Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Modèles d’interaction gène-environnement pour démasquer les mécanismes de susceptibilité dans la maladie de Parkinson

Published: January 7, 2014 doi: 10.3791/50960
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

Summary

Les isozymes lipoxygénase (LOX) peuvent générer des produits qui peuvent augmenter ou diminuer la neuroinflammation et la neurodégénérescence. Une étude d’interaction gène-environnement pourrait identifier les effets spécifiques de l’isozyme LOX. L’utilisation du modèle 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) des dommages nigrostriatal dans deux lignées transgéniques déficientes en isozyme LOX permet de comparer la contribution des isozymes LOX sur l’intégrité dopaminergique et l’inflammation.

Abstract

L’activité de la lipoxygénase (LOX) a été impliquée dans des désordres neurodegenerative tels que la maladie d’Alzheimer, mais ses effets dans la pathogénie de la maladie de Parkinson (palladium) sont moins compris. Les modèles d’interaction gène-environnement ont l’utilité de démasquer l’impact de voies cellulaires spécifiques dans la toxicité qui peuvent ne pas être observées en utilisant uniquement un modèle de maladie génétique ou toxique. Pour évaluer si les isozymes distincts de LOX contribuent sélectivement au neurodegeneration PD-connexe, des souris transgéniques(c.-à-d. 5-LOX et 12/15-LOX déficientes) peuvent être contestées avec une toxine qui imite des dommages de cellules et la mort dans le désordre. Ici nous décrivons l’utilisation d’une neurotoxine, 1 methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), qui produit une lésion nigrostriatal pour élucider les contributions distinctes des isozymes de LOX au neurodegeneration lié au palladium. L’utilisation de MPTP chez la souris, et le primate non humain, est bien établie pour récapituler les dommages nigrostriatal dans le palladium. L’ampleur de la lésion causée par MPTP est mesurée par l’analyse hplc de la dopamine et de ses métabolites et l’analyse occidentale semi-quantitative de tache du striatum pour l’hydroxylase de tyrosine (TH), l’enzyme taux-limitante pour la synthèse de la dopamine. Pour évaluer les marqueurs inflammatoires, qui peuvent démontrer la sensibilité isozyme-sélective de LOX, la protéine acide fibrillaire glial (GFAP) et immunohistochemistry Iba-1 sont exécutées sur des sections de cerveau contenant le nigra de substantia, et l’analyse occidentale de tache de GFAP est exécutée sur des homogénats striatal. Cette approche expérimentale peut fournir de nouvelles informations sur les interactions gènes-environnement sous-jacentes à la dégénérescence nigrostriatale et à la MP.

Introduction

L’utilisation de modèles d’interaction gène-environnement fournit une approche pour imiter les facteurs de risque qui influencent probablement la maladie de Parkinson idiopathique (MP) et offre l’occasion de discerner des idées mécanistes qui sont peu susceptibles d’être élucidées par l’utilisation d’un système génétique ou toxique seul1,2. Ici nous illustrant ce point et décrivons l’application du modèle murin 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) de la dégénérescence nigrostriatale3 pour mieux comprendre la sélectivité de l’activité isozyme de la lipoxygénase (LOX) sur la neuroinflammation et la toxicité4. Tandis qu’un rôle pour des isozymes de LOX a été largement évalué dans les désordres périphériques5,6 aussi bien que la maladie de CNS comprenant la course7 et la maladie d’Alzheimer8,9, le rôle de la famille des isozymes dans la fonction nigrostriatal et la dégénérescence liée au palladium n’est pas bien compris et justifie l’étude. La neurotoxine MPTP démontre la dégénérescence préférentielle de la voie nigrostriatal et récapitule l’épuisement striatal de dopamine et la perte dopaminergiquenigrale de cellules qui sont à la base des affaiblissements moteurs dans des patients depalladium 10. Bien que ce modèle ne reproduise pas le cadre complet des comportements de non moteurs et moteurs et de la pathologie du corps de Lewy α-synucléine-positive, il a été utile d’élucider de nouvelles cibles mécanistes qui contribuent aux dommages nigrostriatal et pour les tests translationnels à un stade précoce, car c’est le modèle non invasif le mieux caractérisé disponible pour produire de manière fiable la mort cellulaire nigrale accompagnée d’une perte de dopamine striatale11-15. L’utilisation large de la souris MPTP, avec des paradigmes allant de aiguë, subaiguë à chronique16-18, a permis la normalisation du dosage pour entraîner des dommages nigrostriatal légers à graves19,20 avec activation de différents mécanismes de toxicité en fonction du schéma thérapeutique18,21,22. Par conséquent, cela permet de cibler une « fenêtre de lésion » qui peut entraîner une lésion nigrostriatale accrue ou réduite en fonction de l’agent thérapeutique ou du modèle transgénique utilisé23-25.

Les techniques utilisées pour évaluer les dommages et les preuves que ces méthodes fournissent sont également essentielles pour les études de biologie translationnelle et de découverte. Pour le modèle murin MPTP, les mesures établies pour évaluer la lésion sont la mesure des marqueurs du tonus dopaminergique striatal, y compris la dopamine et ses métabolites par HPLC, et l’analyse western blot de la tyrosine hydroxylase (TH), l’enzyme limitant le taux dans la synthèse de la dopamine, et les indicateurs d’événements dégénératifs tels que l’activation gliale à l’aide de l’analyse western blot et de l’immunohistochimie4. Bien que ce soient des procédures neurochimiques, biochimiques, et histologiques classiques, les techniques fournissent des lectures critiques et reproductibles sur l’ampleur des dommages dans la voie dopaminergique nigrostriatal, indiquent des mécanismes de toxicité, et se sont avérées être des outils précieux en comprenant des événements dégénératifs dans le palladium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Remarque : Toutes les procédures et méthodes de soins aux animaux doivent être approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement. L’étude décrite ici a été réalisée conformément aux lignes directrices établies par l’IACUC de SRI International.

1. Acquisition et entretien de souris déficientes en LOX

  1. Achetez des souris déficientes en 5-LOX ou en 12/15-LOX et des témoins respectifs de la souche et du sexe à l’âge de 7 à 8 semaines et prévoyez plusieurs jours pour l’acclimatation à l’installation après l’arrivée.
  2. Maintenir les souris dans un logement de groupe sur un cycle clair-foncé de 12 h et donner de la nourriture et de l’eau potable ad libitum.

2. Précautions, entreposage, préparation, décontamination et élimination du PMTP

Remarque: L’intoxication de MPTP de l’exposition intraveineuse chez l’homme a été montrée pour causer le parkinsonisme10; Mptp est très lipophile et peut facilement traverser la barrière hémato - encéphalique26. Des mesures de précaution devraient être prises pour assurer la manipulation, la désintoxication et l’élimination en toute sécurité. Son métabolisme implique de multiples étapes dont la conversion en 1-méthyl-4-phényl-2,3-dihydropyridinium par l’enzyme monoamine oxydase B(MAO-B)27. Les inhibiteurs de la MAO-B peuvent être utilisés en cas d’intoxication humaine accidentelle.

  1. S’assurer que le personnel a une formation appropriée en matière de sécurité et de manipulation avant d’utiliser le PMPP, tel que dicté par le comité de santé et de sécurité de l’établissement. Chaque institution peut établir et mettre en œuvre ses propres procédures opérationnelles normalisées pour l’utilisation du PMPP, en se fondant sur les recommandations détaillées énoncées dans la documentation17,22.
  2. Avant la préparation, enfilez l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris les éléments suivants : sarrau de laboratoire jetable ou combinaison complète, gants en double nitrile, masque chirurgical, couvre-cheveux, lunettes de sécurité et couvre-chaussures jetables. Un EPI approprié doit être porté pendant la préparation du MPTP, le paradigme d’injection et 72 h après l’injection lors de la manipulation des animaux et /ou de la litière.
  3. Effectuer des calculs avant la préparation. Les lignes directrices institutionnelles pour les volumes de dosage devraient être suivies; l’administration de 100-150 μl est généralement utilisée pour les souris de 25 à 30 g.
    1. Pour préparer une solution de MPTP à 3 mg/ml dans une solution saline, appliquez un facteur de correction (1.211 MPTP-HCl: base libre de 1.0 MPTP); la concentration de MPTP-HCl dans le véhicule salin est de 3,633 mg/ml.
    2. Préparer tout l’équipement, les fournitures et les réactifs nécessaires à la préparation du MPTP et à la décontamination potentielle des déversements avant de manipuler la neurotoxine.
  4. Retirez le flacon source MPTP-HCl de l’emplacement de stockage approprié.
    Remarque : Le MPTP doit être maintenu à RT dans un flacon fermé dans un contenant secondaire et entreposé dans une armoire verrouillée, étiquetée « MPTP ».
    1. Couvrir la zone entourant les écailles avec des tampons ou des serviettes en papier humidiées avec une solution d’eau de Javel à 10% pour réduire le risque de déversement de poudre. Gardez les mouchoirs et la solution d’eau de Javel à 10% à proximité par mesure de précaution.
    2. À l’aide d’une balance analytique située dans une hotte, peser 50 mg de MPTP-HCl dans un flacon en verre avec confinement secondaire contenant 10 % de tissu imbibé d’eau de Javel. Étiquetez le flacon en verre « MPTP » avec la concentration et la date.
    3. Fermez le flacon source et essuyez l’extérieur avec 10% d’eau de Javel.
  5. Ajouter lentement une solution saline stérile de 13,763 ml au flacon et fermer complètement pour le mélange. (La solution est de 3,633 mg / ml MPTP-HCl.)
    1. Dans la hotte, stériliser soigneusement la solution de MPTP par filtration à l’aide d’un filtre de 0,22 μm dans un flacon d’injection marqué dans un récipient secondaire contenant 10% de tissu imbibé d’eau de Javel. Nettoyez tout déversement avec du tissu imbibé d’eau de Javel.
    2. Jetez soigneusement les objets pointus et tranchants et les flacons dans un contenant de biorisque étiqueté de façon appropriée. Maintenir la solution de MPTP dans un flacon dans le récipient secondaire avec du tissu imbibé d’eau de Javel pour le transport vers la salle d’intervention animale.
      Remarque: ne pas autoclaver la solution de MPTP pour la stérilisation car sa vaporisation est un danger d’inhalation.
  6. Retournez le flacon source MPTP à son conteneur secondaire et placez-le dans un emplacement de stockage. Décontaminez la spatule, l’échelle analytique et la surface de la hotte pendant 10 min en utilisant 10% d’eau de Javel.

3. Administration du PMPP

  1. Préparez des cages jetables avec des couvercles perforés microisolateurs standard contenant des doublures filtrées en polyester marquées « MPTP » (moins le gril alimentaire à fil), des revêtements de cage jetables, des granulés alimentaires pré-humides et de l’hydrogel comme source d’eau. Peser tous les animaux et enregistrer le volume de 3 mg/ml de MPTP dans une solution saline nécessaire pour une injection de 15 mg/kg.
    Note: Les métabolites du MPTP sont détectables dans les excréments pendant 3 jours suivantl’injection28,29; cependant, les souris excrètent le n-oxyde de MPTP, un dérivé non toxique qui ne traverse pas les membranes en raison de sonhydrophilie 30.
    1. Porter tous les EPI énumérés ci-dessus et tenir les souris sur un tampon d’absorption jetable, injecter un véhicule salin ou une solution de MPTP pour une dose de 15 mg/kg dans la cavité intrapéritonéale (p.i.), tous les jours pendant 4 jours avec une seringue à tuberculine jetable de calibre 26.
    2. Ne récapitulez pas la seringue après utilisation; jeter dans un contenant d’objets pointus et tranchants biodanges de MPTP dédié et étiqueté. Maintenez 10 % d’eau de Javel et de tissus à proximité pour nettoyer tout goutte-à-goutte accidentel.
  2. Placez les animaux injectés avec mptp dans des cages jetables, jusqu’à 5 souris par cage, et maison sur des racks ouverts. N’utilisez pas de supports ventilés.
    1. Placez mptp utiliser des plaques sur rack contenant des souris et la porte de la salle de logement jusqu’à 72 h après la dernière injection.
      Remarque: assurez-vous que la température de la pièce de logement est comprise entre 22,2 et 24,4°C, car les souris souffrent d’hypothermie transitoire jusqu’à 12h après l’intoxication au MPTP. 31 ans
    2. Décontaminer la surface de travail avec de l’eau de Javel après chaque utilisation (voir l’étape 2.8), éliminer les restes de solution de MPTP en additionnant un volume équivalent à 10 % d’eau de Javel et jeter le contenu sous forme de déchets liquides présentant un biodurbaine.
    3. Jeter tous les EPI usagés dans un bac d’élimination dédié. Si nécessaire, vaporiser avec 10% d’eau de Javel avant de l’éliminer.
  3. Vérifiez régulièrement les animaux et rafraîchissez la source de nourriture et d’eau tous les jours pendant le paradigme d’injection et 72 h après la dernière injection. Remarque : bien qu’aucune contamination ne soit prévue dans la zone entourant immédiatement l’extérieur de la cage, cette région est traitée avec la solution d’eau de Javel par mesure de précaution (tel que décrit à l’étape 2.8). Des précautions doivent être prises lors de la manipulation de toutes les souris et de tout l’équipement pendant cette période.
    1. Trois jours après la dernière injection, jeter toutes les cages et doublures dans un sac de biorisque étiqueté de manière appropriée. Reprendre l’utilisation d’EPI régulier et d’un logement normal pour les animaux; enlever les plaques-étiquettes des portes et des étagères.

4. Récolte de tissus

  1. Euthanasier des animaux par luxation cervicale 7 jours suivant la dernière injection de MPTP. Disséquer immédiatement le cerveau sur la glace à l’aide d’une moisissure cérébrale pré-refroidie avec des fentes de 1 mm dans le plan coronal.
  2. Disséquer le striatum d’une tranche de cerveau antérieur de 2 mm d’épaisseur au niveau de la commissure antérieure.
    1. Enlevez les régions corticales et sous-corticales environnantes à l’aide d’un scalpel. Snap-gel tissu striatal de chaque hémisphère dans un tube de microcentrifuge séparé de 1,5 ml pour l’analyse neurochimique ou biochimique.
  3. Bloquer le mécèbre/cerveau postérieur dans le plan coronal au niveau de l’hypothalamus antérieur et du tissu d’immersion-fixer dans la solution aqueuse de formaldéhyde à 4%.

5. Traitement des tissus

  1. Procédé de biochimie
    1. Homogénéiser le tissu striatal d’un hémisphère à l’aide d’un perturbateur cellulaire ultrasonique dans un tampon de lyse Tris-EDTA de 200 μL (base tris 25mM, EDTA 1mM, cocktails inhibiteurs de protéase et de phosphatase 1:100) pour 10 impulsions à 10-12 Hz et centrifugé pendant 10 min à 4°C à 1000xg.
    2. Aspirez soigneusement le surnageant et reconstituez le culot dans un tampon de lyse de 150 μl. Les fractions sont utilisées pour l’analyse biochimique par SDS-PAGE et western blotting.
      Remarque: utilisez la protéase et le tampon contenant des inhibiteurs de phosphatase dans les 1 h suivant la préparation en raison de l’instabilité dans les solutions aqueuses.
  2. Procédé de neurochimie
    1. Utiliser le striatum disséqué d’un autre hémisphère à partir de chaque échantillon stocké à -80 °C pour la CLHP. Décongeler les tissus striatal dans des tubes de microfuges sur de la glace, ajouter de l’acide perchlorique (APC) de 500 μl et homogénéiser à l’aide d’un sonicateur.
      Remarque: Pour faire 100 ml d’APC 0,3N, mesurer 90 ml ddH2O, ajouter à un cylindre gradué de 100 ml, ajouter 2,58 ml de PCA à 70% et porter à 100 ml la marque. Cet échantillon de tampon peut être conservé à 4 °C jusqu’à un mois.
    2. Soniquez le tissu striatal dans 500 μl glacé 0.3N PCA, pour 10 impulsions à 10-12 Hz et placez sur la glace. Pour assurer l’homogénéité, soniquer des échantillons une deuxième fois pendant 10 sec, puis centrifuger pendant 12 min à 4°Cà 16 100xg.
    3. Décantant immédiatement le surnageant à 1,5 ml de tubes microcentrifuges et conserver à -80 °C. Sécher à l’air la fraction de pastille dans le capot.
    4. Maintenir le surnageant à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé pour la mesure de la dopamine et de ses métabolites, de l’acide 3,4-dihydroxyphénylacétique (DOPAC) et de l’acide homovanillique (HVA) par CLHP avec détection électrochimique.
    5. Une fois sec, reconstituer la fraction de pastille en NaOH 0,5N (500 μL) et soniquer brièvement. Conserver la fraction de granulé reconstituée à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée pour la détermination de la protéine totale à l’aide de la méthode Lowry.
  3. Procédé d’immunohistochimie
    1. L’immersion-fix mid- et hind-brain bloque pendant la nuit dans une solution aqueuse de formaldéhyde à 4% et cryoprotecte dans des solutions de saccharose graduées (10% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS 0,01 M; NaCl 0,138 M, KCl 0,0027 M et ddH2O, pH 7,4) pendant 24 h, puis 30% dans pbs jusqu’à ce que le tissu s’enfonce) à 4 °C. Éponger brièvement les blocs cryoprotégés pour éliminer l’excès de solution de saccharose, congeler sur de la glace carbonique et conserver à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
    2. Sectionnement de microtome des blocs de cerveau contenant le milieu et l’arrière-cerveau dans un cryostat.
      1. Retirer les tissus de -80 °C, les équilibrer à -16 °C pendant 1 h dans le cryostat et les monter dans les milieux d’incorporation des tissus.
      2. Recueillir des sections coronales d’une épaisseur de 40 μm dans une solution cryoprotectrice (PBS 0,01 M avec 30 % de saccharose, éthylène glycol à 30 %, pH 7,4) à -16 °C. Recueillir les tissus en série dans 6 tubes de microcentrifugation de 1,5 ml à des intervalles de 240 um et les stocker à -20 °C.

6. Immunoblotting

  1. Déterminer la concentration de protéines dans la fraction surnageante striatale (préparée comme décrit à la section 5.1) par analyse de bca.
  2. Calculer la dilution requise pour que chaque échantillon donne 10 μg par puits livré dans 20 μl de volume.
  3. Diluer la protéine surnageante avec 4X tampon Laemmli et tampon d’homogénéisation pour donner 10 μg de protéines dans 1X solution tampon Laemmli. Exemple de calcul :
    1. Déterminer la concentration finale de protéines et le volume requis. Dans ce cas, 10 μg dans 20 μl (0,5 mg/ml) est requis.
    2. Déterminer le volume final de la solution protéique nécessaire. Bien que 20 μl soit nécessaire pour le chargement, un volume supplémentaire doit être préparé (30 μl).
    3. Étant donné que le volume final et la concentration sont connus et que la concentration de la fraction surnageante protéique est connue (déterminée par le test BCA), calculer le volume du surnageant protéique requis à l’aide de l’équation suivante :
      Vsurnageant = (Vfinal x Cfinal)/C surnageant
      Ainsi, pour une concentration en protéines surnageantes de 1,5 mg/ml,
      Vsurnageant = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      Vsurnageant = 10 μl
    4. Calculer la quantité de tampon Laemmli 4X requise pour obtenir une concentration de 1x dans 30 μl de volume (30 μl / 4 = 7,5 μl). Remarque: Le tampon Laemmli 4X doit être dilué à une concentration de 1X dans la préparation de l’échantillon.
    5. Calculer la quantité de tampon d’homogénéisation nécessaire pour amener le volume à 30 μl (et obtenir la concentration finale souhaitée de protéines de 0,5 mg/ml) :
    6. Préparer l’échantillon en tourbillonnant puis piper 10 μl de surnageant protéique dans 12,5 μl de tampon d’homogénéisation. Ajouter 7,5 μl de tampon Laemmli 4X pour une solution de travail d’échantillon de 30 μl et une concentration de 0,5 mg/ml.
  4. Préparer tous les échantillons en utilisant la procédure décrite, le vortex et l’ébullition pendant 5 min.
    Remarque: Utilisez des tubes à microcentrifugation à vis pour éviter les fuites et l’ouverture dues à la pression pendant l’ébullition.
  5. Après 5 min, placez immédiatement sur la glace. Charger 20 μl de solution de travail de l’échantillon par puits de gel (10 μg de protéines). Échantillons de protéines séparés par SDS-PAGE sur un gel de Tris-glycine à 12%.
    1. Utilisez une échelle protéique pré-colorée pour confirmer les poids moléculaires. Le tampon d’exécution est de 25 mM Tris-base, 192 mM de glycine, 0,1% SDS, et ddH2O, pH 8,3.
    2. Séparer les protéines par électrophorèse: courir à 80 V pour dégager les puits (10 min) et 125 V (environ 1 h; jusqu’à ce que l’échelle des protéines soit complètement séparée) pour résoudre les protéines.
  6. Effectuer le transfert de protéines en nitrocellulose à l’aide d’une membrane de nitrocellulose de 0,2 μm dans un tampon de transfert de trisglycine (tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS à 0,04 %, méthanol à 20 % et ddH2O, pH 8,3) pendant la nuit pendant 40 V à 4 °C.
  7. Laver les taches de nitrocellulose dans 1x Tris salin (TS; 25mM Tris, 0,9% NaCl en ddH2O,pH 7,4) pendant 10 min à RT. lncubate dans Ponceau S pendant 5 min puis rincer en ddH2O pour fournir une vérification approximative de la charge protéique équivalente. Numérisez l’image pour conserver l’enregistrement du bloc-notes et destain à l’aide de PBS.
    Remarque : Par ailleurs, la tache de lavage en Milli-Q ou en ddH2O contenant du HCl (0,2 %) pendant environ 5 min. Rechercher l’enregistrement. Enlever la tache Ponceau S de la membrane par l’étape d’incubation suivante (c.-à-d. placer dans le tampon de blocage).
  8. Bloquer les taches dans 5% de lait en poudre non gras dans TS pendant 1 h à RT et incuber 24h à 4ºC avec de l’anti-tyrosine hydroxylase de lapin (1:1000), del’anti-β-actine (1:200); anti-GFAP (1:1000) dans 5% lait-TS.
  9. Laver les taches 3 x 5 min dans le ST avec 0,05 % de Tween-20 et 1 x 5 min dans le ST, puis incuber dans un anticorps secondaire conjugué au HRP (1:5000 dans le ST contenant 5 % de lait), apparié à l’espèce du primaire, pendant 2 h à TA.
  10. Préparer le substrat chimioluminescent en utilisant des volumes égaux de solutions de luminol et de peroxyde et appliquer pendant 1-3 min. Dans une chambre noire, placez une tache dans un manchon en plastique pour l’exposition au film et exposez-le au film; le film est ensuite développé à l’aide d’un processeur automatique.
  11. Décapage à bandes avec tampon de décapage disponible dans le commerce à 37 °C pendant 30 min, laver 3 x 10 min dans le ST avec 0,05 % de Tween-20 et 1 x 10 min dans le SNT, puis reprobe pour le contrôle du chargement ou d’autres protéines d’intérêt.
  12. Quantifier les signaux par le logiciel Image J pour les mesures de densité optique et normaliser au contrôle de charge interne β-actine.

7. Neurochimie

  1. Les tissus à analyser sont préparés de la manière décrite ci-dessus à la section 5.2. Veuillez vous référer au tableau 1 pour la recette de la phase mobile.
    Remarque : Tous les réactifs doivent être purs ≥99,0 % et de qualité CLHP. Assurez l’intégrité du tampon avec de la verrerie propre et dédiée et des barres d’agitation. Le tampon de phase mobile doit être utilisé dans les sept jours suivant la préparation.
    1. Peser le phosphate dihydrogène et l’acide citrique, ajouter 1 L deddH2Oet mélanger dans un cylindre gradué de 2 L. Filtrer la solution à travers une membrane GSTF de 0,22 μm.
      Remarque: Cela maximise l’extraction des contaminants dans le phosphate et l’acide citrique, ce qui aide à minimiser les courants de fond.
    2. Ajouter l’AOS suivi de l’acétonitrile et de la solution d’EDTA. Ajouter la clhp ddH2O à environ 1900 ml avant d’ajuster le pH à 3,0 avec de l’acide phosphorique.
    3. Ajouter la clhp ddH2O à la marque de 2 L, puis verser dans une fiole de 2 L. Ajouter une barre d’agitation dédiée et dégazer la phase mobile en l’agitant sous vide pendant > 10 min.
  2. Préparer les normes pour la dopamine, et DOPAC et HVA pour les courbes standard. Les solutions d’origine des étalons sont préparées à 1 mg/ml dans 0,3 N PCA.
    1. Peser 12,4 mg de dopamine-HCl, et ajouter 10,0 ml de 0,3 N PCA pour faire 1 mg/ml de dopamine.
    2. Peser 10,0 mg de DOPAC et ajouter 10,0 ml de 0,3 N PCA pour obtenir 1 mg/ml de DOPAC.
    3. Peser 10,0 mg d’HVA et ajouter 10,0 ml d’APC de 0,3 N pour obtenir 1 mg/ml d’AVP.
  3. Préparez des solutions standard de travail à partir des solutions de stock. Les étalons à cinq points sont utilisés pour générer une courbe de concentration.
    1. Pour la mesure de la dopamine striatale, préparer des concentrations standard de 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml et 200 ng/ml.
    2. Pour le DOPAC striatal, préparer des concentrations standard de 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml et 40 ng/ml.
    3. Pour l’HVA striatal, préparer des concentrations étalons de 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml et 80 ng/ml.
    4. Générer des étalons à cinq points : diluer 1 mg/ml de solution mère de dopamine à 5 μg/ml à l’aide de 0,3N PCA. Diluer la solution mère dopac à 1 mg/ml à 1 μg/ml à l’aide de l’APC à 0,3N, et diluer la solution mère d’HVA à 1 mg/ml à 2 μg/ml à l’aide de l’APC à 0,3N.
    5. Transpercer 1 ml de dopamine à 5 μg/ml, 1 ml de DOPAC à 1 μg/ml et 1 ml d’HVA à 2 μg/ml dans une fiole jaugée de 25 ml et porter le volume à 25 ml avec 0,3 N PCA.
      Note: Les étalons mixtes dans la fiole jaugée contiennent la concentration la plus élevée des étalons à cinq points: 200 ng/ml de dopamine, 40 ng/ml de DOPAC et 80 ng/ml de HVA.
    6. Transférer 1 ml des étalons mélangés dans des tubes microcentrifugés propres de 1,5 ml. Effectuez une dilution en série 1:1 quatre fois pour générer les étalons à quatre points suivants.
      1. Par exemple, à 250 μl des étalons mixtes, ajouter 250 μl de tampon d’échantillon et de vortex à fond pour produire des étalons mélangés à 50 % des concentrations initiales; répéter le processus jusqu’à ce que les dilutions souhaitées soient atteintes.
  4. Préparer le système HPLC (pompe, échantillonneur automatique, colonne en phase inverse (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). Purgez la pompe avec de la phase mobile fraîche pour remplacer toute la solution précédente dans le système HPLC et les bulles d’air piégées avec une phase mobile fraîche. Refroidir l’échantillonneur automatique à 4 °C. Réchauffer la colonne à 35 °C, ce qui réduit la pression totale.
    1. Réglez la tension à -150 mV et 220 mV pour les première et deuxième électrodes du détecteur électrochimique, respectivement. Équilibrer le système pendant au moins 2 h, et idéalement pendant une nuit, avec la phase mobile à un débit de 0,2 ml/min.
      Remarque: Pendant l’équilibre les cellules devraient être sur, et la lecture de ligne de base surveillée. Une lecture stable indique que le système est prêt à l’emploi. Pendant les deux heures de la phase d’équilibre, laissez la phase mobile entrer dans un conteneur à déchets au lieu de le recirculer. Passé cette période, la phase mobile peut être recyclée du jour au lendemain pour l’équilibration.
    2. Une fois l’équilibrage terminé, régler le débit de phase mobile à 0,6 ml/min. Injecter 20 μl de chacune des normes en cinq points.
  5. Décongeler les échantillons striatal sur la glace et injecter 2 x 20 μl de chaque échantillon dans le système HPLC. Utilisez des étalons au début et au hasard dans chaque ensemble d’échantillons striatal.
  6. Utilisez le logiciel pour analyser la zone sous les pics de dopamine, DOPAC et HVA produits par les normes et les échantillons. Identifier les analytes par temps de rétention et mesurer en comparant la surface sous crête à celle de la courbe à 5 points pour son étalon correspondant.
  7. Préparer la fraction de granulés comme décrit à la section 5.2.3. Effectuer un test de protéines lowry sur la pastille striatale. Remarque : Ce test mesurera la quantité de protéines présentes dans les échantillons striatal en mg/ml; cette information est utilisée pour déterminer la concentration de ng/mg d’analyte.

8. Immunohistochimie

  1. Double immunofluorescence GFAP/TH
    1. Retirer les tubes contenant le mécène sectionné du congélateur à -20 °C et les amener à RT. Retirer les sections de tissu contenant du substantia nigra de la solution cryoconservatrice dans un plateau contenant du PBS.
    2. Placez des sections de tissu dans des inserts en polystyrène avec des fonds en maille de polyester pour l’immunochimie flottante. Laver 3 x 5 min en PBS.
    3. Transférer des sections sur une plaque de 96 puits avec une solution de bloc de 180 μl (5 % de sérum d’âne normal, 1 % de PVP, 1 % de BSA et 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS) dans chaque puits. Incuber 40 min à TA.
      Remarque: Toutes les étapes de lavage et d’incubation sont effectuées avec une légère agitation sur le shaker.
    4. Transférer des sections vers des puits contenant la solution d’anticorps primaires (180 μl par puits). Incuber dans un cocktail d’anticorps primaires, anti-GFAP pour lapin (1:1000) et anti-TH pour moutons (1:400) dilués dans du PBS avec 1 % de BSA et 0,3 % de TX-100, pendant 24 h à 4 °C. IgG de l’espèce primaire sert de contrôle immunostaining négatif.
    5. Incuber dans un cocktail d’anticorps secondaires (1:200 âne anti-lapin 568 et 1:200 FITC âne anti-mouton dans pbs avec 0,1% TX-100). Utilisez du papier d’aluminium pour protéger la solution de la lumière pendant la préparation et l’incubation; incuber à TA pendant 2 h.
      1. Pour un témoin négatif, incuber des sections en IgG de l’espèce primaire diluées à la même concentration que celle utilisée pour les anticorps primaires.
      2. Laver 2 x PBS et 1 x TS pendant 5 min chacun à RT. Monter des sections de tissu sur des lames plus dans un milieu de montage avec une tache de Hoechst et une lamelle de couverture.
    6. Incuber dans un cocktail d’anticorps secondaires (1:200 âne anti-lapin 568 et 1:200 FITC âne anti-mouton dans pbs avec 0,1% TX-100). Utilisez du papier d’aluminium pour protéger la solution de la lumière pendant la préparation et l’incubation; incuber à TA pendant 2 h.
    7. Laver 2 x PBS et 1 x TS pendant 5 min chacun à RT. Monter des sections de tissu sur des lames plus dans un milieu de montage avec une tache de Hoechst et une lamelle de couverture.
    8. Protéger les lames de la lumière et de l’oxydation jusqu’à l’imagerie en les stockant dans une boîte à glissière à 4 °C.
    9. Analysez d’abord le témoin négatif pour déterminer le niveau de fond de fluorescence, puis évaluez l’immunoréactivité positive à l’aide de la microscopie fluorescente.
  2. Immunohistochimie Iba1 avec précipitation chromagène
    1. Retirer les tubes contenant le mécène sectionné du congélateur à -20 °C et les amener à RT. Retirer les sections de tissu contenant du substantia nigra de la solution cryoconservatrice dans un plateau contenant du PBS.
    2. Placer des sections de tissu dans des inserts en polystyrène pour l’immunochimie flottante. Laver les sections 3 x 5 min dans du PBS et placer les sections directement dans une plaque de 12 puits contenant de l’acide citrique monohydraté préchauffé de 10 mM, pH 9,0, 80 °C pendant 30 min, pour la récupération de l’épitope.
    3. Plaque froide 20 min à RT. Retournez les sections aux inserts et lavez 3 x 5 min dans pbs.
    4. Transférer des sections sur une plaque de 96 puits contenant une solution bloquante de 180 μl (10 % de sérum de chèvre normal, 1 % de BSA dans du PBS) par puits, et incuber 40 min à TA.
    5. Transférer des sections dans des puits contenant 180 μl d’anticorps primaires dilués (1:1000 dans 1 % de BSA-PBS). Incuber pendant la nuit à 4 °C.
    6. Transférer des sections vers des insertions. Laver 3 x 5 min PBS et appliquer l’anticorps secondaire biotinylé (1:200 dans le sérum-PBS normal à 1,5%) pendant 1 h à droite.
    7. Préparer la solution ABC 30 min avant utilisation. Laver 3 x 5 min PBS et transférer en solution ABC pendant 1 h à RT.
    8. Préparer la solution de DAB dans la hotte. Laver 2x 5 min en PBS et 1x 5 min en TS, et incuber des sections dans DAB.
      1. Développer pendant 3-4 min. Le contrôle négatif doit rester de couleur claire.
        Remarque: effectuez cette étape dans la hotte car le DAB est un cancérogène connu. Une solution de permanganate de potassium 0,2 M dans leddH2O pour la décontamination doit être maintenue à proximité en cas de gouttes accidentelles.
    9. Rincer brièvement lessections en ddH2 O, puis en TS 3 x 5 min. Montez des sections sur des glissières plus et séchez à l’air pendant la nuit dans la hotte.
    10. Décontaminer les déchets de DAB d’un volume égal de permanganate de potassium de 0,2 M dans leddH2O,vortex et incuber dans une hotte pendant la nuit avant de les stocker dans une poubelle DAB étiquetée de manière appropriée dans la hotte.
      Remarque : La solution d’eau de Javel n’élimine pas les propriétés mutagènes du DAB.
      1. Décontaminer les articles à réutiliser (c.-à-d. les inserts en polystyrène) et les laver avec du détergent.
    11. Déshydrater/contre-tache légèrement avec du cresyl violet (CV). Toutes les étapes de déshydratation/lavage sont de 3 min : éthanol 70%, 95%, 100%, 95%,ddH2O,CV (30 secondes), ddH20 x 2, éthanol à 95% + acide acétique glacial (0,1%) x 2, éthanol à 100 % et xylène.
    12. Lamelle de couverture dans un milieu de montage distyrène-toluène-xylène et sèche dans la hotte.
    13. Observez une immunoréactivité positive au microscope optique. IgG de l’espèce primaire sert de contrôle immunostaining négatif.

9. Statistiques

  1. Évaluer les différences entre les moyens au moyen d’une analyse de variance à sens unique (ANOVA) pour comparer les différences entre le génotype et par L’ANOVA bidirectionnelle pour comparer les différences entre le génotype et le traitement toxique. Utiliser l’analyse post hoc HSD de Tukey lorsque des différences sont observées par des tests ANOVA(p≤0,05).
    Remarque : les expériences (avec n = 6-9 souris/groupe) sont effectuées au moins deux fois pour assurer la reproductibilité.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ce paradigme d’exposition de toxine peut produire un épuisement significatif et discernable de dopamine striatal de 20% chez les animaux MPTP- contre des animaux salin-injectés. Il est important de noter que différents lots de MPTP peuvent donner légèrement plus ou moins de lésion; ainsi, pour une meilleure précision, une expérience préliminaire chez des souris de type sauvage est recommandée avant utilisation en transgénique lorsqu’un nouveau lot de neurotoxine est utilisé. L’utilisation de lésions légères à modérées permet d’observer l’impact du transgène; une lésion grave peut produire un « effet de plancher » avec des dommages trop robustes pour atténuer ou si dommageables qu’elle éclipse l’effet d’une altération génétique délétère. Les effets du MPTP sur la dopamine striatale étaient significativement différents chez les souris déficientes en isozyme 5-LOX, mais pas chez les souris déficientes en isozyme 12/15-LOX (Figure 1). En outre, avec ces méthodes, nous avons pu discerner une différence significative dans les niveaux de dopamine due à la carence en 5-LOX chez les souris traitées à la solution saline (Figure 1).

L’immunoblotting pour le TH et le GFAP a permis de confirmer les dommages et la neuroinflammation, respectivement, au niveau du striatum chez les souris de type sauvage, un effet qui a été diminué dans le striatum déficient en isozyme 5-LOX (figures 3A et 3B). La lésion est également perceptible au niveau de la substantia nigra(figures 2A et 2B). Chez les mêmes souris, l’épuisement des neurones TH-positifs et l’augmentation de l’immunoréactivité GFAP sont observables à l’aide d’un étiquetage immunofluorescent à double étiquette (Figure 2A). En outre, l’activation microgliale nettement élevée(c’est-à-dire l’immunoréactivité Iba1) chez les souris de type sauvage, mais non déficiente en isozyme 5-LOX, est apparente dans la substantia nigra après l’exposition au MPTP(figure 2B). Ainsi, le modèle mptp peut fournir un outil utile pour évaluer l’impact de la prédisposition génétique à la dégénérescence et à l’inflammation nigrales.

Figure 1
Figure 1. effets isozyme-sélectifs de LOX sur la dopamine striatal après défi de MPTP. (A) Des homogénats Striatal ont été employé pour mesurer la dopamine (DA) par HPLC de WT et de 5-LOX-/- littermates donnés salin ou MPTP (n=6-8/group). ‡, marque un effet significatif dû au génotype; p<0,05. *, marque un effet significatif en raison du génotype et du traitement; p<0,05. Aucune différence significative due au traitement n’a été notée chez les souris 5-LOX-/- (n.s.) indiquant que le MPTP n’a pas produit l’épuisement striatal de DA dans cette ligne transgénique. (B) Des homogénats striatal ont été utilisés pour mesurer l’AD dans WT et les compagnons de litière 12/15-LOX-/- étant donnés une solution saline ou un MPTP (n = 6-9/group). On n’a observé aucune différence significative dans les niveaux d’AD dus au génotype. Un traitement significatif, et semblable, dû de réduction de MPTP a été noté dans les deux génotypes. *, p<0,01. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM.

Figure 2
Figure 2. Effets d’isozyme 5-LOX sur TH et astroglia nigral suivant le défi de MPTP. (A) La souillure d’immunofluorescence pour TH (FITC ; vert) et GFAP (568 ; rouge) immunoreactivities a été exécutée dans les sections nigral de cerveau de WT et de 5-LOX-/- littermates donnés salin ou MPTP. Moins de corps cellulaires TH-positifs (*) et l’immunoreactivity augmenté de GFAP sont évidents dans le groupe de WT-MPTP. Bar = 25 μm. (B) L’histologie immunohistochimique de l’Iba-1 sur microglie a été détectée à l’aide de DAB (chromatgène brun); des sections ont été contre-colorées par le violet de Cresyl. Des sections Nigral de WT et de 5-LOX-/- littermates traités avec la solution saline ou le MPTP ont été évaluées. Des microglies avec des corps cellulaires ramifiés et de longs processus de ramification sont observées chez substantia nigra de souris traitées à la solution saline (têtes de flèche). Une microglie activée avec des corps cellulaires arrondis et des processus courts et épaississants, a été observée chez le nigra substantia de souris traitées par MPTP (flèches). Bar = 10 μm.

Figure 3
Figure 3. Effets 5-LOX d’isozyme sur TH striatal et insulte toxique suivante inflammatoire. (A) Des niveaux striatal de protéine de TH ont été semi-quantitativement mesurés par des analyses occidentales de tache d’homogénéate de WT et de 5-LOX-/- littermates donnés salin ou MPTP (n=6-8/group). Immunoreactivity, mesuré par densité optique, a été normalisé à β-actine. *, p<0,05. (B) De même, le GFAP a été mesuré semi-quantitativement par des analyses western blot de l’homogénat striatal de WT et de 5-LOX-/- littermates donnés avec salin ou MPTP (n= 6-8/group) et normalisé à β-actine. *, p<0,05. Les données sont notées comme moyennes ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La conception de cette étude d’interaction gène-environnement nous a permis d’obtenir de nouvelles informations concernant la double nature de l’isozyme 5-LOX dans la voie nigrostriatal. En effectuant hplc pour mesurer les monoamines striatal après traitement salin ou MPTP dans les transgéniques dépourvus de l’isozyme 5-LOX et leurs littermates de type sauvage, nous avons pu noter que sa carence semble être protectrice dans des conditions toxiques (Figure 1), mais dans des conditions normales, l’absence de l’enzyme réduit les niveaux de dopamine striatal et peut être délétère. Ainsi, nous sommes en mesure de démontrer que l’isozyme 5-LOX contribue au tonus dopaminergique striatal dans des conditions normales, mais peut contribuer à des dommages suite au défi toxique4.

Bien qu’une évaluation plus approfondie devrait fournir de nouvelles connaissances mécanistes sur le rôle des isozymes LOX dans la toxicité nigrostriatale, les analyses par transfert western (figure 3) ainsi que les études immunohistochimiques (figure 2) ont révélé que les marqueurs de neuroinflammation étaient, au moins en partie, atténués dans la cohorte déficiente en isozyme 5-LOX exposée au MPTP. Ces résultats, utilisant des techniques biochimiques et histologiques classiques, indiquent un rôle critique des produits 5-LOX dans la potentialisation de l’activation micro- et astro-glial4.

Selon l’interaction gène-environnement étudiée, des lectures pathologiques en plus de l’activation gliale peuvent être analysées. D’importance particulière dans le palladium est perte de neurones dopaminergiques dans le nigra de substantia et accumulation et agrégation potentiellement pathologiques de α-synuclein. Dans ce sens, l’impact de l’exposition aux substances toxiques chez les souris transgéniques atteintes d’une surexpression de α-synucléine a été surveillé par évaluation de la mort cellulaire nigrale(c’est-à-dire en utilisant un comptage cellulaire stéréologique non biaisé) et du dépôt insoluble de α-synucléine32-35.

La dose de MPTP utilisée dans le paradigme décrit ici produit une lésion légère avec une lésion striatale modeste, mais significative (Figure 1) et une activation gliale dans le striatum et le substantia nigra (Figures 2 et 3). Typiquement, des doses plus élevées du toxique sont utilisées pour produire une perte de cellules dopaminergiques nigrale robuste et un épuisement striatal de dopamine23,24,32,36-38,39. Il est important de noter que la toxicité du MPTP peut varier d’un fournisseur à l’autre et d’un lot à l’autre; par conséquent, les doses peuvent devoir être ajustées pour produire la lésion désirée. En outre, d’autres facteurs qui doivent être pris en compte sont la souche et le sexe des animaux utilisés pour les études. La sensibilité sélective à la neurotoxine a été démontrée dans des souches de fond distinctes de souris, un phénomène dû, au moins en partie, aux différences dans l’activation des voies subcellulaires qui négocient la dégénérescence, y compris JNK et c-Jun36-39. Des différences dépendantes du sexe dans la toxicité du MPTP ont également étésignalées 40,41, et peuvent contribuer à la variabilité dans les études utilisant des souris transgéniques dans lesquelles les deux sexes sont utilisés pour les lignées de reproduction médiocre. Dans un tel cas, l’utilisation de témoins de type sauvage appariés selon le sexe est essentielle4. De tels effets liés au sexe peuvent expliquer la différence de lésion observée chez les souris WT entre les expériences testant l’impact de souris déficientes en 5 et 12/15-LOX chez lesquelles un sexe a été utilisé pour une lignée et les deux sexes pour l’autre(Figure 1). Pour les études d’interaction gène-environnement, un défi MPTP qui produit des blessures graves(par exemple, > réduction de 80% de la dopamine striatale) n’est pas recommandé car cela peut masquer un effet génétique possible.

Tandis que l’exposition de MPTP produit la mort cellulaire nigral3,42,l’épuisement striatal de dopamine3,l’inhibition du complexe I43-45,et l’activation glial46,47 qui ont été rapportées dans le palladium humain, chez la souris, une dégénérescence lentement progressive qui produit le parkinsonisme stable(c.-à-d. déficits de moteur) et la pathologie franche de α-synucléine(c.-à-d. corps de Lewy et neurites) récapitulant entièrement des dispositifs caractéristiques caractéristiques de marque de la maladie ne se produit pas dans le modèle. Cependant, il est important de noter que la souris MPTP a joué un rôle essentiel dans la compréhension des voies subcellulaires qui contribuent à la neurodégénérescence liée à la MP. La variation des paradigmes d’exposition, par exemple, a révélé l’activation de mécanismes distincts de toxicité: l’exposition subaiguë à faible dose favorise la mort cellulaire apoptotique48 avec une réponse immunitaire limitée49 tandis que le traitement aigu avec des doses plus élevées produit une activation microgliale marquée50. En effet, de tels facteurs devraient être pris en compte lors de l’utilisation du modèle pour les études d’efficacité et, pertinents pour la présente étude, pour démasquer l’impact d’un facteur de risque génétique potentiel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Il n’y a rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par le NIGMS 056062 des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01 counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt 7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

Tags

Médecine Numéro 83 MPTP dopamine Iba1 TH GFAP lipoxygénase transgénique interactions gène-environnement souris Maladie de Parkinson neurodégénérescence neuroinflammation
Modèles d’interaction gène-environnement pour démasquer les mécanismes de susceptibilité dans la maladie de Parkinson
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R.,… More

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter