Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Modeller för genmiljöinteraktion för att avslöja känslighetsmekanismer vid Parkinsons sjukdom

Published: January 7, 2014 doi: 10.3791/50960
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

Summary

Lipoxygenas (LOX) isozymer kan generera produkter som kan öka eller minska neuroinflammation och neurodegeneration. En gen-miljö interaktion studie kan identifiera LOX isozyme-specifika effekter. Genom att använda 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) modellen av nigrostriatal skada i två LOX isozym-bristfälliga transgena linjer möjliggör jämförelse av bidraget från LOX isozymer på dopaminerg integritet och inflammation.

Abstract

Lipoxygenas (LOX) verksamhet har varit inblandad i neurodegenerativa störningar såsom Alzheimers sjukdom, men dess effekter i Parkinsons sjukdom (PD) patogenes är mindre förstådda. Modeller för interaktion mellan gen och miljö har nytta av att avslöja effekterna av specifika cellulära vägar i toxicitet som kanske inte observeras enbart med hjälp av en enbart genetisk eller toxikant sjukdomsmodell. För att utvärdera om distinkta LOX-isozymer selektivt bidrar till PD-relaterad neurodegeneration kan transgena (dvs. 5-LOX och 12/15-LOX-bristfälliga) möss utmanas med ett toxin som efterliknar cellskada och död i sjukdomen. Här beskriver vi användningen av ett neurotoxin, 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), som producerar en nigrostriatal lesion för att klargöra de distinkta bidragen från LOX isozymer till neurodegeneration relaterade till PD. Användningen av MPTP i mus, och nonhuman primat, är väletablerad för att rekapitulera nigrostriatal skada i PD. Omfattningen av MPTP-inducerad lesioning mäts genom HPLC analys av dopamin och dess metaboliter och semi-kvantitativa western blot analys av striatum för tyrosin hydroxylase (TH), det hastighetsbegränsande enzymet för syntesen av dopamin. För att bedöma inflammatoriska markörer, som kan visa LOX isozym-selektiv känslighet, stödjeceller fibrillary sura protein (GFAP) och Iba-1 immunohistokemi utförs på hjärnsektioner som innehåller substantia nigra och GFAP Western blot analys utförs på striatal homogenates. Detta experimentella tillvägagångssätt kan ge nya insikter i gen-miljö interaktioner underliggande nigrostriatal degeneration och PD.

Introduction

Användning av modeller för genmiljöinteraktion ger en metod för att efterlikna riskfaktorer som sannolikt påverkar idiopatisk Parkinsons sjukdom (PD) och ger en möjlighet att urskilja mekanistiska insikter som sannolikt inte kommer att klargöras enbart genom användning av ett genetiskt eller toxiskt system1,2. Här illustrerar vi denna punkt och beskriver tillämpningen av musmodellen 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) av nigrostriatal degeneration3 för att bättre förstå selektiviteten av lipoxygenas (LOX) isozym aktivitet på neuroinflammation ochtoxicitet 4. Medan en roll för LOX isozymer har utvärderats i stor utsträckning i periferastörningar 5,6 samt CNS sjukdom inklusive stroke7 och Alzheimers sjukdom8,9, rollen av familjen av isozymer i nigrostriatal funktion och degeneration relaterade till PD är inte väl förstådd och motiverar studie. MPTP neurotoxin visar förmånlig degeneration av nigrostriatal utbildningsavsnittet och rekapitulerar striatal dopamin utarmning och nigral dopaminerg cellförlust som ligger till grund för motoriska nedskrivningar hos PD patienter10. Medan denna modell inte reproducerar hela kadern av nonmotor och motor PD beteenden och frank α-synuklein-positiv Lewy kroppspatologi, Det har varit användbart att klargöra nya mekanistiska mål som bidrar till nigrostriatal skada och för tidiga translationella tester eftersom det är den bäst karakteriserade noninvasive modellen tillgängliga för att tillförlitligt producera nigral celldöd åtföljd av striatal dopamin förlust11-15. Bred användning av MPTP-musen, med paradigm som sträcker sig från akut, subakuteradtill kronisk 16-18, har gjort det möjligt för standardisering av dosering att resultera i mild till svår nigrostriatalskada 19,20 med aktivering av olika mekanismer för toxicitet beroende på behandlingsregimen18,21,22. Detta gör det möjligt att rikta in sig på ett "lesionsfönster" som kan leda till förstärkt eller minskad nigrostriatal skada beroende på det terapeutiska medlet eller den transgena modellensom används 23–25.

Också viktigt för translationella och upptäcktsbiologiska studier är de tekniker som används för att bedöma skador och de bevis som sådana metoder ger. För MPTP mus modell, etablerade mätvärden för att utvärdera lesionering är mätning av markörer av striatal dopaminerg ton, inklusive dopamin och dess metaboliter av HPLC, och western blot analys av tyrosin hydroxylase (TH), det hastighetsbegränsande enzymet i dopaminsyntesen och indikatorer på degenerativa händelser såsom gliaaktivering med hjälp av western blot analys och immunohistokemi4. Även om dessa är klassiska neurokemiska, biokemiska och histologiska förfaranden, teknikerna ger kritiska och reproducerbara avläsningar om omfattningen av skador inom den nigrostriatala dopaminerga vägen, indikerar mekanismer för toxicitet och har visat sig vara värdefulla verktyg för att förstå degenerativa händelser i PD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anm.: Alla djurförsök och djurvårdsmetoder bör godkännas av institutionens institutionella kommitté för djurvård och användning (IACUC). Studien som beskrivs här utfördes i enlighet med de riktlinjer som fastställts av SRI Internationals IACUC.

1. Förvärv och underhåll av LOX-bristfälliga möss

  1. Köp 5-LOX-bristfälliga eller 12/15-LOX-bristfälliga möss och respektive stam- och könsmatchade kontroller vid 7-8 veckors ålder och låt flera dagar för acklimatisering till anläggningen efter ankomst.
  2. Underhåll möss i grupphus på en 12-h ljus-mörk cykel och ge mat och dricksvatten ad libitum.

2. MPTP-försiktighetsåtgärder, lagring, förberedelse, sanering och bortskaffande

Obs: MPTP berusning från intravenös exponering hos människor har visat sig orsaka parkinsonism10; MPTP är mycket lipofila och kan lätt korsa blod - hjärnbarriären26. Försiktighetsåtgärder bör vidtas för att säkerställa säker hantering, avgiftning och bortskaffande. Dess metabolism innebär flera steg inklusive omvandling till 1-metyl-4-fenyl-2,3-dihydropyridinium av enzymet monoaminoxidas B (MAO-B)27. MAO-B-hämmare kan användas vid oavsiktlig mänsklig berusning.

  1. Se till att personalen har lämplig säkerhets- och hanteringsutbildning innan de använder MPTP enligt vad som dikteras av institutionens hälso- och säkerhetskommitté. Varje institution får fastställa och genomföra sina egna standardrutiner för användning av MPTP, på grundval av rekommendationer som på ett heltäckande sätt beskrivsi litteraturen 17,22.
  2. Före beredningen, använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) inklusive följande: engångslabbrock eller helkroppsdräkt, dubbla nitrilhandskar, kirurgisk mask, hårskydd, skyddsglasögon och engångsskoskydd. Korrekt personlig skyddsutrustning ska bäras under beredningen av MPTP, injektionsparadigmet och 72 timmar efter injektion vid hantering av djur och/eller sängkläder.
  3. Utför beräkningar före förberedelsen. Institutionella riktlinjer för dosvolymer bör följas. leverans av 100-150 μl används vanligtvis för 25-30 g möss.
    1. För att förbereda en 3 mg/ml MPTP-lösning i saltlösning, applicera en korrigeringsfaktor (1,211 MPTP-HCl: 1,0 MPTP fri bas); koncentrationen av MPTP-HCl i saltlösningsfordon är 3,633 mg/ml.
    2. Förbered all utrustning, förnödenheter och reagenser som behövs för MPTP-förberedelse och potentiell spilldekontaminering innan neurotoxinet används.
  4. Ta bort KÄLLFLASKAN MPTP-HCl från rätt lagringsplats.
    MPTP bör underhållas på RT i en sluten flaska i en sekundär behållare och lagras i ett låst skåp, märkt "MPTP".
    1. Täck området kring vågar med dynor eller pappershanddukar fuktade med 10% blekmedelslösning för att minska risken för spillt pulver. Förvara vävnader och 10% blekmedelslösning i närheten som en försiktighetsåtgärd.
    2. Använd en analytisk balans i en rökhuv och väg 50 mg MPTP-HCl i glasflaska med sekundär inneslutning som innehåller 10% blekmedelsdränkt vävnad. Märk glasflaskan "MPTP" med koncentration och datum.
    3. Stäng källflaskan och torka utsidan med 10% blekmedel.
  5. Tillsätt långsamt 13,763 ml steril koklösning till injektionsflaskan och stäng helt för blandning. (Lösningen är 3.633mg/ml MPTP-HCl.)
    1. Sterilisera MPTP-lösningen noggrant genom filtrering med hjälp av ett 0,22 μm-filter till märkt injektionsflaska i en sekundär behållare med 10% blekmedelsdränkt vävnad. Rengör spill med blekmedelsdränkt vävnad.
    2. Kassera försiktigt vassa föremål och injektionsflaska i lämpligt märkt biohazardbehållare. Behåll MPTP-lösningen i injektionsflaskan i sekundärbehållaren med blekmedelsdränkt vävnad för transport till djurprocedurrummet.
      Obs: Spara inte automatiskt MPTP-lösning för sterilisering eftersom dess förångning är en inandningsrisk.
  6. Returnera MPTP-källflaskan till den sekundära behållaren och placera den på lagrings platsen. Dekontaminera spatel, analytisk skala och huva yta i 10 min med 10% blekmedel.

3. MPTP-administration

  1. Förbered engångsburar med standard microisolator perforerade lock som innehåller polyesterfiltrerade liners märkta "MPTP" (minus trådmatgrill), engångsburfoder, fört våta matpellets och hydrogel som vattenkälla. Väg alla djur och registrera volymen 3 mg/ml MPTP i saltlösning som krävs för 15 mg/kg injektion.
    Obs: MPTP-metaboliter kan detekteriseras i exkret i 3 dagar efter injektion28,29; Möss utsöndrar dock MPTP n-oxid, ett giftfritt derivat som inte korsar membran på grund av dess hydrofilicitet30.
    1. Bär all personlig skyddsutrustning som anges ovan och håller möss över en engångsabsorptionsplatta, injicera saltlösning eller MPTP-lösning för 15 mg/kg dos i intraperitoneal hålighet (dvs. dagligen i 4 dagar med en engångs 26-gauge tuberkulin spruta.
    2. Ta inte tillbaka sprutan efter användning. kassera i en dedikerad och märkt MPTP-behållare för biofarliga vassa föremål. Håll 10% blekmedel och vävnader i närheten för att rengöra eventuella oavsiktliga droppar.
  2. Placera djur injicerade med MPTP i engångsburar, upp till 5 möss per bur och hus på öppna rack. Använd inte ventilerade rack.
    1. Placera MPTP använd plakat på hyllan som innehåller möss och husrumsdörr till 72 timmar efter sista injektionen.
      Obs: se till att temperaturen i bostadsrummet är mellan 22,2 - 24,4oC, eftersom möss upplever övergående hypotermi upp till 12h efter MPTP-berusning. 31 (31)
    2. Dekontaminera arbetsytan med blekmedel efter varje användning (se steg 2.8), kassera överbliven MPTP-lösning genom tillsats av en volymekvivalenter på 10 % blekmedel och kassera innehållet som biofarligt flytande avfall.
    3. Kassera all använd personlig skyddsutrustning i dedikerad avfallsbehållare. Spraya vid behov med 10% blekmedel före kassering.
  3. Kontrollera djuren regelbundet och uppdatera mat och vattenkälla dagligen under injektionsparadigmet och 72 timmar efter den sista injektionen. Anmärkning: Även om ingen förorening förväntas i området omedelbart kring burens utsida behandlas denna region med blekmedelslösningen som en försiktighetsåtgärd (enligt beskrivningen i steg 2.8). Försiktighet bör vidtas vid hantering av alla möss och all utrustning under denna period.
    1. Tre dagar efter den sista injektionen, kassera alla burar och liners i lämpligt märkt biohazard påse. Återuppta användningen av regelbunden personlig skyddsutrustning och normal inhysning för djur. ta bort dörr- och hyllskyltar.

4. Vävnadsskörd

  1. Avliva djur genom livmoderhalsförskjutning 7 dagar efter den senaste MPTP-injektionen. Dissekera omedelbart hjärnan på is med förkyld hjärnform med 1 mm slitsar i koronarplanet.
  2. Dissekera striatum från en förbrainskiva 2 mm tjock på nivån för det främre kommissarien.
    1. Ta bort omgivande när- och subkortikala områden med hjälp av en skalpell. Snap-frysa striatal vävnad från varje halvklot i en separat 1,5-ml microcentrifuge rör för neurokemiska eller biokemiska analys.
  3. Blockera midbrain/bakbrain i koronalplanet i nivå med främre hypotalamus och nedsänkningsfixvävnad i 4% formaldehyd vattenlösning.

5. Vävnadsbehandling

  1. Process för biokemi
    1. Homogenisera striatalvävnad från en halvklot med hjälp av en ultraljudscellsstörare i 200-μL Tris-EDTA lysis buffert (25mM Tris bas, 1mM EDTA, 1:100 proteas och fosfatashämmare cocktails) för 10 pulser vid 10-12 Hz och centrifugerade i 10 min vid 4oC vid 1000xg.
    2. Aspirera försiktigt supernatanten och rekonstruera pelleten i 150-μl lysbuffert. Fraktioner används för biokemisk analys av SDS-PAGE och Western blotting.
      Anm.: Använd proteas- och fosfatashämmarhaltig buffert inom 1 timme efter beredning på grund av instabilitet i vattenlösningar.
  2. Process för neurokemi
    1. Använd striatum dissekerad från andra halvklotet från varje prov lagrat vid -80°C för HPLC. Tina striatala vävnader i mikrofugerör på is, tillsätt 500-μl 0,3N perklorsyra (PCA) och homogenisera med hjälp av ljuddatorn.
      Obs: För att göra 100 ml 0,3N PCA, mät 90 ml ddH2O, tillsätt en 100 ml graderad cylinder, tillsätt 2,58 ml 70% PCA och sätt till 100 ml-märke. Denna provbuffert kan lagras vid 4 °C i upp till en månad.
    2. Sonicate striatal vävnad i 500-μl 0,3N PCA, för 10 pulser vid 10-12 Hz och placera på is. För att säkerställa homogenitet, sonicate prover en andra gång för 10 sek, sedan centrifug i 12 min vid 4oC vid 16,100xg.
    3. Dekanta omedelbart supernatant till 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -80°C. Lufttorka pelletsfraktionen i huven.
    4. Håll supernatanten vid -80°C tills den används för mätning av dopamin och dess metaboliter, 3,4-dihydroxyfenylacetsyra (DOPAC) och homovanillsyra (HVA) av HPLC med elektrokemisk detektion.
    5. När pelletsfraktionen är torr ska den återsamlas i 0,5N NaOH (500 μL) och kort ultraljudsbehandling. Förvara rekonstituerad pelletsfraktion vid 4°C tills den används för bestämning av totalt protein med Lowry-metoden.
  3. Process för immunohistokemi
    1. Nedsänkning-fix mid- och hind-brain block över natten i 4% formaldehyd vattenlösning och cryoprotect i graderade sackaroslösningar (10% i fosfatbuffrad saltlösning (0,01 M PBS; 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl och ddH2O, pH 7,4) i 24 timmar och sedan 30% i PBS tills vävnaden sjunker) vid 4 °C. Kort fläckiga kryoprotected block för att ta bort överskott av sackaroslösning, frysa på torr is och lagra vid -80 °C tills den används.
    2. Microtome sektionering av hjärnblock som innehåller mitten- och bakhjärnan i en kryostat.
      1. Ta bort vävnader från -80°C, jämvikt vid -16°C i 1 timme i kryostat och montera i vävnadsinbäddningsmedier.
      2. Samla koronarsektioner med 40-μm tjocklek i kryoprotektantlösning (0,01 M PBS med 30% sackaros, 30% etylenglykol, pH 7,4) vid -16°C. Samla vävnaden seriellt i 6 1,5 ml mikrocentrifugrör med 240-um intervall och förvara vid -20°C.

6. Immunoblotting

  1. Bestäm proteinkoncentrationen i striatal supernatantfraktion (beredd enligt beskrivningen i avsnitt 5. 1) med BCA-analys.
  2. Beräkna den utspädning som krävs för varje prov för att ge 10 μg per väl levererad i 20 μl volym.
  3. Späd supernatantprotein med 4X Laemmli-buffert och homogeniseringsbuffert för att ge 10 μg protein i 1X Laemmli buffertlösning. Exempelberäkning:
    1. Bestäm den slutliga koncentrationen av protein och volym som krävs. I detta fall krävs 10 μg i 20 μl (0,5 mg/ml).
    2. Bestäm den slutliga volymen av den proteinlösning som behövs. Även om 20 μl krävs för lastning bör extra volym beredas (30 μl).
    3. Eftersom den slutliga volymen och koncentrationen är känd, och koncentrationen av proteinet supernatant fraktion är känd (bestäms av BCA-analysen), beräkna volymen av proteinet supernatant som krävs med hjälp av ekvationen:
      Vsupernatant = (Vfinal x Cfinal)/C supernatant
      För en övernaturlig proteinkoncentration på 1,5 mg/ml
      Vsupernatant = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      Vsupernatant = 10 μl
    4. Beräkna den mängd 4X Laemmli-buffert som krävs för att ge en 1x-koncentration i 30 μl volym (30 μl / 4 = 7,5 μl). Obs: 4X Laemmli-buffert måste spädas till 1X styrka i provberedningen.
    5. Beräkna den mängd homogeniseringsbuffert som krävs för att få volymen till 30 μl (och erhåll önskad slutlig proteinkoncentration på 0,5 mg/ml):
    6. Förbered provet genom att virvelvind och sedan pipetting 10 μl protein supernatant i 12,5 μl homogeniseringsbuffert. Tillsätt 7,5 μl 4X Laemmli-buffert för en arbetslösning med 30 μl prov och 0,5 mg/ml koncentration.
  4. Förbered alla prover med hjälp av beskrivna procedurer, virvel och koka i 5 min.
    Obs: Använd mikrocentrifugrör med skruvtopp för att förhindra läckage och öppning på grund av tryck under kokning.
  5. Efter 5 min, placera omedelbart på is. Ladda 20 μl provarbetslösning per gelbrunn (10 μg protein). Separera proteinprover från SDS-PAGE på en 12% Tris-glycingel.
    1. Använd en förfärgad proteinstege för bekräftelse av molekylvikter. Körbuffert är 25 mM Tris-bas, 192 mM glycin, 0,1% SDS och ddH2O, pH 8,3.
    2. Separera proteiner med elektrofores: kör vid 80 V för att rensa brunnarna (10 min) och 125 V (ca 1 h; tills proteinstegen har separerat helt) för att lösa proteinerna.
  6. Utför protein-till-nitrocellulosaöverföring med 0,2 μm nitrocellulosamembran i Tris-glycinöverföringsbuffert (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,04% SDS, 20% metanol och ddH2O, pH 8,3) över natten för 40 V vid 4 °C.
  7. Tvätta nitrocellulosabläckor i 1x Tris saltlösning (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl i ddH2O, pH 7.4) i 10 min vid RT. lncubate i Ponceau S i 5 min skölj sedan i ddH2O för att ge en grov verifiering av motsvarande proteinbelastning. Skanna bild för att behålla posten för anteckningsbok och kvarhålla med PBS.
    Obs: Alternativt, tvätta fläckar i Milli-Q eller ddH2O som innehåller HCl (0,2%) i cirka 5 minuter. Sök efter post. Ta bort Ponceau S-fläcken från membranet genom efterföljande inkubationssteg (dvs. placera i blockeringsbufferten).
  8. Blockera blots i 5% fettfri mjölkpulver i TS i 1 timme vid RT och inkubera 24h vid 4ºC med kanin antityrosinhydroxilas (1:1000),anti-β-aktin (1:200); anti-GFAP (1:1000) i 5% mjölk-TS.
  9. Tvätta blots 3 x 5 min i TS med 0,05% interpolering-20 och 1 x 5 min i TS, inkubera sedan i HRP-konjugerad sekundär antikropp (1:5000 i TS som innehåller 5% mjölk), matchad med arten av primär, i 2 h vid RT.
  10. Förbered chemiluminescerande substrat med lika stora volymer luminol- och peroxidlösningar och applicera i 1-3 min. Placera fläcken i en plasthylsa i ett mörkrum för filmexponering och exponera för film; sedan utvecklas med hjälp av en automatisk processor.
  11. Strippa blots med kommersiellt tillgänglig strippningsbuffert vid 37 °C i 30 min, tvätta 3x 10 min i TS med 0,05% interpolering-20 och 1x 10 min i TS och reproducera sedan för lastkontroll eller annat protein av intresse.
  12. Kvantifiera signalerna med Image J-programvara för optiska densitetsmätningar och normalisera till den interna β– aktin.

7. Neurokemi

  1. Analysvävnad bereds enligt beskrivningen ovan i avsnitt 5.2. Se tabell 1 för mobilfasrecept.
    Obs: Alla reagenser måste ≥99,0 % rena och av HPLC-klass. Säkerställ buffertintegritet med rent, dedikerat glas och omrörstänger. Mobil fasbuffert bör användas inom sju dagar efter beredningen.
    1. Väg dihydrogenfosfat och citronsyra, tillsätt 1 L ddH2O och blanda i en 2-L graderad cylinder. Filtrera lösningen genom ett 0,22-μm GSTF-membran.
      Obs: Detta maximerar extraktionen av föroreningar i fosfat och citronsyra, vilket hjälper till att minimera bakgrundsströmmar.
    2. Tillsätt OSA följt av acetonitril- och EDTA-lösningen. Tillsätt HPLC-klass ddH2O till cirka 1900 ml innan pH-talet justeras till 3,0 med fosforsyra.
    3. Tillsätt HPLC-klass ddH2O till 2-L-märket och häll sedan i en 2-L-kolv. Tillsätt en dedikerad omrörningsstång och avgasa den mobila fasen genom att omröra den under vakuum i > 10 minuter.
  2. Förbered standarderna för dopamin, och DOPAC och HVA för standardkurvor. Lagerlösningar av standarder bereds vid 1 mg/ml i 0,3 N PCA.
    1. Väg 12,4 mg dopamin-HCl och tillsätt 10, 0 ml 0,3 N PCA för att göra 1 mg/ml dopamin.
    2. Väg 10,0 mg DOPAC och tillsätt 10,0 ml 0,3 N PCA för att göra 1 mg/ml DOPAC.
    3. Väg 10,0 mg HVA och tillsätt 10, 0 ml 0,3 N PCA för att göra 1 mg/ml HVA.
  3. Förbered arbetsstandardlösningar från lagerlösningarna. Fempunktsstandarder används för att generera en koncentrationskurva.
    1. För mätning av striatal dopamin, förbereda standardkoncentrationer på 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml och 200 ng/ml.
    2. För striatal DOPAC, bered standardkoncentrationer på 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml och 40 ng/ml.
    3. För striatal HVA, bered standardkoncentrationer på 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml och 80 ng/ml.
    4. Generera fempunktsstandarder: späd 1 mg/ml dopaminbuljonglösning till 5 μg/ml med 0,3N PCA. Späd 1 mg/ml DOPAC-stamlösning till 1 μg/ml med 0,3N PCA och späd 1 mg/ml HVA-stamlösning till 2 μg/ml med 0,3N PCA.
    5. Överför 1 ml 5 μg/ml dopamin, 1 ml 1 μg/ml DOPAC och 1 ml 2 μg/ml HVA till en 25 ml mätkolv och ge volym till 25 ml-märke med 0,3 N PCA.
      Anm.: De blandade standarderna i den volymetriska kolven innehåller den högsta koncentrationen av fempunktsstandarderna: 200 ng/ml dopamin, 40 ng/ml DOPAC och 80 ng/ml HVA.
    6. Överför 1 ml av de blandade standarderna till rena 1,5 ml mikrocentrifugrör. Utför 1:1 seriell utspädning fyra gånger för att generera efterföljande fyrapunktsstandarder.
      1. Till exempel, till 250 μl av de blandade standarderna, tillsätt 250 μl provbuffert och virvel noggrant för att producera blandade standarder vid 50% av de ursprungliga koncentrationerna; upprepa processen tills önskad utspädning uppnås.
  4. Förbered HPLC-systemet (pump, autosampler, backfaskolonn (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). Rensa pumpen med fräsch mobilfas för att ersätta alla tidigare lösningar i HPLC-systemet och instängda luftbubblor med fräsch mobilfas. Kyl autosamplern till 4°C. Värm kolonnen till 35°C, vilket minskar det totala trycket.
    1. Ställ in spänningen på -150 mV respektive 220 mV för den första respektive andra elektroderna i den elektrokemiska detektorn. Jämvikt systemet i minst 2 timmar, och helst över natten, med den mobila fasen med en flödeshastighet på 0,2 ml/min.
      Obs: Under jämvikten ska cellerna vara på och baslinjeavläsningen övervakas. Stabil avläsning indikerar att systemet är klart att användas. Under de två timmarna av jämviktsfasen, låt den mobila fasen gå in i en avfallsbehållare istället för att återcirkulera den. Efter denna period kan den mobila fasen återvinnas över natten för jämvikt.
    2. När jämvikten är klar justerar du det mobila fasflödet till 0,6 ml/min. Injicera 20 μl av var och en av fempunktsstandarderna.
  5. Tina striatala prover på is och injicera 2 x 20 μl av varje prov i HPLC-systemet. Använd standarder i början och slumpmässigt i varje uppsättning striatala prover.
  6. Använd programvaran för att analysera området under dopamin, DOPAC och HVA toppar som produceras av standarder och prover. Identifiera analyter efter retentionstid och mät genom att jämföra det område som är under topp med 5-punktskurvan för motsvarande standard.
  7. Bered pelletsfraktion enligt beskrivningen i avsnitt 5.2.3. Utför en Lowry proteintest på striatal pellet. Anmärkning: Denna analys kommer att mäta mängden protein som finns i striatala prover i mg/ml. Denna information används för att bestämma koncentrationen av analyt/ mg.

8. Immunohistokemi

  1. GFAP/TH dubbel immunofluorescens
    1. Ta bort rör som innehåller sektionerat midbrain från -20°C frys och för till RT. Ta bort vävnadssektioner som innehåller substantia nigra från kryopreservativ lösning i en bricka som innehåller PBS.
    2. Placera vävnadssektioner i polystyreninsatser med polyesternätbottnar för fritt flytande immunokemi. Tvätta 3 x 5 min i PBS.
    3. Överför sektioner till 96-brunnsplatta med 180-μl blocklösning (5% normalt åsneserum, 1% PVP, 1% BSA och 0,3% Triton X-100 i PBS) i varje brunn. Inkubera 40 min på RT.
      Obs: Alla tvätt- och inkubationssteg utförs med lätt agitation på skakapparaten.
    4. Överför sektioner till brunnar som innehåller den primära antikroppslösningen (180 μl per brunn). Inkubera i primär antikroppscocktail, kaninanti-GFAP (1:1000) och får anti-TH (1:400) utspädd i PBS med 1% BSA och 0,3% TX-100, i 24 h vid 4 °C. IgG från de primära arterna fungerar som den negativa immunostainingkontrollen.
    5. Inkubera i sekundär antikroppscocktail (1:200 åsna antikanin 568 och 1:200 FITC åsna antifår i PBS med 0,1% TX-100). Använd folie för att skydda lösningen mot ljus under beredning och inkubation; inkubera på RT i 2 timmar.
      1. För en negativ kontroll, inkubera sektioner i IgG från primärarten utspädda till samma koncentration som används för de primära antikropparna.
      2. Tvätta 2 x PBS och 1 x TS i 5 min vardera vid RT. Montera vävnadssektioner på plus diabilder i monteringsmedium med Hoechst-fläck och täckslip.
    6. Inkubera i sekundär antikroppscocktail (1:200 åsna antikanin 568 och 1:200 FITC åsna antifår i PBS med 0,1% TX-100). Använd folie för att skydda lösningen mot ljus under beredning och inkubation; inkubera på RT i 2 timmar.
    7. Tvätta 2 x PBS och 1 x TS i 5 min vardera vid RT. Montera vävnadssektioner på plus diabilder i monteringsmedium med Hoechst-fläck och täckslip.
    8. Skydda diabilder från ljus och oxidation tills de avbildningar genom att förvara i en skjutbox vid 4°C.
    9. Analysera den negativa kontrollen först för att bestämma bakgrundsnivån för fluorescens och utvärdera sedan för positiv immunoreaktivitet med fluorescerande mikroskopi.
  2. Iba1 immunohistokemi med kromagen nederbörd
    1. Ta bort rör som innehåller sektionerat midbrain från -20°C frys och för till RT. Ta bort vävnadssektioner som innehåller substantia nigra från kryopreservativ lösning i en bricka som innehåller PBS.
    2. Placera vävnadssektioner i polystyreninsatser för fritt flytande immunokemi. Tvätta sektionerna 3 x 5 min i PBS och placera sektionerna direkt i 12-brunnsplattan som innehåller förvärmd 10 mM citronsyramonohydrat, pH 9,0, 80 °C i 30 min, för epitophämtning.
    3. Kylplatta 20 min vid RT. Sätt tillbaka sektionerna på skären och tvätta 3 x 5 min i PBS.
    4. Överför sektioner till 96-brunnsplatta som innehåller 180-μl blockeringslösning (10% normalt getserum, 1% BSA i PBS) per brunn och inkubera 40 min vid RT.
    5. Överför sektioner till brunnar som innehåller 180-μl utspädd primär antikropp (1:1000 i 1% BSA-PBS). Inkubera över natten vid 4°C.
    6. Överför avsnitt till skär. Tvätta 3 x 5 min PBS och applicera biotinylerad sekundär antikropp (1:200 i 1,5% normalt serum-PBS) i 1 h vid RT.
    7. Förbered ABC-lösningen 30 min före användning. Tvätta 3 x 5 min PBS och överför till ABC-lösning i 1 timme på RT.
    8. Förbered DAB-lösningen i huven. Tvätta 2x 5 min i PBS och 1x 5 min i TS och inkubera sektioner i DAB.
      1. Utveckla i 3-4 min. Negativ kontroll bör förbli ljus i färg.
        Obs: utför detta steg i rökhuv eftersom DAB är ett känt cancerframkallande ämne. En lösning på 0,2M kaliumpermanganat i ddH2O för dekontaminering bör bibehållas i närheten vid oavsiktliga droppar.
    9. Skölj sektionerna en kort stund i ddH2O och sedan i TS 3 x 5 min. Montera sektioner på plusrutschbanor och lufttorka över natten i rökhuv.
    10. Dekontaminera DAB-avfall med en lika stor volym på 0,2 M kaliumpermanganat i ddH2O, virvel och inkubera i en rökhuv över natten innan du förvarar i lämpligt märkt DAB-soptunna i rökhuv.
      Observera: Blekmedelslösning eliminerar inte DAB:s mutagena egenskaper.
      1. Dekontaminera föremål som ska återanvändas (dvs. polystyreninsatser) och tvätta med tvättmedel.
    11. Torka/förtorka lätt med Kresylviolett (CV). Alla uttorknings-/tvättsteg är 3 min: etanol 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 sekunder), ddH20 x 2, 95% etanol + glacial ättiksyra (0,1%) x 2, 100% etanol och xylen.
    12. Täckslip i distyren-toluen-xylen monteringsmedium och torr i rökhuv.
    13. Observera positiv immunoreaktivitet med ett lätt mikroskop. IgG från de primära arterna fungerar som den negativa immunostainingkontrollen.

9. Statistik

  1. Bedöma skillnader mellan olika sätt genom envägsanalys av varians (ANOVA) för att jämföra skillnader mellan genotyp och tvåvägs ANOVA för att jämföra skillnader mellan genotyp och toxikantbehandling. Använd Tukeys HSD-post hoc-analys när skillnader observeras genom ANOVA-testning(p≤0,05).
    Obs: Experiment (med n = 6-9 möss/grupp) utförs minst två gånger för att säkerställa reproducerbarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta toxin exponering paradigm kan producera en betydande och detekterbar 20% striatal dopamin utarmning i MPTP- vs. saltlösning-injicerade djur. Det är viktigt att notera att olika partier av MPTP kan ge något mer eller mindre lesioning; För bättre precision rekommenderas därför ett preliminärt experiment på vildtypsmöss före användning i transgener när en ny mängd neurotoxin används. Användningen av mild till måttlig lesionering gör det möjligt att observera effekten av transgenen. En allvarlig lesion kan ge en "golveffekt" med en skada som är för robust för att dämpa eller så skadlig att den överskuggar effekten av en skadlig genetisk förändring. Effekterna av MPTP på striatal dopamin var signifikant olika hos 5-LOX isozym-bristfälliga möss, men inte 12/15-LOX isozym-bristfälliga möss (Figur 1). Dessutom, med dessa metoder, vi kunde urskilja en betydande skillnad i dopaminnivåer på grund av 5-LOX brist i saltlösning-behandlade möss (Figur 1).

Immunoblotting för TH och GFAP möjliggjektiv för bekräftelse av skador respektive neuroinflammation på nivån för striatum hos vilda möss, en effekt som minskade i 5-LOX isozyme-saknas striatum (figurerna 3A och 3B). Lesionen kan också urskiljas på nivån för substantia nigra (figur 2A och 2B). Hos samma möss kan utarmning av TH-positiva nervceller och ökad GFAP-immunoreaktivitet observeras med hjälp av immunofluorescerande märkning med dubbla etiketter (figur 2A). Dessutom är markant förhöjd mikroglial aktivering(dvs. Iba1-immunoreaktivitet) i vildtyp, men inte 5-LOX isozymbrist, möss uppenbara i substantia nigra efter MPTP- exponering (figur 2B). Således kan MPTP-modellen ge ett användbart verktyg för att bedöma effekten av genetisk predisposition till nigral degeneration och inflammation.

Figure 1
Figur 1. LOX isozyme-selektiva effekter på striatal dopamin efter MPTP utmaning. (A) Striatal homogenates användes för att mäta dopamin (DA) av HPLC från WT och 5-LOX-/- littermates ges saltlösning eller MPTP (n=6-8/grupp). ▼, markerar en betydande effekt på grund av genotyp, p<0,05. *, markerar en betydande effekt på grund av genotyp och behandling, p<0,05. Ingen signifikant skillnad på grund av behandling noterades i 5-LOX-/- möss (n.s.) som indikerar att MPTP inte gav striatal DA utarmning i denna transgena linje. B) Striatala homogenat användes för att mäta DA i WT och 12/15-LOX-/- kullkamrater som fått saltlösning eller MPTP (n=6-9/grupp). Ingen signifikant skillnad i DA nivåer på grund av att genotyp observerades. En betydande, och liknande, minskning på grund av MPTP behandling noterades i båda genotyperna. *, p<0.01. Data visas som medelvärde ± SEM.

Figure 2
Figur 2. 5-LOX isozym effekter på nigral TH och astroglia efter MPTP utmaning. (A) Immunofluorescens färgning för TH (FITC; grön) och GFAP (568; röd) immunoreactivities utfördes i nigral hjärnan avsnitt från WT och 5-LOX-/- littermates ges saltlösning eller MPTP. Färre TH-positiva cellkroppar (*) och förbättrad GFAP immunoreactivity är uppenbara i WT-MPTP gruppen. Bar = 25 μm. (B) Immunohistokemisk histologi för Iba-1 på mikroglia upptäcktes med DAB (brunt kromatgen); sektioner motverkades av Cresyl violett. Nigral sektioner från WT och 5-LOX-/- littermates behandlas med saltlösning eller MPTP bedömdes. Mikroglia med förgremade cellkroppar och långa förgreningsprocesser observeras i substantia nigra från saltlösningsbehandlade möss (pilhuvuden). Aktiverad mikroglia med rundade cellkroppar och korta, förtjockade processer observerades i substantia nigra från MPTP-behandlade möss (pilar). Bar = 10 μm.

Figure 3
Figur 3. 5-LOX isozym effekter på striatal TH och inflammatorisk efter giftig förolämpning. A) Striatal TH proteinnivåer mättes semikvantitativt av västerländska fläckar av homogenat från WT och 5-LOX-/- littermates ges saltlösning eller MPTP (n=6-8/grupp). Immunoreactivity, mätt med optisk densitet, normaliserades till β-aktin. *, p<0.05. B) På samma sätt mättes GFAP semikvantitativt genom västerländska fläckar av striatal homogenat från WT och 5-LOX-/- littermates som gavs med saltlösning eller MPTP (n=6-8/grupp) och normaliserades till β-aktin. *, p<0.05. Uppgifterna anges som ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utformningen av denna gen-miljö interaktion studie gjorde det möjligt för oss att få ny information om den dubbla karaktären av 5-LOX isozym i nigrostriatal utbildningsavsnittet. Genom att utföra HPLC för att mäta striatala monoaminer efter saltlösning eller MPTP behandling i transgenics saknar 5-LOX isozym och deras wildtype littermates, vi kunde notera att dess brist verkar vara skyddande under giftiga förhållanden (Figur 1), men under normala förhållanden minskar bristen på enzymet striatal dopaminnivåer och kan vara skadliga. Således kan vi visa att 5-LOX isozymen bidrar till striatal dopaminerg ton under normala förhållanden, men kan bidra till skador efter toxiska utmaning4.

Medan ytterligare utvärdering bör ge nya mekanistiska insikter om rollen av LOX isozymer i nigrostriatal toxicitet, western blot analyser (figur 3) samt immunohistochemical studier (Figur 2) visade att neuroinflammation markörer var, åtminstone delvis, försvagas i 5-LOX isozyme-bristfällig kohort utsätts för MPTP. Dessa resultat, med hjälp av klassiska biokemiska och histologiska tekniker, indikerar en kritisk roll av 5-LOX produkter i potentiering av mikro- och astro-glia aktivering4.

Beroende på gen-miljö interaktion undersökt, patologiska avläsningar utöver glia aktivering kan analyseras. Av särskild betydelse i PD är förlust av dopaminerga nervceller i substantia nigra och potentiellt patologisk ackumulering och aggregering av α-synuklein. Längs denna linje har effekten av toxisk exponering hos transgena möss med α-synukleinöveruttryck övervakats genom utvärdering av nigralcelldöd (dvs. med hjälp av opartisk stereologisk cellräkning) och olöslig α-synukleindeposition32-35.

MPTP dosen som används i paradigmet beskrivs här producerar en mild lesion med blygsam, men betydande, striatal skada (Figur 1) och stödjegenaktivering i både striatum och substantia nigra (figur 2 och 3). Vanligtvis används högre doser av toxiska medel för att producera robust nigral dopaminerg cellförlust och striatal dopamin utarmning23,24,32,36-38,39. Det är viktigt att notera att toxiciteten hos MPTP kan variera mellan leverantörer och partier; Följaktligen kan doser behöva justeras för att ge önskad lesion. Dessutom är andra faktorer som måste beaktas stammen och könet hos djur som används för studierna. Selektiv känslighet för neurotoxinet har visats i olika bakgrundsstammar hos möss, ett fenomen som åtminstone delvis beror på skillnader i aktivering av subcellulära vägar som förmedlar degeneration, inklusive JNK och c-Jun36-39. Könsberoende skillnader i MPTP-toxicitet har ocksårapporterats 40,41, och kan bidra till variation i studier med transgena möss där båda könen används för uppfödningslinjer med dålig uppfödning. I ett sådant fall är användningen av könsmatchade wildtype-kontroller kritisk4. Sådana könsrelaterade effekter kan förklara skillnaden i lesioner som observerats hos WT-mössen mellan experiment som testar effekten av 5- och 12/15-LOX-bristfälliga möss där ett kön användes för en linje och båda könen för den andra (figur 1). För interaktionsstudier i genmiljön rekommenderas inte en MPTP-utmaning som orsakar allvarlig skada (t.ex. >80% minskning av striatal dopamin) eftersom detta kan maskera en möjlig genetisk effekt.

Medan MPTP exponering producerar nigral cell död3,42, striatal dopaminutarmning 3,komplexa I hämning43-45, och stödjecelleraktivering 46,47 som har rapporterats i mänskliga PD, i musen uppstår inte en långsamt progressiv degeneration som ger stabil parkinsonism (dvs. motoriska underskott) och frank α-synukleinpatologi ( dvsLewykroppar och neuriter) helt rekapitituerande kännetecken för sjukdomen i modellen. Det är dock viktigt att notera att MPTP-musen har spelat en avgörande roll för att förstå subcellulära vägar som bidrar till PD-relaterad neurodegeneration. Variation i exponeringsparadigm har till exempel avslöjat aktivering av distinkta mekanismer för toxicitet: låg dos, subakuterad exponering främjar apoptotiskcelldöd 48 med ett begränsat immunsvar49 medan akut behandling med högre doser ger markant mikroglialaktivering 50. Sådana faktorer bör beaktas vid användning av modellen för effektstudier och, med relevant för den aktuella studien, för att avslöja effekterna av en potentiell genetisk riskfaktor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det finns inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av National Institutes of Health NIGMS 056062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01 counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt 7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

Tags

Medicin Utgåva 83 MPTP dopamin Iba1 TH GFAP lipoxygenas transgen genmiljöinteraktioner mus Parkinsons sjukdom neurodegeneration neuroinflammation
Modeller för genmiljöinteraktion för att avslöja känslighetsmekanismer vid Parkinsons sjukdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R.,… More

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter