Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Генно-экологические модели взаимодействия для разоблачения механизмов восприимчивости при болезни Паркинсона

Published: January 7, 2014 doi: 10.3791/50960
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

Summary

Lipoxygenase (LOX) изозимы могут генерировать продукты, которые могут увеличить или уменьшить нейровоспламенение и нейродегенерации. Исследование взаимодействия генно-экологической среды может выявить эффекты, связанные с LOX isozyme. Использование 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP) модель нигостриатального повреждения в двух ЛОКС изозим-дефицит трансгенных линий позволяет сравнить вклад ЛОКС изозимов на дофаминергической целостности и воспаления.

Abstract

Lipoxygenase (LOX) деятельность была вовлечена в нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, но его последствия в болезни Паркинсона (PD) патогенеза менее понятны. Модели взаимодействия генной среды имеют полезность в разоблачении воздействия конкретных клеточных путей на токсичность, которое не может наблюдаться только с помощью модели генетических или токсических заболеваний. Для оценки, если различные LOX isozymes выборочно способствовать PD связанных нейродегенерации, трансгенных(т.е. 5-LOX и 12/15-LOX дефицит) мышей могут быть оспорены с токсином, который имитирует травмы клеток и смерти в беспорядке. Здесь мы описываем использование нейротоксина, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP), который производит нигростриятическое поражение, чтобы прояснить различные вклады LOX изозимы в нейродегенерации, связанные с PD. Использование MPTP в мыши, и нечеловеческих приматов, хорошо создана для повторения нигростриятального повреждения в PD. Степень MPTP-индуцированного поражения измеряется анализом HPLC допамина и его метаболитов и полуколичествительным западным анализом помарки стриатума для гидроксилазы тирозина (TH), ограничивающего скорость фермента для синтеза допамина. Для оценки воспалительных маркеров, которые могут продемонстрировать LOX изозим селективной чувствительности, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и Иба-1 иммуногистохимии выполняются на участках мозга, содержащих substantia nigra, и GFAP Западный анализ помарки выполняется на триатальных гомогенатов. Этот экспериментальный подход может дать новое представление о генно-антеманых взаимодействиях, лежащих в основе нигростриатальной дегенерации и PD.

Introduction

Использование моделей взаимодействия генно-экологической среды обеспечивает подход к имитации факторов риска, которые могут повлиять на идиопатической болезни Паркинсона (PD) и дает возможность различить механистические идеи, которые вряд ли будут выяснены с помощью генетической или токсикологическойсистемы только 1,2. Здесь мы иллюстрировать этот момент и описать применение 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP) мыши модель нигростриатальнойдегенерации 3, чтобы лучше понять избирательность липоксигеназы (LOX) изозима деятельности на нейровоспламенениеи токсичность 4. Хотя роль LOX isozymes была широко оцененав периферических расстройств 5,6, а также болезни ЦНС, включаяинсульт 7 и болезнь Альцгеймера8,9, роль семьи изозимов в нигостриаальной функции и дегенерации, связанные с PD не очень хорошо понимается и требует изучения. MPTP нейротоксин демонстрирует преференцианую дегенерацию нигростриатального пути и recapitulates стриатального истощения допамина и нигральной дофаминергической потери клеток, которые лежат в основе двигательных нарушений у пациентов PD10. Хотя эта модель не воспроизводит полный кадр немоторных и моторных PD поведения и откровенный α-синуклеин-положительной патологии тела Леви, было полезно, чтобы прояснить новые механистические цели, которые способствуют nigrostriatal повреждения и на ранней стадии трансляционного тестирования, как это лучше всего характеризуется неинвазивной модели доступны для надежного производства нигриальной клеточной смерти сопровождается striatal допаминапотери 11-15. Широкое использование mpTP мыши, с парадигмами, начиная от острой, подостралидо хронической 16-18, позволило для стандартизации дозирования, чтобы привести к легкой до тяжелой нигостриатальнойповреждения 19,20 с активацией различных механизмов токсичности в зависимости отрежима лечения 18,21,22. Следовательно, это позволяет "окно поражения", которые будут направлены, что может привести к повышению или снижению нигростриатальной травмы в зависимости от терапевтического агента или трансгенноймодели, используемой 23-25.

Кроме того, важное значение для трансляционных и открытий биологических исследований являются методы, используемые для оценки ущерба и доказательств, таких методов. Для модели мыши MPTP, установленные метрики для оценки поражения являются измерение маркеров стриатального дофаминергического тона, в том числе допамина и его метаболитов HPLC, и западный анализ помарки тирозин гидроксилазы (TH), ограничивающий скорость фермент в синтезе допамина, ипоказатели дегенеративных событий, таких как глиальная активация с использованием анализа западных помарк и иммунофимистики 4. Хотя это классические нейрохимические, биохимические и гистологические процедуры, методы обеспечивают критические и воспроизводимые считывания о степени повреждения в нигостриатального дофаминергического пути, указывают механизмы токсичности, и оказались ценными инструментами в понимании дегенеративных событий в PD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Все процедуры и методы ухода за животными должны быть одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию животных (IACUC). Описанное здесь исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами, установленными МАКУК НИИ Интернэшнл.

1. Приобретение и техническое обслуживание мышей с дефицитом LOX

  1. Покупка 5-LOX-дефицит или 12/15-LOX-дефицит мышей и соответствующих штаммов и секс-соответствующих элементов управления в возрасте 7-8 недель и позволяют несколько дней для акклиматизации объекта после прибытия.
  2. Поддержание мышей в группе жилья на 12-ч светло-темный цикл и дать пищу и питьевую воду объявление libitum.

2. Меры предосторожности, хранения, подготовки, обеззараживания и удаления MPTP

Примечание: MPTP интоксикации от внутривенного воздействия у людей было показано, вызывают паркинсонизм10; MPTP является весьма липофильной и может легко пересечь гемово-мозговой барьер26. Следует принять меры предосторожности для обеспечения безопасного обращения, детоксикации и удаления. Его метаболизм включает в себя несколько шагов, включая преобразование в 1-метил-4-фенил-2,3-дигидропиридиний фермента моноаминоксидазы B (MAO-B)27. Ингибиторы МАО-В могут быть использованы в случае случайной интоксикации человека.

  1. Убедитесь, что персонал имеет соответствующую подготовку по вопросам безопасности и обработки, прежде чем использовать MPTP в том, что продиктовано Комитетом по охране здоровья и безопасности учреждения. Каждое учреждение может установить и внедрить свои собственные стандартные оперативные процедуры для использования MPTP, на основе рекомендаций, всестороннеизложенных в литературе 17,22.
  2. Перед подготовкой, Дон соответствующее личное защитное оборудование (PPE), включая следующие: одноразовые лабораторные пальто или полный костюм тела, двойные перчатки nitrile, хирургическая маска, крышка для волос, защитные очки, и одноразовые бахилы. Правильный СИЗ следует носить во время подготовки MPTP, парадигмы инъекций и 72 ч после инъекции при обращении с животными и/или постельными принадлежностями.
  3. Выполняем расчеты перед подготовкой. Следует следовать институциональным руководящим принципам в отношении объемов досирования; доставка 100-150 мкл, как правило, используется для 25-30 г мышей.
    1. Для приготовления раствора 3 мг/мл MPTP в солевом растворе примените коэффициент коррекции (1.211 MPTP-HCl: 1.0 MPTP free base); концентрация MPTP-HCl в солевом транспортном средстве составляет 3,633 мг/мл.
    2. Подготовьте все оборудование, материалы и реагенты, необходимые для подготовки MPTP и потенциального обеззараживания разливов до обработки нейротоксина.
  4. Удалите флакон MPTP-HCl из надлежащего места хранения.
    Примечание: MPTP должен храниться на RT в закрытом флаконе в вторичном контейнере и храниться в закрытом шкафу с пометкой "MPTP".
    1. Обложка области окружающих весы с прокладками или бумажные полотенца смоченной с 10% отбеливатель раствор, чтобы уменьшить риск от пролитого порошка. Держите ткани и 10% отбеливатель раствор поблизости в качестве меры предосторожности.
    2. Используя аналитический баланс, расположенный в дымовом капюшоне, взвесьте 50 мг MPTP-HCl в стеклянный флакон со вторичным сдерживанием, содержащим 10% пропитанной отбеливателем ткани. Этикетка стеклянного флакона "MPTP" с концентрацией и датой.
    3. Закрыть флакон источника и протрите снаружи 10% отбеливателя.
  5. Медленно добавьте 13,763 мл стерильного солевого раствора во флакон и полностью закройте для смешивания. (Решение 3.633mg/ml MPTP-HCl.)
    1. В капюшоне тщательно стерилизовать mpTP раствор путем фильтрации с помощью фильтра 0,22 мкм в помеченный инъекционный флакон в вторичном контейнере с 10% пропитанной отбеливателем ткани. Очистите любой разлив с пропитанной отбеливателем ткани.
    2. Тщательно утилизировать острые и флаконы в надлежащим образом помечены биоопасных контейнера. Поддерживайте раствор MPTP во флаконе во вторичном контейнере с пропитанной отбеливателем тканью для транспортировки в процедурную комнату для животных.
      Примечание: не автоклав MPTP решение для стерилизации, как его испарение является ингаляционной опасности.
  6. Верните флакон MPTP в свой вторичный контейнер и поместите его в место хранения. Обеззараживание шпателем, аналитическим масштабом и поверхностью капота в течение 10 минут с использованием 10% отбеливателя.

3. Администрация MPTP

  1. Подготовка одноразовых клеток со стандартными микроизолатор перфорированными крышками, содержащими полиэфирные фильтрованные лайнеры с пометкой "MPTP" (минус проволочная пищевая решетка), одноразовые лайнеры клетки, предварительно влажные пищевые гранулы и гидрогель в качестве источника воды. Взвешивание всех животных и рекордный объем 3 мг/мл MPTP в солевой раствор, необходимый для инъекций 15 мг/кг.
    Примечание: метаболиты MPTP обнаруживаются в экскрементах в течение 3 дней послеинъекции 28,29; однако, мыши выделяют MPTP n-oxide, нетоксичную производную, которая не пересекает мембраны из-за своей гидрофилиности30.
    1. Ношение всех СИЗ, перечисленных выше, и проведение мышей над одноразовой абсорбции площадку, вводить солевой автомобиль или MPTP раствор для 15 мг/кг дозы в внутриперитонеальной полости (т.е.), ежедневно в течение 4 дней с одноразовым 26-го калибра туберкулина шприц.
    2. Не повторять шприц после использования; распоряжаться в специальный и помечены MPTP биоопасных острых контейнеров. Поддерживайте 10% отбеливателя и тканей поблизости, чтобы очистить любые случайные капли.
  2. Поместите животных, введенных с MPTP в одноразовых клетках, до 5 мышей на клетку, и дом на открытых стеллажах. Не используйте вентилируемые стеллажи.
    1. Поместите MPTP использовать плакаты на стойке, содержащей мышей и двери жилой комнаты до 72 ч после последней инъекции.
      Примечание: обеспечить температуру жилого помещения составляет от 22,2 до 24,4oC, как мыши испытывают преходящее переохлаждение до 12h после интоксикации MPTP. 31 год
    2. Обеззараживание рабочей поверхности отбеливателем после каждого использования (см. шаг 2.8), утилизация остатков раствора MPTP путем добавления объема, эквивалентного 10% отбеливателя, и отбрасывают содержимое в качестве биологических случайных жидких отходов.
    3. Откажитесь от всех используемых СИЗ в выделенной корзине для удаления. При необходимости распылите 10% отбеливателем перед удалением.
  3. Регулярно проверяйте животных и ежедневно обновляйте пищу и воду во время инъекций и 72 ч после последней инъекции. Примечание: хотя никакого загрязнения не ожидается в районе, непосредственно окружающем внешнюю часть клетки, этот регион рассматривается с раствором отбеливателя в качестве меры предосторожности (как описано в шаге 2.8). Следует позаботиться о всех мышах и оборудовании в этот период.
    1. Через три дня после последней инъекции, распоряжаться всеми клетками и лайнерами в надлежащим образом помечены биоопасной мешок. возобновить использование регулярного СИЗ и нормального жилья для животных; удалить дверные и полке плакаты.

4. Сбор тканей

  1. Euthanize животных путем вывиха шейки матки 7 дней после последней инъекции MPTP. Немедленно вскрыть мозг на льду с помощью предварительно охлажденной формы мозга с 1-мм слотами в корональной плоскости.
  2. Рассекаете стриатум из переднего ломтика толщиной 2 мм на уровне передней эмиссии.
    1. Удалите окружающие корковые и подкоркальные области с помощью скальпеля. Snap-заморозить стриатальной ткани из каждого полушария в отдельной 1,5-мл микроцентрифуг трубки для нейрохимического или биохимического анализа.
  3. Блок среднего мозга / заднего мозга в корональной плоскости на уровне передней гипоталамус и погружение-исправить ткани в 4% формальдегида аквеозный раствор.

5. Обработка тканей

  1. Процесс биохимии
    1. Гомогенизировать стриатальной ткани из одного полушария с помощью ультразвукового разрушителя клеток в 200-й й L Tris-EDTA лиза буфера (25mM Tris базы, 1mM EDTA, 1:100 протеазы и ингибитора фосфатазы коктейли) для 10 импульсов при 10-12 Гц и центрифугированы в течение 10 мин при 4oC при 1000xg.
    2. Тщательно аспирировать супернатант, и восстановить гранулы в 150-й лиза буфера. Фракции используются для биохимического анализа SDS-PAGE и западной blotting.
      Примечание: используйте протеазу и ингибитор фосфатазы, содержащий буфер в пределах 1 ч от подготовки из-за нестабильности в аквозных растворах.
  2. Процесс нейрохимии
    1. Используйте стриатум, рассеченный из другого полушария, из каждого образца, хранящегося при -80 градусов по Цельсию для HPLC. Оттепель стриатальных тканей в микрофуг труб на льду, добавить 500-й 0,3N перхлорной кислоты (PCA) и гомогенизировать с помощью sonicator.
      Примечание: Чтобы сделать 100 мл 0,3N PCA, мера 90-мл ddH2O, добавить в 100-мл градуированный цилиндр, добавить 2,58 мл 70% PCA, и довести до 100-мл знака. Этот буфер выборки может храниться при 4 градусах Цельсия в течение одного месяца.
    2. Sonicate стриатальной ткани в 500-й йл ледяной 0,3N PCA, для 10 импульсов на 10-12 Гц и место на льду. Для обеспечения однородности, sonicate образцы во второй раз в течение 10 сек, затем центрифуга в течение 12 мин при 4oC при 16100xg.
    3. Немедленно декантировать супернатант до 1,5 мл микроцентрифуг трубки и хранить при -80 градусов по Цельсию. Воздух-сухой гранулы фракции в капюшоне.
    4. Поддерживайте супернатант при -80 градусов по Цельсию до использования для измерения допамина и его метаболитов, 3,4-дигидроксифенилацетической кислоты (DOPAC) и гомованильной кислоты (HVA) HPLC с электрохимическим обнаружением.
    5. После высыхания, восстановить гранулы фракции в 0,5N NaOH (500 йл), и кратко sonicate. Храните восстановленную фракцию гранул при 4 градусах Цельсия до использования для определения общего белка с использованием метода Лоури.
  3. Процесс иммуногистохимии
    1. Погружение-исправить среднего и заднего мозга блоков на ночь в 4% формальдегида aqueous раствор и криопротектор в градуированных растворов сахарозы (10% в фосфат-буферный солевой раствор (0,01 М. PBS; 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, и ddH2O, pH 7.4) для 24 h, после этого 30% в PBS до тех пор пока ткань не утонут) на 4'C. Кратко пятно криопротезированы блоки, чтобы удалить избыток раствора сахарозы, заморозить на сухом льду и хранить при -80 градусов до использования.
    2. Микротоме секции блоков мозга, содержащих среднего и заднего мозга в криостат.
      1. Удалите ткани из -80 градусов по Цельсию, эквилибрировать при -16 градусов по Цельсию на 1 ч в криостате и монтировать в тканях встраивающие средства массовой информации.
      2. Соберите корональных секций толщиной 40 мкм в криопротекторный раствор (0,01 МТ СТ СС с 30% сахарозой, 30% этиленгликоль, рН 7,4) при -16 градусов по Цельсию. Соберите ткани последовательно в 6 1,5-мл микроцентрифуг трубки с интервалом 240 мкм и хранить при -20 градусов по Цельсию.

6. Иммуноблоттинг

  1. Определите концентрацию белка в стриатальной супернатантной фракции (подготовленной, как описано в разделе 5.1) анализом BCA.
  2. Рассчитайте разбавление, необходимое для каждой выборки, чтобы дать 10 мкг на колодец, поставляемый в 20 мкл объема.
  3. Разбавить супернатантный белок буфером 4X Laemmli и буфером гомогенизации, чтобы дать 10 мкг белка в буфере 1X Laemmli. Пример расчета:
    1. Определите окончательную концентрацию белка и требуемый объем. В этом случае требуется 10 мкг в 20 мкл (0,5 мг/мл).
    2. Определите конечный объем необходимого белкового раствора. Несмотря на то, что для погрузки требуется 20 мкл, необходимо подготовить дополнительный объем (30 мл).
    3. Так как окончательный объем и концентрация известны, и концентрация белка супернатант фракции известно (определяется BCA анализ), рассчитать объем белка супернатант требуется с помощью уравнения:
      Vсупернатант (Vфинал x Cфинал)/C супернатант
      Таким образом, при сверхнатантной концентрации белка в 1,5 мг/мл,
      Vсупернатант й (30 л x 0,5 мг/мл)/1,5 мг/мл
      Vсупернатант 10 хл
    4. Рассчитайте количество буфера 4X Laemmli, необходимого для того, чтобы выдать 1-ю концентрацию в 30 мкл объема (30 мкл / 4 и 7,5 л). Примечание: 4X Laemmli буфер должен быть разбавлен до 1X прочности в подготовке образца.
    5. Рассчитать количество буфера гомогенизации, необходимого для довести объем до 30 мкл (и получить желаемую окончательную концентрацию белка 0,5 мг/мл):
    6. Подготовь образец путем вихревого затем пипетки 10 мл белка супернатант в 12,5 мл буфера гомогенизации. Добавьте 7,5 л буфера 4X Laemmli для рабочего раствора образца 30 мкл и концентрации 0,5 мг/мл.
  4. Подготовка всех образцов с использованием процедуры описаны, вихрь и кипятить в течение 5 минут.
    Примечание: Используйте винт верхней микроцентрифуг трубки для предотвращения утечки и открытия из-за давления во время кипения.
  5. Через 5 минут сразу же вывихним на лед. Загрузите 20 мкл образцового рабочего раствора на гель хорошо (10 мкг белка). Отдельные образцы белка SDS-PAGE на 12% трис-глицин гель.
    1. Используйте предварительно окрашенные белковой лестнице для подтверждения молекулярного веса. Бегущий буфер составляет 25 мм Трис-база, 192 м глицин, 0,1% SDS, и ddH2O, рН 8,3.
    2. Отдельные белки по электрофорезу: бегите на 80 V, чтобы очистить скважины (10 мин) и 125 V (примерно 1 ч; до тех пор, пока белковая лестница полностью не отделится) для решения белков.
  6. Выполните передачу белка в нитроцеллюлоза с помощью нитроцеллюлозы в буфере передачи трис-глицина (25 мМв Трис, 192 мМглицин, 0,04% SDS, 20% метанола и ddH2O, pH 8.3) за ночь на 40 В при 4 градусов по Цельсию.
  7. Вымойте нитроцеллюлозы пятна в 1x Tris солевой раствор (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl в ddH2O, рН 7,4) в течение 10 мин на RT. lncubate в Понсо S в течение 5 минут, то промыть в ddH2O, чтобы обеспечить грубую проверку эквивалентной загрузки белка. Сканирование изображения для сохранения записи для ноутбука и destain с помощью PBS.
    Примечание: Кроме того, мыть пятно в Милли-Я или ddH2O, содержащий HCl (0,2%) в течение примерно 5 мин. Сканирование для записи. Удалите пятно Ponceau S из мембраны последующим шагом инкубации (т.е. место в блокирующего буфера).
  8. Блок пятна в 5% обезжиренного сухого молока в ТС на 1 ч на RT и инкубировать 24h при 4oC с кролика антитирозин гидроксилазы (1:1000),анти-β-актин (1:200); анти-GFAP (1:1000) в 5% молока-TS.
  9. Вымойте помарки 3 x 5 мин в TS с 0.05% Tween-20 и 1 x 5 min в TS, после этого инкубировать в HRP-спряженных вторичных антителах (1:5000 в TS содержа 5% молоке), сопрягаемом к виду главным образом, для 2 h на RT.
  10. Приготовьте химилюминесцентный субстрат с использованием равных объемов растворов люминола и перекиси и нанесите на 1-3 мин. В темной комнате поместите пятно в пластиковый рукав для экспозиции пленки и подвергайте пленке; пленка затем разрабатывается с использованием автоматического процессора.
  11. Полоса пятна с коммерчески доступными зачистки буфера при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, мыть 3x 10 мин в ТС с 0,05% Tween-20, и 1x 10 мин в ТС, а затем reprobe для погрузки контроля или другого белка интереса.
  12. Количественная оценка сигналов с помощью программного обеспечения Image J для оптических измерений плотности и нормализации внутреннего контроля нагрузки β-actin.

7. Нейрохимия

  1. Ткань для анализа подготовлена, как описано выше в разделе 5.2. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для мобильного рецепта фазы.
    Примечание: Все реагенты должны быть ≥99,0% чистой и класса HPLC. Обеспечь целостность буфера с помощью чистой, выделенной стеклянной посуды и перемешать решетки. Мобильный фазовой буфер должен быть использован в течение семи дней после подготовки.
    1. Взвесь дигидроген фосфат и лимонную кислоту, добавьте 1 лddH 2O и смешайте в цилиндре с градуированным 2 л. Фильтровать раствор через мембрану GSTF 0,22 мкм.
      Примечание: Это максимизирует добычу загрязняющих веществ в фосфатах и лимонной кислоте, что помогает свести к минимуму фоновые токи.
    2. Добавьте OSA с последующим ацетонитрилом и раствором EDTA. Добавьте ДДХ2O класса HPLC примерно до 1900 мл до корректировки рН до 3,0 с фосфорной кислотой.
    3. Добавьте ddH2O класса HPLC к отметке 2-L, а затем вылейте в колбу 2-L. Добавить специальный бар перемешать, и дегазаации мобильной фазы, помешивая его под вакуумом в течение > 10 минут.
  2. Подготовь стандарты для допамина, и DOPAC и HVA для стандартных кривых. Фондовые растворы стандартов готовятся при 1 мг/мл в 0,3 Н PCA.
    1. Взвесить 12,4 мг допамина-HCl, и добавить 10,0 мл 0,3 N PCA, чтобы сделать 1 мг / мл допамина.
    2. Взвесьте 10.0 мг DOPAC, и добавьте 10.0 мл 0.3 N PCA, чтобы сделать 1 мг/мл DOPAC.
    3. Взвесьте 10.0 мг HVA, и добавьте 10.0 мл 0.3 N PCA для того чтобы сделать 1 mg/ml HVA.
  3. Подготовка рабочих стандартных решений из фондовых решений. Пятитой стандарты используются для создания кривой концентрации.
    1. Для измерения стриатального допамина приготовьте стандартные концентрации 12,5 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл и 200 нг/мл.
    2. Для стриатального DOPAC приготовьте стандартные концентрации 2,5 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл и 40 нг/мл.
    3. Для стриатального HVA приготовьте стандартные концентрации 5 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл, 40 нг/мл и 80 нг/мл.
    4. Создайте пятиточайные стандарты: разбавьте раствор дофамина 1 мг/мл до 5 мкг/мл с помощью 0,3N PCA. Разбавить 1 мг/мл раствора бульона DOPAC до 1 мкг/мл с использованием 0,3N PCA и разбавить 1 мг/мл раствора бульона HVA до 2 мкг/мл с использованием 0,3N PCA.
    5. Перенесите 1 мл 5 мкг/мл допамина, 1 мл 1 мкг/мл DOPAC и 1 мл 2 мкг/мл ХВА в 25-мл объемной колбы и довнесите объем до 25 мл марки с 0,3 Н PCA.
      Примечание: Смешанные стандарты в томтрической колбе содержат самую высокую концентрацию пятиточковых стандартов: 200 нг/мл допамина, 40 нг/мл DOPAC и 80 нг/мл HVA.
    6. Перенесите 1 мл смешанных стандартов в чистые 1,5 мл микроцентрифугных трубок. Выполните 1:1 серийное разбавление четыре раза для создания последующих четырехтокай стандартов.
      1. Например, до 250 мкл смешанных стандартов добавьте 250 мкл буфера выборки и вихря тщательно для получения смешанных стандартов при 50% от первоначальных концентраций; повторить процесс до достижения желаемых разбавлений.
  4. Подготовка системы HPLC (насос, автоамперлер, реверсивная колонка (C18, 150×3,2 мм, 3 мкм)). Очистить насос свежей мобильной фазой, чтобы заменить все предыдущие решения в системе HPLC и захваченные пузырьки воздуха свежей мобильной фазой. Охладить автозапомохать до 4 градусов по Цельсию. Разогреть столбец до 35 градусов по Цельсию, что снижает общее давление.
    1. Установите напряжение на уровне -150 мВ и 220 мВ для первого и второго электродов электрохимического детектора соответственно. Equilibrate системы, по крайней мере 2 ч, и в идеале на ночь, с мобильной фазы со скоростью потока 0,2 мл/мин.
      Примечание: Во время равноуданого можно было бы использовать ячейки, а базовое чтение контролировать. Стабильное чтение указывает на то, что система готова к использованию. В течение двух часов фазы эквилибрации позвольте мобильной фазе войти в контейнер для отходов вместо того, чтобы его циркулировать. После этого периода, передвижная фаза может быть рециркулирована всю ночь для equilibration.
    2. Как только эквилибрация завершена, отрегулируйте скорость потока мобильной фазы до 0,6 мл/мин. Ввись 20 мкл каждого из пятио пункта стандартов.
  5. Оттепель стриатальных образцов на льду, и ввести 2 х 20 мкл каждого образца в систему HPLC. Используйте стандарты в начале и случайным образом на протяжении каждого набора стриатальных образцов.
  6. Используйте программное обеспечение для анализа области под допамина, DOPAC, и HVA пиков, производимых по стандартам и образцам. Определите аналиты по времени удержания и измерению, сравнив область под пиком с 5-той кривой для соответствующего стандарта.
  7. Подготовка фракции гранул, как описано в разделе 5.2.3. Выполните анализ белка Лоури на стриатальные гранулы. Примечание: Этот анализ будет измерять количество белка, присутствуют в стриатальных образцов в мг / мл; эта информация используется для определения концентрации аналита нг/мг.

8. Иммуногистохимия

  1. GFAP/TH двойной иммунофлюоресценции
    1. Удалите трубки, содержащие секционно-среднебрюх из морозильной камеры -20 градусов по Цельсию, и довнесите до RT. Удалите секции тканей, содержащие субстантию нигра, из криоконсервативного раствора в подносе, содержащем PBS.
    2. Поместите секции тканей в полистироловые вставки с полиэфирной сеткой днища для свободно плавающей иммунохимии. Вымойте 3 х 5 мин в PBS.
    3. Передача секций на пластину 96-х пластин с 180-кл блок раствор (5% нормальной сыворотки осла, 1% PVP, 1% BSA и 0,3% Triton X-100 в PBS) в каждой хорошо. Инкубация 40 мин на RT.
      Примечание: Все шаги мытья и инкубации выполняются с легким возбуждением на шейкере.
    4. Передача секций в скважины, содержащие первичный раствор антитела (180 мкл на скважину). Инкубация в первичном антителе коктейль, кролик анти-GFAP (1:1000) и овец анти-TH (1:400) разбавленный в PBS с 1% BSA и 0,3% TX-100, для 24 ч при 4 градусов по Цельсию. IgG от первичного вида служит отрицательным иммуностимулятором.
    5. Инкубировать в вторичных антител коктейль (1:200 осла анти-кролик 568 и 1:200 FITC осла анти-овцы в PBS с 0,1% TX-100). Используйте фольгу для защиты раствора от света во время подготовки и инкубации; инкубировать на RT в течение 2 ч.
      1. Для отрицательного контроля инкубировать участки в IgG от первичного вида, разбавленного до той же концентрации, что и для первичных антител.
      2. Вымойте 2 х PBS и 1 х TS в течение 5 минут каждый на RT. Маунт ткани разделы на плюс слайды в монтажной среде с пятном Hoechst и coverslip.
    6. Инкубировать в вторичных антител коктейль (1:200 осла анти-кролик 568 и 1:200 FITC осла анти-овцы в PBS с 0,1% TX-100). Используйте фольгу для защиты раствора от света во время подготовки и инкубации; инкубировать на RT в течение 2 ч.
    7. Вымойте 2 х PBS и 1 х TS в течение 5 минут каждый на RT. Маунт ткани разделы на плюс слайды в монтажной среде с пятном Hoechst и coverslip.
    8. Защитите слайды от света и окисления до визуализации, сохраняя их в слайд-коробке при 4 градусах Цельсия.
    9. Проанализируйте отрицательный контроль сначала для определения фонового уровня флуоресценции, а затем оцените положительную иммунореактивность с помощью флуоресцентной микроскопии.
  2. Иммуногистохимия Иба1 с хромагенными осадками
    1. Удалите трубки, содержащие секционно-среднебрюх из морозильной камеры -20 градусов по Цельсию, и довнесите до RT. Удалите секции тканей, содержащие субстантию нигра, из криоконсервативного раствора в подносе, содержащем PBS.
    2. Поместите секции тканей в полистироловые вставки для свободно плавающей иммунохимии. Вымойте разделы 3 х 5 мин в PBS, и поместите разделы непосредственно в 12-хорошо пластины, содержащие предварительно нагретые 10 мМ лимонной кислоты моногидрат, рН 9,0, 80 градусов по Цельсию в течение 30 мин, для эпитопа поиска.
    3. Прохладный пластины 20 мин на RT. Возвращение разделов для вставок и мыть 3 х 5 мин в PBS.
    4. Передача секций на 96-хорошо пластины, содержащие 180-МК блокирующий раствор (10% нормальной сыворотки козы, 1% BSA в PBS) на колодец, и инкубировать 40 мин на RT.
    5. Передача секций скважинам, содержащим разбавленные первичные антитела в 180 мкл (1:1000 в 1% BSA-PBS). Инкубация на ночь при 4 градусах Цельсия.
    6. Передача разделов вставки. Вымойте 3 х 5 мин PBS и применять биотинилированные вторичные антитела (1:200 в 1,5% нормальной сыворотки-PBS) в течение 1 ч на RT.
    7. Подготовь решение ABC за 30 минут до использования. Вымойте 3 х 5 мин PBS и перейти на решение ABC для 1 ч на RT.
    8. Подготовь решение DAB в капюшоне. Вымойте 2x 5 мин в PBS и 1x 5 мин в TS, и инкубировать разделы в DAB.
      1. Разработка в течение 3-4 мин. Отрицательный контроль должен оставаться светлым цветом.
        Примечание: выполнить этот шаг в дым капот, как DAB является известным канцерогеном. Раствор перманганата калия 0,2 М приДДГ 2O для обеззараживания следует поддерживать в непосредственной близости в случае случайных капель.
    9. Промыть разделы кратко в ddH2O, затем в TS 3 х 5 мин. Гора разделы на плюс слайды и воздух сухой ночь в дым капот.
    10. Обеззараживание отходов DAB с равным объемом 0,2 М перманганата калия в ddH2O, вихрь, и инкубировать в дым капот на ночь перед хранением в надлежащим образом помечены DAB отходов бен в дым капот.
      Примечание: Отбеливатель решение не устраняет мутагенных свойств DAB.
      1. Обеззараживать предметы, которые необходимо повторно использовать (т.е. полистироловые вставки) и мыть моющим средством.
    11. Обезвоживаемый/счетчик слегка с cresyl фиолетовый (CV). Все шаги обезвоживания / мытья 3 мин: этанол 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 секунд), ddH2 0x 2, 95% этанола и ледниковой уксусной кислоты (0,1%) х 2, 100% этанола и ксилена.
    12. Coverslip в distyrene-толуол-ксилен монтажа среднего и сухой в дым капот.
    13. Наблюдайте положительную иммунореактивность с помощью светового микроскопа. IgG от первичного вида служит отрицательным иммуностимулятором.

9. Статистика

  1. Оценить различия между средствами с помощью одного пути анализа дисперсии (ANOVA) для сравнения различий между генотипом и двухповерхной ANOVA для сравнения различий между генотипом и токсикантной обработки. Используйте HSD-специальный анализ Tukey, когда различия наблюдаются при тестировании ANOVA(p≤0.05).
    Примечание: эксперименты (с n No 6-9 мышей / группы) выполняются как минимум два раза для обеспечения воспроизводимости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эта парадигма воздействия токсинов может производить значительные и обнаруживаемые 20% истощения стриатального допамина в MPTP- против солевые инъекционные животных. Важно отметить, что различные партии MPTP может дать немного более или менее поражения; Таким образом, для лучшей точности, предварительный эксперимент на диких мышах рекомендуется перед использованием в трансгении, когда используется новый лот нейротоксина. Использование легкого до умеренного поражения позволяет наблюдать воздействие трансгена; тяжелое поражение может привести к "эффект пола" с травмой слишком надежным, чтобы затухать или настолько разрушительным, что он затмевает эффект пагубного генетического изменения. Влияние MPTP на стриатальный допамин были значительно отличаются в 5-LOX изозим-дефицит мышей, но не 12/15-LOX изозим-дефицит мышей(рисунок 1). Кроме того, с помощью этих методов, мы смогли различить значительную разницу в уровнях допамина из-за 5-LOX дефицит соленых мышей (Рисунок 1).

Иммуноблотмирование для TH и GFAP позволило подтвердить повреждения и нейровоспламенение, соответственно, на уровне стриатума у диких мышей, эффект, который был уменьшен в 5-LOX изозим-дефицитной стриатума(рисунки 3A и 3B). Поражение также заметно на уровне substantia nigra (рисунок2A и 2B). У тех же мышей, истощение TH-положительных нейронов и увеличение иммунореактивности GFAP наблюдается с помощью двойной этикетки иммунофторесцентной маркировки (Рисунок 2A). Кроме того, заметно повышенная микроглиальная активация(т.е. иммунореактивность Iba1) в диком типе, но не 5-LOX изозим-дефицит, мышей проявляется в substantia nigra после воздействия MPTP (Рисунок 2B). Таким образом, модель MPTP может стать полезным инструментом для оценки влияния генетической предрасположенности к дегенерации и воспалению.

Figure 1
Рисунок 1. LOX isozyme-селективное воздействие на стриатальный допамин после вызова MPTP. (A) Стриатальные гомогенаты использовались для измерения допамина (DA) HPLC от WT и 5-LOX-/- littermates данного солевого раствора или MPTP (n'6-8/group). - отмечает значительный эффект генотипа; р<0,05. - отмечает значительный эффект от генотипа и лечения; р<0,05. Не было отмечено существенной разницы в лечении у 5-LOX-/- мышей (n.s.), что указывает на то, что MPTP не производит стриатального истощения DA в этой трансгенной линии. (B) Стриатальные гомогенаты использовались для измерения DA в WT и 12/15-LOX-/- littermates данной солевой или MPTP (n'6-9/group). Существенной разницы в уровнях DA из-за генотипа не наблюдалось. Значительное и аналогичное сокращение за счет лечения MPTP было отмечено в обоих генотипах. Вопрос, стр.<0,01. Данные отображаются как среднее ± SEM.

Figure 2
Рисунок 2. 5-LOX isozyme влияет на ниграл TH и астроглию после mpTP вызов. (A) Иммунофлуоресценция окрашивания для TH (FITC; зеленый) и GFAP (568; красный) иммунореактивности была выполнена в нигральных секциях мозга от WT и 5-LOX-/- littermates данного солевого раствора или MPTP. Меньше TH-положительных клеток органов (яп.) и повышение иммунореактивности GFAP очевидны в группе WT-MPTP. Бар No 25 мкм. (B) Иммуногистохимическая гистология для Иба-1 на микроглии была обнаружена с помощью DAB (коричневый хроматген); разделы были counterstained по Cresyl фиолетовый. Были оценены нигриальные секции от WT и 5-LOX-/- littermates обработанные солевым раствором или MPTP. Микроглия с рамифицированных клеточных тел и длинные, ветвясь процессы наблюдаются в substantia nigra от солевые обработанные мыши (стрелки головы). Активированная микроглия с округлыми клеточными телами и короткими, утолщенными процессами наблюдалась в субстантии нигра у обработанных MPTP мышей (стрелок). Бар 10 мкм.

Figure 3
Рисунок 3. 5-LOX isozyme влияет на стриатальный TH и воспалительные следующие токсичные оскорбления. (A) Уровни белка Striatal TH были полуколичественны измерены западными анализами помарки гомогената от WT и 5-LOX-/- littermates, дали солевой раствор или MPTP (n'6-8/group). Иммунореактивность, измеряемая оптической плотностью, была β для лечения. Вопрос, стр.<0,05. (B) Аналогичным образом, GFAP был полуколично измерен западным анализом помарки стриатального гомогената от WT и 5-LOX-/- littermates, данный с солевым раствором или MPTP (n'6-8/group) и нормализовался до β-актина. Вопрос, стр.<0,05. Данные отмечаются как среднее ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Конструкция этого исследования взаимодействия генно-окружающей среды позволила нам получить новую информацию о двойной природе изозима 5-LOX в нипростриатальной дорожке. Выполняя HPLC для измерения стриатальных моноамина после солевого или MPTP лечения в трансгеничных не хватает 5-LOX isozyme и их wildtype littermates, мы смогли отметить, что его дефицит, как представляется, защитные втоксичных условиях ( Рисунок 1), но при нормальных условиях, отсутствие фермента снижает уровень допамина стриатала и может быть вредным. Таким образом, мы можем продемонстрировать, что 5-LOX isozyme способствует стриатального дофаминергического тона в нормальных условиях, но может способствовать повреждению после токсичных вызов4.

В то время как дальнейшая оценка должна дать новые механистические идеи о роли LOX isozymes в нигрострията токсичности, западные анализы помарки (Рисунок 3), а также иммуногистохимических исследований (Рисунок 2) показали, что нейровоспламеняющих маркеров были, по крайней мере частично, ослаблены в 5-LOX isozyme-дефицит когорты подвергаются MPTP. Эти выводы, используя классические биохимические и гистологические методы, указывают на критическую роль 5-LOX продуктов в потенции микро- и астро-глиальнойактивации 4.

В зависимости от исследуемого взаимодействия генно-экологической среды могут быть проанализированы патологические считывания в дополнение к глиальной активации. Особое значение в PD является потеря дофаминергических нейронов в субстантии нигра и потенциально патологическое накопление и агрегация α-синуклеина. Вдоль этой линии, влияние токсикантного воздействия на трансгенных мышей с α-синуклеин переэкспрессии была проверена путем оценки смерти нигралклеток (т.е. с использованием беспристрастного стоерологического подсчета клеток) и нерастворимые α-синуклеиносаждения 32-35.

Доза MPTP, используемая в описанной здесь парадигме, производит легкое поражение со скромными, но значительными, стриатальными травмами(рисунок 1) и глиальнойактивацией как в стриатуме, так и в субстантии нигра(рисунки 2 и 3). Как правило, более высокие дозы токсиканта используются для производства надежной потери ниграл дофаминергических клеток иистощения триатального допамина 23,24,32,36-38,39. Важно отметить, что токсичность MPTP может варьироваться между поставщиками и лотами; следовательно, дозы, возможно, потребуется настроить для получения желаемого поражения. Кроме того, другие факторы, которые должны быть рассмотрены являются штамм и пол животных, используемых для исследований. Селективная чувствительность к нейротоксину была продемонстрирована в различных фоновых штаммов мышей, явление, по крайней мере частично, различия в активации подклеточных путей, которые являются посредниками дегенерации, в том числе JNK и C-Июнь36-39. Секс-зависимые различия в токсичности MPTP такжебыли зарегистрированы 40,41, и может способствовать изменчивости в исследованиях с использованием трансгенных мышей, в которых оба пола используются для бедных пород линий. В таком случае использование контроля дикого типа, сотых по полу, имеет решающее значение4. Такие секс-эффекты могут объяснить разницу в поражении наблюдается в WT мышей между экспериментами тестирования воздействия 5- и 12/15-LOX-дефицит мышей, в которых один пол был использован для одной линии и обоих полов для другой (Рисунок 1). Для исследований взаимодействия генно-экологической среды, MPTP задача, которая производит серьезныетравмы (например, >80% снижение стриатального допамина) не рекомендуется, поскольку это может маскировать возможный генетический эффект.

В то время как воздействие MPTP производит нигралклеточной смерти 3,42, стриатальногоистощения допамина 3, комплекс I ингибирование43-45, иглиальной активации 46,47, которые были зарегистрированы в человека PD, в мыши, медленно прогрессирующей дегенерации, которая производит стабильный паркинсонизм(т.е. двигатель дефицита) и откровенные α-синуклеин патологии (т.е. Леви органов и невритов) полностью recapitulating отличительные черты болезни не происходит в модели. Тем не менее, важно отметить, что MPTP мышь сыграла важную роль в понимании субклеточных путей, которые способствуют PD связанных нейродегенерации. Вариации в парадигмах воздействия, например, выявили активацию различных механизмов токсичности: низкие дозы, подостеное воздействие способствует смерти апоптотическихклеток 48 с ограниченным иммуннымответом 49, в то время как острое лечение с более высокими дозами производит отмеченную микроглиарнуюактивацию 50. Действительно, такие факторы следует учитывать при использовании модели для исследований эффективности и, что имеет отношение к нынешнему исследованию, для разоблачения воздействия потенциального генетического фактора риска.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Раскрывать нечего.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения NIGMS 056062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01 counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt 7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

Tags

Медицина Выпуск 83 MPTP допамин Iba1 TH GFAP липоксигеназа трансгенные генно-среду взаимодействия мышь болезнь Паркинсона нейродегенерация нейровоспламенение
Генно-экологические модели взаимодействия для разоблачения механизмов восприимчивости при болезни Паркинсона
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R.,… More

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter