Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Gen-miljø interaksjonsmodeller for å avdekke følsomhetsmekanismer ved Parkinsons sykdom

Published: January 7, 2014 doi: 10.3791/50960
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

Summary

Lipoksygenase (LOX) isozymer kan generere produkter som kan øke eller redusere nevroinflammasjon og nevrodegenerasjon. En gen-miljø interaksjonsstudie kan identifisere LOX isozym-spesifikke effekter. Ved hjelp av 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) modell av nigrostriatal skade i to LOX isozyme-mangelfulle transgene linjer tillater sammenligning av bidrag av LOX isozymer på dopaminerg integritet og betennelse.

Abstract

Lipoksygenase (LOX) aktivitet har vært involvert i nevrodegenerative lidelser som Alzheimers sykdom, men dens effekter i Parkinsons sykdom (PD) patogenese er mindre forstått. Gen-miljø interaksjonsmodeller har nytte i å avdekke virkningen av spesifikke cellulære veier i toksisitet som kanskje ikke observeres ved hjelp av en utelukkende genetisk eller toksisk sykdomsmodell alene. For å vurdere om distinkte LOX-isozymer selektivt bidrar til PD-relatert nevrodegenerasjon, kan transgene (dvs. 5-LOX og 12/15-LOX mangelfulle) mus utfordres med et giftstoff som etterligner celleskade og død i lidelsen. Her beskriver vi bruken av et nevrotoksin, 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), som produserer en nigrostriatal lesjon for å belyse de distinkte bidragene fra LOX-isozymer til nevrodegenerasjon relatert til PD. Bruken av MPTP i mus, og ikke-umenneskelig primat, er veletablert for å rekapitulere nigrostriatal skade i PD. Omfanget av MPTP-indusert lesjon måles ved HPLC-analyse av dopamin og dets metabolitter og semi-kvantitative vestlige blotanalyse av striatum for tyrosinhydroksylase (TH), det hastighetsbegrensende enzymet for syntesen av dopamin. For å vurdere inflammatoriske markører, som kan demonstrere LOX isozyme-selektiv følsomhet, utføres glial fibrillært surt protein (GFAP) og Iba-1 immunhiistokjemi på hjerneseksjoner som inneholder substantia nigra, og GFAP Western blotanalyse utføres på striatale homogenater. Denne eksperimentelle tilnærmingen kan gi ny innsikt i gen-miljø interaksjoner underliggende nigrostriatal degenerasjon og PD.

Introduction

Bruk av gen-miljø interaksjonsmodeller gir en tilnærming til å etterligne risikofaktorer som sannsynligvis påvirker idiopatisk Parkinsons sykdom (PD) og gir en mulighet til å skjelne mekanistisk innsikt som sannsynligvis ikke vil bli belyst ved bruk av et genetisk eller giftig system alene1,2. Her illustrerer vi dette punktet og beskriver anvendelsen av 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) musemodell av nigrostriatal degenerasjon3 for bedre å forstå selektiviteten til lipoksygenase (LOX) isozymaktivitet på nevroinflammasjon og toksisitet4. Mens en rolle for LOX isozymer har blitt mye evaluert i perifere lidelser5,6 samt CNS sykdom inkludert hjerneslag7 og Alzheimers sykdom8,9, rollen som familien av isozymer i nigrostriatal funksjon og degenerasjon relatert til PD er ikke godt forstått og garanterer studie. MPTP-nevrotoksinet demonstrerer preferansedegenerering av nigrostriatalbanen og rekapitulerer striatal dopaminnedbrytning og nigral dopaminerg celletap som ligger til grunn for motoriske svekkelser hos PD-pasienter10. Selv om denne modellen ikke reproduserer hele kaderet av ikke-motorisk og motorisk PD-oppførsel og frank α-synuclein-positiv Lewy kroppspatologi, har det vært nyttig å belyse nye mekanistiske mål som bidrar til nigrostriatal skade og for tidlig-stadium translasjonell testing som det er den best karakteriserte ikke-invasive modellen tilgjengelig for pålitelig å produsere nigral celledød ledsaget av striatal dopamin tap11-15. Bred bruk av MPTP-musen, med paradigmer som spenner fra akutt, subakutt til kronisk16-18, har tillatt standardisering av dosering for å resultere i mild til alvorlig nigrostriatal skade19,20 med aktivering av forskjellige mekanismer for toksisitet avhengig av behandlingsregimet18,21,22. Følgelig tillater dette et "vindu med lesjonering" som kan føre til forbedret eller redusert nigrostriatal skade avhengig av terapeutisk middel eller transgen modell som brukes23-25.

Også avgjørende for translasjons- og oppdagelsesbiologistudier er teknikkene som brukes til å vurdere skade og bevisene slike metoder gir. For MPTP-musemodellen er etablerte beregninger for å evaluere lesjoner måling av markører av striatal dopaminerg tone, inkludert dopamin og dets metabolitter av HPLC, og vestlig blotteanalyse av tyrosinhydroksylase (TH), det hastighetsbegrensende enzymet i dopaminsyntese og indikatorer på degenerative hendelser som glial aktivering ved hjelp av vestlig blotanalyse og immunohistokjemi4. Selv om disse er klassiske nevrokjemiske, biokjemiske og histologiske prosedyrer, gir teknikkene kritiske og reproduserbare avlesninger om skadeomfanget innenfor den nigrostriatale dopaminerge banen, indikerer mekanismer for toksisitet, og har vist seg å være verdifulle verktøy for å forstå degenerative hendelser i PD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Alle dyreprosedyrer og dyrepleiemetoder bør godkjennes av institusjonens institusjonelle dyrepleie- og brukskomité (IACUC). Studien som er beskrevet her, ble utført i henhold til retningslinjene fastsatt av SRI Internationals IACUC.

1. Oppkjøp og vedlikehold av LOX-mangelfulle mus

  1. Kjøp 5-LOX-mangelfulle eller 12/15-LOX-mangelfulle mus og respektive belastnings- og sextilpassede kontroller i alderen 7-8 uker og la det være flere dager for akklimatisering til anlegget etter ankomst.
  2. Oppretthold mus i gruppehus på en 12-timers lys-mørk syklus og gi mat og drikkevann ad libitum.

2. MPTP forholdsregler, lagring, forberedelse, dekontaminering og avhending

Merk: MPTP-forgiftning fra intravenøs eksponering hos mennesker har vist seg å forårsake parkinsonisme10; MPTP er svært lipofil og kan lett krysse blod-hjernebarrieren26. Forholdsregler bør iverksettes for å sikre sikker håndtering, avgiftning og avhending. Dens metabolisme innebærer flere trinn, inkludert konvertering til 1-metyl-4-fenyl-2,3-dihydropyridinium av enzymet monoaminoksidase B (MAO-B)27. MAO-B-hemmere kan brukes ved utilsiktet menneskelig forgiftning.

  1. Sørge for at personell har riktig opplæring i sikkerhet og håndtering før bruk av MPTP som diktert av institusjonens helse- og sikkerhetskomité. Hver institusjon kan etablere og implementere egne standard driftsprosedyrer for bruk av MPTP, basert på anbefalinger som er grundig skissert i litteraturen17,22.
  2. Før forberedelsene må du ta vare på personlig verneutstyr (PVU), inkludert følgende: engangs labfrakk eller helkroppsdrakt, doble nitrilhansker, kirurgisk maske, hårdeksel, vernebriller og engangsskodeksler. Riktig verneutstyr bør brukes under tilberedning av MPTP, injeksjonsparadigmet og 72 timers etter injeksjon ved håndtering av dyr og/eller sengetøy.
  3. Utfør beregninger før forberedelse. Institusjonelle retningslinjer for dosering av volumer bør følges; levering av 100-150 μl brukes vanligvis til 25-30 g mus.
    1. For å forberede en 3 mg / ml MPTP-løsning i saltvann, bruk en korreksjonsfaktor (1.211 MPTP-HCl: 1.0 MPTP fri base); konsentrasjonen av MPTP-HCl i saltvannskjøretøy er 3,633 mg/ml.
    2. Forbered alt utstyr, forsyninger og reagenser som trengs for MPTP-forberedelse og potensiell utslippsdekontaminering før håndtering av nevrotoksinet.
  4. Fjern MPTP-HCl-hetteglasset fra riktig lagringssted.
    Merk: MPTP skal opprettholdes ved RT i et lukket hetteglass i en sekundær beholder, og lagres i et låst skap, merket "MPTP."
    1. Dekk området rundt skalaer med pads eller papirhåndklær fuktet med 10% blekemiddelløsning for å redusere risikoen for sølt pulver. Hold vev og 10% blekemiddelløsning i nærheten som en forholdsregel.
    2. Bruk en analytisk balanse plassert i en avtrekkshette, vei 50 mg MPTP-HCl inn i glassflaske med sekundær inneslutning som inneholder 10% blekemiddel-gjennomvåt vev. Merk hetteglasset "MPTP" med konsentrasjon og dato.
    3. Lukk hetteglasset med kilde og tørk utsiden med 10 % blekemiddel.
  5. Tilsett sakte 13.763 ml steril saltvann til hetteglasset og lukk helt for blanding. (Oppløsning er 3,633mg/ml MPTP-HCl.)
    1. I hetten steriliserer du MPTP-oppløsningen forsiktig ved filtrering ved hjelp av et 0,22 μm filter i merket injeksjonshettet i en sekundær beholder med 10% blekemiddel-gjennomvåt vev. Rengjør ethvert søl med blekemiddel-gjennomvåt vev.
    2. Kast skarpt og hetteglass forsiktig i riktig merket biofarebeholder. Vedlikehold MPTP-løsning i hetteglass i sekundærbeholderen med blekemiddel-gjennomvåt vev for transport til dyreprosedyrerom.
      Merk: Ikke autoklaver MPTP-oppløsning for sterilisering, da fordampningen er en innåndingsfare.
  6. Returner MPTP-kilde hetteglasset til den sekundære beholderen og plasser det på lagringsstedet. Dekontaminer spatel, analytisk skala og hetteoverflate i 10 min ved bruk av 10% blekemiddel.

3. MPTP-administrasjon

  1. Forbered engangsbur med standard mikroisolatorperforerte lokk som inneholder polyesterfiltrert innerstøvel merket "MPTP" (minus trådmatgrill), engangsburforinger, pre-våte matpellets og hydrogel som vannkilde. Vei alle dyr og registrer volum på 3 mg/ml MPTP i saltvann som kreves for 15 mg/kg injeksjon.
    Merk: MPTP metabolitter kan påvises i ekskreta i 3 dager etter injeksjon28,29; Mus utskiller imidlertid MPTP n-oksid, et ikke-giftig derivat som ikke krysser membraner på grunn av hydrofilisiteten30.
    1. Bruk alt personlig verneutstyr som er oppført ovenfor, og hold mus over en engangsabsorpsjonspute, injiser saltvannskjøretøy eller MPTP-oppløsning for 15 mg/kg dose i intraperitonealhulen (dvs.), daglig i 4 dager med en engangs 26-gauge tuberkulinsprøyte.
    2. Ikke summer sprøyten på nytt etter bruk; kastes i en dedikert og merket MPTP biofarlig slipebeholder. Oppretthold 10% blekemiddel og vev i nærheten for å rengjøre eventuelle utilsiktede drypp.
  2. Plasser dyr injisert med MPTP i engangsbur, opptil 5 mus per bur, og hus på åpne stativer. Ikke bruk ventilerte stativer.
    1. Plasser MPTP bruk plakater på stativ som inneholder mus og romdør til 72 timer etter siste injeksjon.
      Merk: Sørg for at temperaturen på boligrommet er mellom 22,2 - 24,4oC, da mus opplever forbigående hypotermi opptil 12 timer etter MPTP-forgiftning. 31
    2. Dekontaminer arbeidsflaten med blekemiddel etter hver bruk (se trinn 2.8), kast rester av MPTP-oppløsning ved tilsetning av et volum tilsvarende 10% blekemiddel, og kast innhold som biofarlig flytende avfall.
    3. Kast alt brukt personlig verneutstyr i en egen avhendingshylle. Spray om nødvendig med 10% blekemiddel før avhending.
  3. Kontroller dyrene regelmessig og oppdater mat- og vannkilden daglig under injeksjonsparadigmet og 72 timer etter siste injeksjon. Merk: Selv om det ikke forventes forurensning i området umiddelbart rundt utsiden av buret, behandles denne regionen med blekemiddelløsningen som en forholdsregel (som beskrevet i trinn 2.8). Det må utvises forsiktighet ved håndtering av alle mus og utstyr i denne perioden.
    1. Tre dager etter siste injeksjon, kast alle merder og liners i riktig merket biofarepose. Gjenoppta bruk av vanlig PVU og normalt hus for dyr; fjern dør- og hylleplakater.

4. Vev høsting

  1. Avlive dyr ved cervical dislokasjon 7 dager etter siste MPTP injeksjon. Disseker umiddelbart hjernen på is ved hjelp av forkjølt hjerneform med 1 mm spor i koronalplanet.
  2. Disseker striatum fra en forebrain skive 2 mm tykk på nivået av fremre kommissær.
    1. Fjern omkringliggende kortikale og subkortiske regioner ved hjelp av en skalpell. Snap-freeze striatalvev fra hver halvkule i et separat 1,5 ml mikrosenterrør for nevrokjemisk eller biokjemisk analyse.
  3. Blokker midbrain/hindbrain i koronalplanet på nivået av fremre hypothalamus og nedsenkningsfiksert vev i 4% formaldehyd vandig oppløsning.

5. Vevsbehandling

  1. Prosess for biokjemi
    1. Homogeniser striatalvev fra en halvkule ved hjelp av en ultralydcelleforstyrrer i 200-μL Tris-EDTA lysisbuffer (25mM Tris base, 1mM EDTA, 1:100 protease og fosfatasehemmercocktails) for 10 pulser ved 10-12 Hz og sentrifugert i 10 min ved 4oC ved 1000xg.
    2. Aspirer forsiktig supernatanten, og rekonstituer pelletsen i 150-μl lysisbuffer. Fraksjoner brukes til biokjemisk analyse av SDS-PAGE og Western blotting.
      Merk: Bruk protease og fosfatasehemmerholdig buffer innen 1 time etter tilberedning på grunn av ustabilitet i vandige løsninger.
  2. Prosess for nevrokjemi
    1. Bruk striatum dissekert fra den andre halvkule fra hver prøve lagret ved -80 °C for HPLC. Tine striatalvev i mikrofunksjonsrør på is, tilsett 500-μl 0,3N perklorsyre (PCA) og homogeniser ved hjelp av soniker.
      Merk: For å lage 100 ml 0,3N PCA, mål 90 ml ddH2O, legg til en 100 ml gradert sylinder, tilsett 2,58 ml 70% PCA, og ta med til 100 ml. Denne prøvebufferen kan lagres ved 4 °C i opptil én måned.
    2. Soniker striatalt vev i 500-μl iskaldt 0,3N PCA, for 10 pulser ved 10-12 Hz og legg på is. For å sikre homogenitet, soniker prøver en gang til i 10 sek, deretter sentrifugere i 12 min ved 4oC ved 16,100xg.
    3. Dekanter umiddelbart supernatant til 1,5 ml mikrocentrifugerør og oppbevares ved -80 °C. Lufttørk pelletsfraksjonen i hetten.
    4. Opprettholde supernatant ved -80 °C til bruk for måling av dopamin og dets metabolitter, 3,4-dihydroksyfenylacetic acid (DOPAC) og homovanillsyre (HVA) av HPLC med elektrokjemisk deteksjon.
    5. Når den er tørr, rekonstituer pelletsfraksjonen i 0,5N NaOH (500 μL), og sonicate kort. Oppbevar rekonstituert pelletsfraksjon ved 4 °C til bruk for bestemmelse av totalt protein ved hjelp av Lowry-metoden.
  3. Prosess for immunhiistokjemi
    1. Nedsenkningsfiks midt- og bakhjerneblokker over natten i 4% formaldehyd vandig løsning og kryoprekt i graderte sukroseløsninger (10% i fosfatbufret saltvann (0,01 M PBS; 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl og ddH2O, pH 7,4) i 24 timer, deretter 30 % i PBS til vevet synker) ved 4 °C. Kort blot kryopregerte blokker for å fjerne overflødig sukroseoppløsning, fryse på tørris og lagre ved -80 °C til bruk.
    2. Mikrotome-seksjonering av hjerneblokker som inneholder midt- og bakhjerne i en kryostat.
      1. Fjern vev fra -80 °C, likevekt ved -16 °C i 1 time i kryostat, og monter i vevsinnbyggingsmedier.
      2. Samle koronal seksjoner ved 40-μm tykkelse i kryopreotekt oppløsning (0,01M PBS med 30% sukrose, 30% etylenglykol, pH 7,4) ved -16 °C. Samle vevet serielt inn i 6 1,5 ml mikrosenterrør med intervaller på 240 um og oppbevar ved -20 °C.

6. Immunoblotting

  1. Bestemme proteinkonsentrasjon i striatal supernatantfraksjon (fremstilt som beskrevet i avsnitt 5.1) ved BCA-analyse.
  2. Beregn fortynning som kreves for hver prøve for å gi 10 μg per brønn levert i 20 μl volum.
  3. Fortynn supernatantprotein med 4X Laemmli buffer og homogeniseringsbuffer for å gi 10 μg protein i 1X Laemmli bufferløsning. Eksempel på beregning:
    1. Bestem endelig konsentrasjon av protein og volum som kreves. I dette tilfellet er det nødvendig med 10 μg i 20 μl (0,5 mg/ml).
    2. Bestem det endelige volumet av proteinoppløsningen som trengs. Selv om 20 μl er nødvendig for lasting, bør ekstra volum utarbeides (30 μl).
    3. Siden det endelige volumet og konsentrasjonen er kjent, og konsentrasjonen av proteinet supernatantfraksjon er kjent (bestemt av BCA-analysen), beregn volumet av proteinet supernatant som kreves ved hjelp av ligningen:
      Vsupernatant = (Vendelig xC-finale)/C supernatant
      For en supernatant proteinkonsentrasjon på 1,5 mg/ml,
      Vsupernatant = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      Vsupernatant = 10 μl
    4. Beregn mengden 4X Laemmli buffer som kreves for å gi en 1x konsentrasjon i 30 μl volum (30 μl / 4 = 7,5 μl). Merk: 4X Laemmli buffer må fortynnes til 1X styrke i prøvepreparatet.
    5. Beregn mengden homogeniseringsbuffer som kreves for å bringe volumet til 30 μl (og oppnå ønsket endelig proteinkonsentrasjon på 0,5 mg / ml):
    6. Forbered prøven ved å virvelere og deretter pipettering 10 μl protein supernatant i 12,5 μl homogeniseringsbuffer. Tilsett 7,5 μl 4X Laemmli buffer for en 30-μl prøve arbeidsløsning og 0,5 mg/ml konsentrasjon.
  4. Forbered alle prøver ved hjelp av prosedyren som er beskrevet, virvel og kok i 5 min.
    Merk: Bruk mikrosenterrør med skrue topp for å forhindre lekkasje og åpning på grunn av trykk under koking.
  5. Etter 5 min, legg straks på is. Last 20 μl prøvearbeidsløsning per gelbrønn (10 μg protein). Separate proteinprøver av SDS-PAGE på en 12% Tris-glycingel.
    1. Bruk en pre-farget protein stige for bekreftelse av molekylvekter. Løpebufferen er 25 mM Tris-base, 192 mM glycin, 0,1 % SDS og ddH2O, pH 8,3.
    2. Separate proteiner ved elektroforese: Kjør ved 80 V for å fjerne brønnene (10 min) og 125 V (ca. 1 t; til proteinstigen er helt separert) for å løse proteinene.
  6. Utfør protein-til-nitrocelluloseoverføring ved hjelp av 0,2 μm nitrocellulosemembran i Tris-glycinoverføringsbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,04% SDS, 20% metanol og ddH2O, pH 8,3) over natten for 40 V ved 4 °C.
  7. Vask nitrocelluloseflekker i 1x Tris saltvann (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl i ddH2O, pH 7.4) i 10 min ved RT. lncubate i Ponceau S i 5 min skyll deretter i ddH2O for å gi en grov verifisering av tilsvarende proteinbelastning. Skann bilde for å beholde posten for bærbar PC og destain ved hjelp av PBS.
    Merk: Alternativt kan du vaske flekk i Milli-Q eller ddH2O som inneholder HCl (0,2 %) i ca. 5 min. Søk etter post. Fjern Ponceau S-flekken fra membranen ved etterfølgende inkubasjonstrinn (dvs. plasser i blokkeringsbufferen).
  8. Blokker flekker i 5% ikke-fett melkepulver i TS i 1 time ved RT og inkuber 24 timer ved 4ºC med kanin anti-tyrosinhydroksylase (1:1000),anti-β-aktin (1:200); anti-GFAP (1:1000) i 5% melk-TS.
  9. Vask flekker 3 x 5 min i TS med 0,05% Tween-20 og 1 x 5 min i TS, og inkuber deretter i HRP-konjugert sekundært antistoff (1:5000 i TS som inneholder 5% melk), tilpasset arten av primær, i 2 timer ved RT.
  10. Forbered chemiluminescent substrat ved hjelp av like store mengder luminol- og peroksidløsninger og søk i 1-3 min. I et mørkerom, plasser blott i en plasthylse for filmeksponering og eksponering for film; filmen utvikles deretter ved hjelp av en automatisk prosessor.
  11. Strip blotter med kommersielt tilgjengelig stripping buffer ved 37°C i 30 min, vask 3x 10 min i TS med 0,05% Tween-20, og 1x 10 min i TS og deretter bebreide for lasting kontroll eller annet protein av interesse.
  12. Kvantifisere signalene fra Image J-programvare for optiske tetthetsmålinger og normalisere til den interne lastekontrollen β–aktin.

7. Nevrokjemi

  1. Vev til analyse fremstilles som beskrevet ovenfor i pkt. 5.2. Se tabell 1 for mobilfaseoppskrift.
    Merk: Alle reagenser må være ≥99.0% rene og av HPLC-grad. Sørg for bufferintegritet med rent, dedikert glass og rørestenger. Mobil fasebuffer bør benyttes innen syv dager etter klargjøring.
    1. Vei dihydrogenfosfat og sitronsyre, tilsett 1 L ddH2O og bland i en 2-L gradert sylinder. Filtrer løsningen gjennom en 0,22-μm GSTF-membran.
      Merk: Dette maksimerer utvinningen av forurensninger i fosfat og sitronsyre, noe som bidrar til å minimere bakgrunnsstrømmer.
    2. Tilsett OSA etterfulgt av acetonitril- og EDTA-løsningen. Tilsett HPLC grad ddH2O til ca. 1900 ml før du justerer pH til 3,0 med fosforsyre.
    3. Legg HPLC grad ddH2O til 2-L-merket, og hell deretter i en 2-L kolbe. Tilsett en dedikert rørestang, og avfett den mobile fasen ved å røre den under vakuum i > 10 min.
  2. Forbered standardene for dopamin, og DOPAC og HVA for standardkurver. Lagerløsninger av standarder fremstilles ved 1 mg/ml i 0,3 N PCA.
    1. Vei 12,4 mg dopamin-HCl, og tilsett 10,0 ml 0,3 N PCA for å lage 1 mg/ml dopamin.
    2. Vei 10,0 mg DOPAC, og tilsett 10,0 ml 0,3 N PCA for å lage 1 mg/ml DOPAC.
    3. Vei 10,0 mg HVA, og tilsett 10,0 ml 0,3 N PCA for å lage 1 mg/ml HVA.
  3. Forbered arbeidsstandardløsninger fra lagerløsningene. Fempunktsstandarder brukes til å generere en konsentrasjonskurve.
    1. For måling av striatal dopamin, lag standardkonsentrasjoner på 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml og 200 ng/ml.
    2. For striatal DOPAC, lag standardkonsentrasjoner på 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml og 40 ng/ml.
    3. For striatal HVA, lag standardkonsentrasjoner på 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml og 80 ng/ml.
    4. Generer fempunktsstandarder: fortynn 1 mg/ml dopamin lageroppløsning til 5 μg/ml ved bruk av 0,3N PCA. Fortynn 1 mg/ml DOPAC-lageroppløsning til 1 μg/ml ved bruk av 0,3N PCA, og fortynn 1 mg/ml HVA-lageroppløsning til 2 μg/ml ved bruk av 0,3N PCA.
    5. Overfør 1 ml 5 μg/ml dopamin, 1 ml 1 μg/ml DOPAC og 1 ml 2 μg/ml HVA i en 25 ml volumetrisk kolbe og ta volumet til 25 ml merke med 0,3 N PCA.
      Merk: De blandede standardene i den volumetriske kolben inneholder den høyeste konsentrasjonen av fempunktsstandardene: 200 ng/ml dopamin, 40 ng/ml DOPAC og 80 ng/ml HVA.
    6. Overfør 1 ml av de blandede standardene til rene 1,5 ml mikrosenterrør. Utfør 1:1 seriell fortynning fire ganger for å generere de påfølgende firepunktsstandardene.
      1. For eksempel, til 250 μl av de blandede standardene, tilsett 250 μl prøvebuffer og virvel grundig for å produsere blandede standarder ved 50% av originale konsentrasjoner; gjenta prosessen til ønskede fortynninger er oppnådd.
  4. Klargjør HPLC-systemet (pumpe, autosampler, omvendt fasekolonne (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). Tøm pumpen med fersk mobil fase for å erstatte alle tidligere løsninger i HPLC-systemet og fanget luftbobler med frisk mobil fase. Kjøl autosampleren til 4 °C. Varm kolonnen til 35°C, noe som reduserer det totale trykket.
    1. Still inn spenningen på henholdsvis -150 mV og 220 mV for den første og andre elektroden til den elektrokjemiske detektoren. Likevekt systemet i minst 2 timer, og ideelt over natten, med den mobile fasen med en strømningshastighet på 0,2 ml / min.
      Merk: Under likevekt skal cellene være på, og grunnlinjeavlesningen overvåkes. Stabil avlesning indikerer at systemet er klart til bruk. I de to timene av likevektsfasen, la den mobile fasen gå inn i en avfallsbeholder i stedet for å resirkulere den. Etter denne perioden kan den mobile fasen resirkuleres over natten for likevekt.
    2. Når likevekten er fullført, justerer du den mobile fasestrømningshastigheten til 0,6 ml/min. Injiser 20 μl av hver av de fempunktsstandardene.
  5. Tine striatalprøver på is, og injiser 2 x 20 μl av hver prøve i HPLC-systemet. Bruk standarder i begynnelsen og tilfeldig gjennom hvert sett med striatalprøver.
  6. Bruk programvaren til å analysere området under dopamin-, DOPAC- og HVA-topper produsert av standardene og prøvene. Identifiser analytter ved oppbevaringstid og mål ved å sammenligne området under topp med 5-punktskurven for den tilsvarende standarden.
  7. Forbered pelletsfraksjon som beskrevet i avsnitt 5.2.3. Utfør en Lowry proteinanalyse på striatal pellet. Merk: Denne analysen vil måle mengden protein som er tilstede i striatalprøvene i mg/ml; denne informasjonen brukes til å bestemme ng/mg-konsentrasjonen av analytt.

8. Immunohistokjemi

  1. GFAP/TH dobbel immunfluorescens
    1. Fjern rør som inneholder seksjonert midbrain fra -20 °C fryser og ta med til RT. Fjern vevsseksjoner som inneholder substantia nigra fra kryopreserveringsmiddeloppløsning i et brett som inneholder PBS.
    2. Plasser vevsseksjoner i polystyreninnlegg med polyesternettbunner for frittflytende immunkjemi. Vask 3 x 5 min i PBS.
    3. Overfør seksjoner til 96-brønnsplate med 180-μl blokkløsning (5% normalt eselserum, 1% PVP, 1% BSA og 0,3% Triton X-100 i PBS) i hver brønn. Inkuber 40 min på RT.
      Merk: Alle vaske- og inkubasjonstrinn utføres med lett agitasjon på shaker.
    4. Overfør seksjoner til brønner som inneholder den primære antistoffløsningen (180 μl per brønn). Inkuber i primær antistoffcocktail, kanin anti-GFAP (1:1000) og sau anti-TH (1:400) fortynnet i PBS med 1% BSA og 0,3% TX-100, i 24 timer ved 4°C. IgG fra primærartene fungerer som den negative immunstainingskontrollen.
    5. Inkuber i sekundær antistoffcocktail (1:200 esel anti-kanin 568 og 1:200 FITC esel anti-sauer i PBS med 0,1% TX-100). Bruk folie for å beskytte løsningen mot lys under forberedelse og inkubasjon; inkubere ved RT i 2 timer.
      1. For en negativ kontroll, inkubere seksjoner i IgG fra primærartene fortynnet til samme konsentrasjon som brukes til de primære antistoffene.
      2. Vask 2 x PBS og 1 x TS i 5 minutter hver på RT. Monter vevsseksjoner på pluss lysbilder i monteringsmedium med Hoechst-flekk og deksler.
    6. Inkuber i sekundær antistoffcocktail (1:200 esel anti-kanin 568 og 1:200 FITC esel anti-sauer i PBS med 0,1% TX-100). Bruk folie for å beskytte løsningen mot lys under forberedelse og inkubasjon; inkubere ved RT i 2 timer.
    7. Vask 2 x PBS og 1 x TS i 5 minutter hver på RT. Monter vevsseksjoner på pluss lysbilder i monteringsmedium med Hoechst-flekk og deksler.
    8. Beskytt lysbildene mot lys og oksidasjon til avbildning ved å oppbevare dem i en skyveboks ved 4 °C.
    9. Analyser den negative kontrollen først for å bestemme bakgrunnsnivået av fluorescens, og evaluer deretter for positiv immunoreaktivitet ved hjelp av fluorescerende mikroskopi.
  2. Iba1 immunhiistokjemi med kromoagen nedbør
    1. Fjern rør som inneholder seksjonert midbrain fra -20 °C fryser og ta med til RT. Fjern vevsseksjoner som inneholder substantia nigra fra kryopreserveringsmiddeloppløsning i et brett som inneholder PBS.
    2. Plasser vevsseksjoner i polystyreninnlegg for frittflytende immunkjemi. Vask seksjonene 3 x 5 min i PBS, og plasser seksjonene direkte i 12-brønnsplaten som inneholder forvarmet 10 mM sitronsyremonohydrat, pH 9,0, 80 °C i 30 minutter, for epitoputhenting.
    3. Avkjøl plate 20 min ved RT. Returner seksjonene til innsatser og vask 3 x 5 min i PBS.
    4. Overfør seksjoner til 96-brønnsplate som inneholder 180-μl blokkeringsløsning (10% normalt geiteserum, 1% BSA i PBS) per brønn, og inkuber 40 min ved RT.
    5. Overfør seksjoner til brønner som inneholder 180-μl fortynnet primært antistoff (1:1000 i 1% BSA-PBS). Inkuber over natten ved 4 °C.
    6. Overfør inndelinger til innlegg. Vask 3 x 5 min PBS og påfør biotinylert sekundært antistoff (1:200 i 1,5% normal serum-PBS) i 1 time ved RT.
    7. Klargjør ABC-oppløsning 30 min før bruk. Vask 3 x 5 min PBS og overfør til ABC-løsning i 1 time ved RT.
    8. Forbered DAB-oppløsning i hette. Vask 2x 5 min i PBS og 1x 5 min i TS, og inkuber seksjoner i DAB.
      1. Utvikle i 3-4 min. Negativ kontroll bør forbli lys i fargen.
        Merk: Utfør dette trinnet i avtrekkshette da DAB er et kjent kreftfremkallende middel. En løsning på 0,2 M kaliumpermanganat i ddH2O for dekontaminering bør opprettholdes i nærheten ved utilsiktet drypp.
    9. Skyll seksjonene kort i ddH2O, deretter i TS 3 x 5 min. Monter seksjoner på pluss lysbilder og lufttørk over natten i avtrekkshette.
    10. Dekontaminer DAB-avfall med et likt volum på 0,2 M kaliumpermanganat i ddH2O, virvel og inkuberes i en avtrekkshette over natten før det oppbevares i riktig merket DAB-avfallsbeholder i avtrekkshette.
      Merk: Blekemiddeloppløsning eliminerer ikke de mutagene egenskapene til DAB.
      1. Dekontaminere gjenstander som skal gjenbrukes (dvs. polystyreninnlegg) og vaskes med vaskemiddel.
    11. Dehydrer/tellere oppnås lett med Cresyl fiolett (CV). Alle dehydrerings-/vasketrinn er 3 min: etanol 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 sekunder), ddH20 x 2, 95% etanol + issyre (0,1%) x 2, 100 % etanol og xylen.
    12. Dekslerlip i distyren-toluen-xylen monteringsmedium og tørr i avtrekkshette.
    13. Observer positiv immunoreaktivitet med et lysmikroskop. IgG fra primærartene fungerer som den negative immunstainingskontrollen.

9. Statistikk

  1. Vurdere forskjeller mellom midler ved enveisvariasjonsanalyse (ANOVA) for å sammenligne forskjeller mellom genotype og toveis ANOVA for å sammenligne forskjeller mellom genotype og toksisk behandling. Bruk Tukeys HSD post hoc-analyse når forskjeller observeres ved ANOVA-testing (p≤0,05).
    Merk: Eksperimenter (med n = 6-9 mus/gruppe) utføres minst to ganger for å sikre reproduserbarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette toksineksponeringsparadigmet kan produsere en betydelig og påviselig 20% striatal dopaminuttømming hos MPTP- vs. saltvannsinjiserte dyr. Det er viktig å merke seg at forskjellige mange MPTP kan gi litt mer eller mindre lesjon; For bedre presisjon anbefales derfor et foreløpig eksperiment i wildtype mus før bruk i transgener når en ny masse nevrotoksin brukes. Bruken av mild til moderat lesjon gjør det mulig å observere virkningen av transgene; en alvorlig lesjon kan gi en "gulveffekt" med skade for robust til å dempe eller så skadelig at den formørker effekten av en skadelig genetisk endring. Effekten av MPTP på striatal dopamin var signifikant forskjellig hos 5-LOX isozyme-mangelfulle mus, men ikke 12/15-LOX isozyme-mangelfull mus (Figur 1). Videre, med disse metodene, var vi i stand til å skjelne en betydelig forskjell i dopaminnivåer på grunn av 5-LOX-mangelen på saltvannsbehandlede mus (figur 1).

Immunoblotting for henholdsvis TH og GFAP tillot bekreftelse av skade og nevroinflammasjon, på nivået av striatum i wildtype mus, en effekt som ble redusert i 5-LOX isozyme-mangelfull striatum (Figur 3A og 3B). Lesjonen er også merkbar på nivået av substantia nigra (Figur 2A og 2B). I de samme musene er uttømming av TH-positive nevroner og økt GFAP-immunoreaktivitet observerbar ved hjelp av dual-label immunfluorescent merking (Figur 2A). Videre, markert forhøyet mikroglial aktivering (dvs. Iba1 immunoreaktivitet) i wildtype, men ikke 5-LOX isozyme-mangelfull, mus er tydelig i substantia nigra etter MPTP-eksponering (Figur 2B). Dermed kan MPTP-modellen gi et nyttig verktøy for å vurdere virkningen av genetisk predisposisjon til niggerdegenerasjon og betennelse.

Figure 1
Figur 1. LOX isozyme-selektive effekter på striatal dopamin etter MPTP-utfordring. (A) Striatal homogenater ble brukt til å måle dopamin (DA) av HPLC fra WT og 5-LOX-/- kullkamerater gitt saltvann eller MPTP (n = 6-8 / gruppe). ‡, markerer en betydelig effekt på grunn av genotype; p<0,05. *, markerer en betydelig effekt på grunn av genotype og behandling; p<0,05. Ingen signifikant forskjell på grunn av behandling ble notert hos 5-LOX-/- mus (n.s.) som indikerer at MPTP ikke produserte striatal DA-uttømming i denne transgene linjen. (B) Striatal homogenater ble brukt til å måle DA i WT og 12/15-LOX-/- kullkamerater gitt saltvann eller MPTP (n = 6-9 / gruppe). Ingen signifikant forskjell i DA-nivåer på grunn av genotype ble observert. En betydelig, og lignende, reduksjon på grunn av MPTP-behandling ble notert i begge genotyper. *, p<0.01. Data vises som gjennomsnittlige ± SEM.

Figure 2
Figur 2. 5-LOX isozym effekter på nigral TH og astroglia etter MPTP utfordring. (A) Immunfluorescence farging for TH (FITC; grønn) og GFAP (568; rød) immunoreaktiviteter ble utført i nigral hjerne seksjoner fra WT og 5-LOX-/- kullkamerater gitt saltvann eller MPTP. Færre TH-positive cellelegemer (*) og forbedret GFAP-immunoreaktivitet er tydelige i WT-MPTP-gruppen. Bar = 25 μm. (B) Immunhiistokjemisk histologi for Iba-1 på mikroglia ble oppdaget ved hjelp av DAB (brunt kromatgen); ble motarbeidet av Cresyl fiolett. Nigral seksjoner fra WT og 5-LOX-/- kullkamerater behandlet med saltvann eller MPTP ble vurdert. Mikroglia med ramifiserte cellelegemer og lange forgreningsprosesser observeres i substantia nigra fra saltvannsbehandlede mus (pilhoder). Aktivert mikroglia med avrundede cellelegemer og korte, fortykkede prosesser ble observert i substantia nigra fra MPTP-behandlede mus (piler). Bar = 10 μm.

Figure 3
Figur 3. 5-LOX isozym effekter på striatal TH og inflammatorisk etter giftig fornærmelse. (A) Striatal TH-proteinnivåer ble semi-kvantitativt målt ved vestlige blotteanalyser av homogenat fra WT og 5-LOX-/- kullkamerater gitt saltvann eller MPTP (n = 6-8 / gruppe). Immunoreaktivitet, målt ved optisk tetthet, ble normalisert til β-aktin. *, p<0,05. (B) Tilsvarende ble GFAP semi-kvantitativt målt ved vestlige flekkanalyser av striatal homogenat fra WT og 5-LOX-/- kullkamerater gitt med saltvann eller MPTP (n = 6-8 / gruppe) og normalisert til β-aktin. *, p<0,05. Data er notert som gjennomsnittlig ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utformingen av denne gen-miljø interaksjonsstudien tillot oss å få ny informasjon om den doble naturen til 5-LOX isozymet i nigrostriatalveien. Ved å utføre HPLC for å måle striatale monoaminer etter saltvanns- eller MPTP-behandling hos transgener som mangler 5-LOX-isozymet og deres wildtype-kull, kunne vi merke oss at mangelen ser ut til å være beskyttende under giftige forhold (figur 1), men under normale forhold reduserer mangel på enzymet striatal dopaminnivåer og kan være skadelig. Dermed er vi i stand til å demonstrere at 5-LOX isozymet bidrar til striatal dopaminerg tone under normale forhold, men kan bidra til skade etter toksisk utfordring4.

Mens videre evaluering bør gi ny mekanistisk innsikt i rollen som LOX-isozymer i nigrostriatal toksisitet, avslørte vestlige blotanalyser (figur 3) samt immunhiistokjemiske studier (figur 2) at nevroinflammasjonsmarkører i det minste delvis ble svekket i den 5-LOX isozyme-mangelfulle kohorten utsatt for MPTP. Disse funnene, ved hjelp av klassiske biokjemiske og histologiske teknikker, indikerer en kritisk rolle for 5-LOX-produkter i potensiering av mikro- og astro-glial aktivering4.

Avhengig av gen-miljø interaksjon undersøkt, patologiske avlesninger i tillegg til glial aktivering kan analyseres. Spesielt viktig i PD er tap av dopaminerge nevroner i substantia nigra og potensielt patologisk akkumulering og aggregering av α-synuklein. Langs denne linjen har effekten av toksisk celledød hos transgene mus med α-synuclein overekspression blitt overvåket ved evaluering av nigral celledød (dvs. ved bruk av objektivt stereologisk celletelling) og uoppløselig α-synucleinavsetning32-35.

MPTP-dosen som brukes i paradigmet som er beskrevet her, gir en mild lesjon med beskjeden, men signifikant, striatalskade (figur 1) og glialaktivering i både striatum og substantia nigra (figur 2 og 3). Vanligvis brukes høyere doser av toksikum til å produsere robust nigral dopaminerg celletap og striatal dopaminnedbrytning23,24,32,36-38,39. Det er viktig å merke seg at toksisiteten til MPTP kan variere mellom leverandører og tomter; doser må derfor justeres for å produsere ønsket lesjon. Videre er andre faktorer som må vurderes belastningen og kjønn av dyr som brukes til studiene. Selektiv følsomhet overfor nevrotoksinet har blitt demonstrert i distinkte bakgrunnsstammer av mus, et fenomen som i det minste delvis skyldes forskjeller i aktivering av subcellulære veier som formidler degenerasjon, inkludert JNK og c-Jun36-39. Kjønnsavhengige forskjeller i MPTP-toksisitet er også rapportert40,41, og kan bidra til variasjon i studier ved bruk av transgene mus der begge kjønn brukes til dårlige avlslinjer. I et slikt tilfelle er bruk av sex-matchede wildtype-kontroller kritisk4. Slike kjønnsrelaterte effekter kan utgjøre forskjellen i lesjon observert hos WT-musene mellom eksperimenter som tester virkningen av 5- og 12/15-LOX-mangelfulle mus der ett kjønn ble brukt til en linje og begge kjønn for den andre (Figur 1). For gen-miljø interaksjonsstudier anbefales ikke en MPTP-utfordring som gir alvorlig skade(f.eks. >80% reduksjon i striatal dopamin), da dette kan maskere en mulig genetisk effekt.

Mens MPTP-eksponering produserer nikantcelledød3,42, striatal dopaminnedbrytning3, kompleksI-hemming 43-45, og glialaktivering46,47 som er rapportert i human PD, i mus, en sakte progressiv degenerasjon som produserer stabil parkinsonisme(dvs. motoriske underskudd) og ærlige α-synukleinpatologi (dvs. Lewy kropper og neurites) fullt ut recapiterende kjennetegn ved sykdommen forekommer ikke i modellen. Det er imidlertid viktig å merke seg at MPTP-musen har spilt en kritisk rolle i å forstå subcellulære veier som bidrar til PD-relatert nevrodegenerasjon. Variasjon i eksponeringsparadigmer, for eksempel, har avslørt aktivering av distinkte mekanismer for toksisitet: lavdose, subakutt eksponering fremmer apoptotisk celledød48 med en begrenset immunrespons49 mens akutt behandling med høyere doser gir markert mikroglial aktivering50. Faktisk bør slike faktorer vurderes ved bruk av modellen for effektstudier og, relevant for den nåværende studien, for å avdekke virkningen av en potensiell genetisk risikofaktor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det er ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health NIGMS 056062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01 counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt 7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

Tags

Medisin Utgave 83 MPTP dopamin Iba1 TH GFAP lipoksygenase transgene genmiljøinteraksjoner mus Parkinsons sykdom nevrodegenerasjon nevroinflammasjon
Gen-miljø interaksjonsmodeller for å avdekke følsomhetsmekanismer ved Parkinsons sykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R.,… More

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter