in 1,5% normaal serum-PBS) aan gedurende 1 uur bij RT.
- Bereid ABC-oplossing 30 minuten voor gebruik. Was 3 x 5 min PBS en breng over naar ABC oplossing gedurende 1 uur bij RT.
- Bereid DAB-oplossing in afzuigkap. Was 2x 5 min in PBS en 1x 5 min in TS, en incubeer secties in DAB.
- Ontwikkel gedurende 3-4 minuten. Negatieve controle moet licht van kleur blijven.
Opmerking: voer deze stap uit in de zuurkast, aangezien DAB een bekende kankerverwekkende stof is. Een oplossing van 0,2 M kaliumpermanganaat in ddH2O voor ontsmetting moet in de nabijheid worden bewaard in geval van accidentele druppels.
- Ontwikkel gedurende 3-4 minuten. Negatieve controle moet licht van kleur blijven.
- Spoel de secties kort af in ddH2O en vervolgens in TS 3 x 5 min. Monteer secties op plus glijbanen en droog 's nachts aan de lucht in de afzuigkap.
- Ontsmet DAB-afval met een gelijk volume van 0,2 M kaliumpermanganaat in ddH2O, vortex en incubeer 's nachts in een zuurkast voordat u het opslaat in een goed gelabelde DAB-afvalbak in een zuurkast.
Opmerking: Bleekoplossing elimineert de mutagene eigenschappen van DAB niet.- Ontsmet te hergebruiken voorwerpen (d.w.z. polystyreen inzetstukken) en was met wasmiddel.
- Dehydrateer/counterstain licht met Cresyl violet (CV). Alle uitdrogings-/wasstappen zijn 3 min: ethanol 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 seconden), ddH20 x 2, 95% ethanol + ijsazijn (0,1%) x 2, 100% ethanol en xyleen.
- Deklip in distyreen-tolueen-xyleen montagemedium en droog in zuurkast.
- Observeer positieve immunoreactiviteit door een lichtmicroscoop. IgG van de primaire soort dient als de negatieve immunostaining controle.
9. Statistieken
- Beoordeel verschillen tussen middelen door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) om verschillen tussen genotype en door tweerichtings ANOVA te vergelijken om verschillen tussen genotype en toxicant behandeling te vergelijken. Gebruik tukey's HSD post hoc analyse wanneer verschillen worden waargenomen door ANOVA testen(p≤0.05).
Opmerking: experimenten (met n = 6-9 muizen/groep) worden minimaal twee keer uitgevoerd om reproduceerbaarheid te garanderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit toxine blootstelling paradigma kan produceren een significante en detecteerbare 20% striatale dopamine uitputting in MPTP- vs. zoutoplossing geïnjecteerde dieren. Het is belangrijk op te merken dat verschillende partijen MPTP iets meer of minder laesie kunnen opleveren; dus, voor een betere precisie, wordt een voorlopig experiment bij wildtype muizen aanbevolen voorafgaand aan gebruik in transgenics wanneer een nieuwe partij neurotoxine wordt gebruikt. Het gebruik van milde tot matige laesie maakt het mogelijk om impact van het transgene waar te nemen; een ernstige laesie kan een "vloereffect" veroorzaken met letsel dat te robuust is om te verzachten of zo schadelijk is dat het het effect van een schadelijke genetische verandering overschaduwt. De effecten van MPTP op striatale dopamine waren significant verschillend bij 5-LOX isozyme-deficiënte muizen, maar niet bij de 12/15-LOX isozyme-deficiënte muizen (Figuur 1). Bovendien konden we met deze methoden een significant verschil in dopamineniveaus vaststellen als gevolg van het 5-LOX-tekort bij met zoutoplossing behandelde muizen (figuur 1).
Immunoblotting voor TH en GFAP maakte het mogelijk om respectievelijk schade en neuro-inflammatie te bevestigen op het niveau van het striatum bij wilde muizen, een effect dat werd verminderd in het 5-LOX isozyme-deficiënte striatum (Figuren 3A en 3B). De laesie is ook waarneembaar op het niveau van de substantia nigra (figuur 2A en 2B). Bij dezelfde muizen is de uitputting van TH-positieve neuronen en verhoogde GFAP-immunoreactiviteit waarneembaar met behulp van dual-label immunofluorescente etikettering (Figuur 2A). Bovendien, duidelijk verhoogde microgliale activering (d.w.z. Iba1 immunoreactiviteit) bij wildtype, maar niet 5-LOX isozym-deficiëntie, muizen is zichtbaar in de substantia nigra na MPTP blootstelling (Figuur 2B). Het MPTP-model kan dus een nuttig hulpmiddel zijn om de impact van genetische aanleg voor nigrale degeneratie en ontsteking te beoordelen.
Figuur 1. LOX isozym-selectieve effecten op striatale dopamine na MPTP uitdaging. (A) Striatale homogenaten werden gebruikt om dopamine (DA) te meten door HPLC uit WT en 5-LOX-/- nestgenoten kregen zoutoplossing of MPTP (n=6-8/groep). ‡, markeert een significant effect als gevolg van genotype; p<0,05. *, markeert een significant effect als gevolg van genotype en behandeling; p<0,05. Er werd geen significant verschil als gevolg van de behandeling waargenomen bij 5-LOX-/- muizen (n.s.) wat erop wijst dat MPTP geen striatale DA-depletie in deze transgene lijn heeft veroorzaakt. (B) Striatale homogenaten werden gebruikt om DA te meten in WT en 12/15-LOX-/- nestgenoten die zoutoplossing of MPTP kregen (n=6-9/groep). Er werd geen significant verschil in DA-spiegels als gevolg van genotype waargenomen. Een significante, en soortgelijke, vermindering als gevolg van MPTP behandeling werd opgemerkt in beide genotypen. *, blz.<0.01. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM.
Figuur 2. 5-LOX isozyme effecten op nigrale TH en astroglia na MPTP uitdaging. (A) Immunofluorescentiekleuring voor TH (FITC; groen) en GFAP (568; rood) immunoreactiviteiten werd uitgevoerd in nigrale hersensecties van WT en 5-LOX-/- nestgenoten die zoutoplossing of MPTP kregen. Minder TH-positieve cellichamen (*) en verbeterde GFAP-immunoreactiviteit zijn zichtbaar in de WT-MPTP-groep. Bar = 25 μm. (B) Immunohistochemische histologie voor de Iba-1 op microglia werd gedetecteerd met DAB (bruin chromatgeen); secties werden tegengehouden door Cresyl violet. Nigrale secties van WT en 5-LOX-/- nestgenoten behandeld met zoutoplossing of MPTP werden beoordeeld. Microglia met geramde cellichamen en lange, vertakkende processen worden waargenomen in substantia nigra van met zoutoplossing behandelde muizen (pijlpunten). Geactiveerde microglia met afgeronde cellichamen en korte, verdikte processen, werd waargenomen in substantia nigra van MPTP-behandelde muizen (pijlen). Bar = 10 μm.
Figuur 3. 5-LOX isozym effecten op striatale TH en inflammatoire na toxische belediging. (A) Striatale TH-eiwitniveaus werden semi-kwantitatief gemeten door westerse vlekanalyses van homogenaat uit WT en 5-LOX-/- nestgenoten die zoutoplossing of MPTP (n=6-8/groep) kregen. Immunoreactiviteit, gemeten aan de hand van optische dichtheid, werd genormaliseerd tot β-actine. *, blz.<0,05. (B) Evenzo werd GFAP semi-kwantitatief gemeten door westerse vlekanalyses van striataal homogenaat uit WT en 5-LOX-/- nestgenoten met zoutoplossing of MPTP (n=6-8/groep) en genormaliseerd tot β-actine. *, blz.<0,05. Gegevens worden genoteerd als gemiddelde ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontwerp van deze gen-omgeving interactiestudie stelde ons in staat om nieuwe informatie te verkrijgen over de dubbele aard van het 5-LOX isozym in de nigrostriatale route. Door HPLC uit te voeren om striatale monoaminen te meten na een zoutoplossing- of MPTP-behandeling in transgenics zonder het 5-LOX-isozyme en hun wildtype nestgenoten, konden we opmerken dat het tekort ervan beschermend lijkt te zijn onder toxische omstandigheden(figuur 1),maar onder normale omstandigheden vermindert het ontbreken van het enzym de striatale dopamineniveaus en kan het schadelijk zijn. Zo kunnen we aantonen dat het 5-LOX isozyme onder normale omstandigheden bijdraagt aan de striatale dopaminerge toon, maar kan bijdragen aan schade na toxicant challenge4.
Hoewel verdere evaluatie nieuwe mechanistische inzichten zou moeten geven in de rol van LOX-isozymen in nigrostriatale toxiciteit, bleek uit westerse vlekanalyses (figuur 3) en immunohistochemische studies (figuur 2) dat neuro-inflammatiemarkers ten minste gedeeltelijk werden verzwakt in het 5-LOX isozyme-deficiënte cohort dat aan MPTP werd blootgesteld. Deze bevindingen, met behulp van klassieke biochemische en histologische technieken, wijzen op een cruciale rol van 5-LOX-producten bij potentiëring van micro- en astrogliaactivering4.
Afhankelijk van de onderzochte gen-omgevingsinteractie kunnen pathologische uitlezingen naast gliaactivering worden geanalyseerd. Van bijzonder belang bij PD is verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra en mogelijk pathologische accumulatie en aggregatie van α-synucleïne. Langs deze lijn is de impact van blootstelling aan giftige stoffen bij transgene muizen met α-synucleïne-overexpressie gemonitord door evaluatie van nigrale celdood(d.w.z. met behulp van onbevooroordeelde stereologische celtelling) en onoplosbare α-synucleïnedepositie32-35.
De MPTP-dosis die wordt gebruikt in het hier beschreven paradigma produceert een milde laesie met bescheiden, maar significante, striatale letsel (figuur 1) en gliaactivering in zowel striatum als substantia nigra (figuren 2 en 3). Meestal worden hogere doses van het toxische product gebruikt om robuust nigral dopaminerge celverlies en striatale dopamine-uitputting te produceren23,24,32,36-38,39. Het is belangrijk op te merken dat de toxiciteit van MPTP kan variëren tussen leveranciers en partijen; bijgevolg kunnen doses moeten worden aangepast om de gewenste laesie te produceren. Andere factoren waarmee rekening moet worden gehouden, zijn de stam en het geslacht van de dieren die voor de studies worden gebruikt. Selectieve gevoeligheid voor het neurotoxine is aangetoond in verschillende achtergrondstammen van muizen, een fenomeen dat ten minste gedeeltelijk te wijten is aan verschillen in activering van subcellulaire routes die degeneratie bemiddelen, waaronder JNK en c-Jun36-39. Geslachtsafhankelijke verschillen in MPTP-toxiciteit zijn ook gemeld40,41, en kunnen bijdragen aan variabiliteit in studies met transgene muizen waarin beide geslachten worden gebruikt voor slecht-fokken lijnen. In een dergelijk geval is het gebruik van geslachtsgematchte wildtypebesturingselementen van cruciaal belang4. Dergelijke geslachtsgerelateerde effecten kunnen het verschil in laesie bij de WT-muizen verklaren tussen experimenten waarbij de impact van 5- en 12/15-LOX-deficiënte muizen waarbij het ene geslacht voor de ene lijn werd gebruikt en beide geslachten voor de andere (figuur 1). Voor gen-omgeving interactie studies, een MPTP uitdaging die ernstige verwonding produceert(bijv. >80% vermindering van striatale dopamine) wordt niet aanbevolen als dit een mogelijk genetisch effect kan maskeren.
Terwijl MPTP blootstelling produceert nigrale celdood3,42, striatale dopamine depletie3, complex Iremming 43-45, en glia activatie46,47 die zijn gemeld in menselijke PD, in muis, een langzaam progressieve degeneratie die stabiel parkinsonisme produceert(d.w.z. motorische tekorten) en frank α-synucleïne pathologie(d.w.z. Lewy lichamen en neurieten) volledig recapitulerende kenmerken van de ziekte. Het is echter belangrijk op te merken dat de MPTP-muis een cruciale rol heeft gespeeld bij het begrijpen van subcellulaire trajecten die bijdragen aan PD-gerelateerde neurodegeneratie. Variatie in blootstellingsparadigma's heeft bijvoorbeeld de activering van verschillende toxiciteitsmechanismen aan het licht gebracht: blootstelling met een lage dosis, subacute bevordert apoptotische celdood48 met een beperkte immuunrespons49, terwijl acute behandeling met hogere doses een duidelijke microgliale activering produceert50. Dergelijke factoren moeten inderdaad in aanmerking worden genomen bij het gebruik van het model voor werkzaamheidsstudies en, relevant voor de huidige studie, om de impact van een potentiële genetische risicofactor te ontmaskeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er valt niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health NIGMS 056062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | for PD modeling |
| 4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | for immersion fixation |
| Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC acid extraction |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | for tissue homogenization |
| Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | for tissue homogenization |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | for tissue homogenization |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P5726 | for tissue homogenization |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | for Lowry protein assay |
| Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | for cryoprotection |
| Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | for IHC |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce/Thermo | 23225 | for protein determination |
| Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | for SDS-PAGE |
| Novex Sharp Prestained Protein Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | protein ladder |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for SDS-PAGE |
| Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | for SDS-PAGE |
| Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent | American MasterTech Scientific | SPM1057C | methanol for transfer |
| Sodium chloride (NaCl), ACS reagent | Sigma-Aldrich | S9888 | saline and buffers |
| Nonfat dry milk powder | Carnation | n/a | for immunoblotting |
| Ponceau S solution in 5% acetic acid | Sigma-Aldrich | P7170 | for immunoblotting |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal | Chemicon/Millipore | AB1542 | for immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | for immunoblotting |
| Anti-β Actin, rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | for immunoblotting |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal | Chemicon/Millipore | AB5804 | for immunofluorescence |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal | Covance Inc. | SMI-22R | for immunoblotting |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunoblotting |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated | Fisher Scientific | 31462 | for immunofluorescence |
| goat anti-sheep, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31480 | for immunofluorescence |
| goat anti-mouse, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31430 | for immunofluorescence |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce/Thermo | 34078 | for immunoblotting |
| CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in | Pierce/Thermo | 34089 | for immunoblotting |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Pierce/Thermo | 21059 | for immunoblotting |
| Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | C1909 | for IHC |
| Normal Donkey Serum | Millipore | S30-100ML | for IHC |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | for IHC |
| Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized | Sigma-Aldrich | A3294 | for IHC |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | for IHC |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | for IHC |
| Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | for IHC |
| VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | for IHC |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | for IHC |
| VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) | Vector Laboratories | PK-4001 | for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions ) |
| DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use) |
| Hydrogen peroxide, 30% | Sigma-Aldrich | 216763 | for quench step in IHC |
| Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | for IHC |
| Cresyl Violet Solution, Regular Strength | FD Neurotechnologies | PS102-01 | counterstain for Iba1 IHC |
| 95% Ethanol, reagent alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | dehydration for IHC |
| 100% Absolute ethanol | Mallinckrodt | 7019-10 | dehydration for IHC |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | destaining for IHC |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | clearing agent for IHC |
| DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | mounting medium for DAB IHC |
| O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium | American MasterTech Scientific | EMOCTCS | embeddium medium for cryostat cutting |
| Potassium permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | to decontaminate DAB solution |
| Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | for HPLC |
| 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | for HPLC |
| Homovanillic acid (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | for HPLC |
| Perchloric acid (PCA) - 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Sigma-Aldrich | 71504 | for HPLC |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | for HPLC |
| 1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | for HPLC |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | for HPLC |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 | for HPLC |
| HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) | Millipore | for HPLC | |
| 0.22 µm GSTF membrane | Millipore | for filtration | |
| Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC |
| Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414R | |
| ESA MD-150 reverse-phase column | ESA | ||
| HPLC Pump (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | |
| HPLC Autosampler (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | |
| Electrochemical detector | ESA | Coulochem III | |
| Guard Cell | ESA | 5020 | |
| Analytical Cell | ESA | 5011A | |
| Chromeleon software | Dionex | ||
| Eclipse E400 | Nikon | E400 | light/fluorescent microscope |
| Disposable mouse cage | Ancare | N10HT | |
| Microfilter top | Ancare | N10MBT | |
| 5-LOX- deficient mice | The Jackson Laboratory | 004155 | |
| 12/15-LOX-deficient mice | The Jackson Laboratory | 002778 |
References
- Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
- Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
- Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C.
- Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
- Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
- Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
- Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
- van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
- Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
- Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
- Bove, J., Perier, C.
- Beal, M. F.
- Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S.
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
- Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
- Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
- Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
- Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
- Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
- Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
- Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
- Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
- Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
- Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
- Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
- Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
- Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
- Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
- Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
- Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
- Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
- Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
- Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
- Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
- Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
- Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
- Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
- Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
- Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
- Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
- Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
- Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P.
- Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
- Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
- Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
- Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
- Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).
