Visualisering af endoplasmatiske reticulum Subdomains i dyrkede celler
Summary
Vi beskriver de billeddannende metoder, vi bruger til at undersøge fordelingen og mobilitet for de transficerede fluorescerende proteiner er hjemmehørende i det endoplasmatiske reticulum (ER) ved hjælp af konfokal billedbehandling af levende celler. Vi har også ultrastrukturelt analysere effekten af deres udtryk på arkitektur i dette subcellulære rum.
Abstract
Lipider og proteiner i eukaryote celler kontinuerligt udveksles mellem cellekamre, selv om disse bevarer deres karakteristiske sammensætning og funktion til trods for intense interorganelle molekylære trafik. De er beskrevet i dette dokument teknikker er effektivt middel til at studere protein og lipid mobilitet og handel in vivo og i deres fysiologisk miljø. Fluorescens opsving efter fotoblegning (FRAP) og fluorescens tab fotoblegning (FLIP) er meget udbredt live-cell imaging teknikker til at studere intracellulær menneskehandel gennem exo-endocytiske proces, kontinuiteten mellem organeller eller underkamre, dannelsen af protein-komplekser, og protein lokalisering i lipid mikrodomæner, kan alle blive observeret under fysiologiske og patologiske tilstande. Begrænsningerne ved disse fremgangsmåder er hovedsageligt på grund af anvendelsen af fluorescerende fusionsproteiner, og deres potentielle ulemper omfatter kunstig overudtrykkerion i celler og mulighed for forskelle i foldning og lokalisering af mærkede og native proteiner. Endelig er som grænse for løsningen af optisk mikroskopi (omkring 200 nm) ikke tillader undersøgelse af den fine struktur af ER eller de specifikke underkamre der kan stamme i celler under stress (dvs. hypoxi, medicin administration, overekspression af transmembrane ER hjemmehørende proteiner) eller under patologiske tilstande, vi kombinerer live-cell imaging af dyrkede transficerede celler med ultrastrukturel analyser baseret på transmission elektronmikroskopi.
Introduction
Opdagelsen af grønt fluorescerende protein (GFP) og dets spektrale varianter, og den parallelle udvikling af fluorescens mikroskopi, har åbnet helt nye muligheder for undersøgelse af protein adfærd i celler. Teknikker, såsom fluorescens opsving efter fotoblegning (FRAP) og fluorescens tab fotoblegning (FLIP), der er mulig på grund af den iboende evne fluorophores at slukke deres fluorescens under intens belysning, er baseret på konfokal live-cell imaging og brugen af transficerede fluorescerende fusionsproteiner 1-3. De er meget udbredt til at vurdere ikke kun lokalisering af proteiner, men også deres mobilitet og vesikulær transport, som kan afsløre vigtige spor vedrørende deres funktion 4.
Det unikke i eukaryote celler, er tilstedeværelsen af intracellulære rum, der har specifikke lipid-og proteinpræparater. Selvom organeller er fysisk isolated, de har brug for at kommunikere med hinanden og udveksle molekylære komponenter for at opretholde cellulær homeostase. Udskillelsen garanterer, at proteiner og lipider syntetiseret i ER nå den korrekte endelige bestemmelsessted, hvor de udøver deres funktion. Intracellulære organeller kan også tilsluttes med dynamiske kontakt sites, der tillader molekyler (lipider), der skal udveksles direkte mellem rummene. Desuden har mange proteiner samles i store heteromere komplekser eller forbundet med specifikke lipid arter (lipidklumperne / mikrodomæner) for at blive funktionelt aktive eller at blive transporteret til deres endelige bestemmelsessted. Alle disse biologiske aspekter stor indflydelse de kinetiske egenskaber af proteiner, og de kan derfor hensigtsmæssigt undersøges ved hjælp af de nedenfor beskrevne teknikker.
Vores gruppe har udbredt FRAP og Flip kombineret med elektronmikroskopi for at studere arkitektur ER og dens forskellige subdomæner. ER er den første station i sekretionsvejen og spiller en central rolle i protein og lipid sortering 5.. Det er en meget dynamisk organel hvis distinkt subdomæner afspejler dens mange forskellige funktioner (dvs. protein og lipid biosyntese og menneskehandel, protein foldning, Ca 2 + opbevaring og frigivelse, og miljøfremmede metabolisme). Men selv om de er morfologisk, rumligt og funktionelt forskellige, disse domæner er kontinuerlige med hinanden og deres relative overflod kan ændres i celler under fysiologiske og patologiske tilstande. Den bedst kendte og normalt rumligt adskilte domæner af ER er den nukleare kuvert, og den glatte og ru ER, men vi og andre har vist, at der er ER-strukturer med en mere omfattende arkitektur og tre-dimensionelle organisation i forskellige celletyper og væv under fysiologiske betingelser, som også kan induceres ved hjælp af stressende stimuli, såsom hypoksi, narkotikaadministration eller overekspression af ER-resident transmembrane proteiner 2,6 (og referencer deri).
Vi har også for nylig vist tilstedeværelse af sådanne strukturer i celle modeller for humane sygdomme 1,7. Stammer fra det stablede cisternae af glatte ER, fik de den kollektive navn organiserede glatte endoplasmatiske reticulum (OSER) i 2003 6, selv om de også er kendt som karmellae, lameller og krystalloide ER på grundlag af deres arkitektur, der ligesom deres størrelse, kan variere. Efter at cellerne transficeres med GFP fusioneret til den cytosoliske region hale forankret (TA) ER-resident proteiner (d EGFP-ER), den svagt dimeriserende tendens GFP i trans dramatisk ændrer organisation og struktur ER. FRAP og FLIP forsøg viste, at d EGFP-ER er fri til at diffundere i OSERs, og at den bevæger sig fra det retikulære ER til OSER og omvendt </ Em> viser, at aggregaterne er sammenhængende med den omgivende retikulære ER. Ultrastrukturel analyse har tilladt os at korrelere fluorescens data med en detaljeret beskrivelse af OSER arkitektur og organisation på nanoskala niveau: OSERs altid består af stakke af parrede cisternae af glatte ER, men kan have forskellige former for fysisk planlægning, såsom regelmæssigt arrangeret sinusformet arrays eller hvirvler eller sekskantede "krystalloide" rørformede arrays. Disse omrokeringer føre til kubiske morfologier 8, der, som de er blevet fundet i cellerne under fysiologiske betingelser 9 og følgende belastninger såsom hypoksi 10, narkotikabehandling 11, og kræft 9, kan have et betydeligt potentiale som ultrastrukturelle markører.
Efter denne første demonstration ved hjælp af GFP fusionsproteiner brugte vi billeddannelse eksperimenter til at analysere udbredelsen af ER-domæner som reaktion på farmakologiske behandlinger 12, Assess tendens fluorescerende proteiner til oligomerise i celler 13, og for at undersøge, hvilken rolle af en mutant ALS-linked TA protein i dannelsen af intracellulære aggregater af ER oprindelse, der kan være relevante for dens patogenicitet 1,8. Det er blevet foreslået, at dannelsen af intracellulære aggregater (som forekommer i mange neurodegenerative sygdomme, 14) kan være en beskyttende mekanisme for at forhindre interaktioner mellem toksiske mutantproteiner og de omkringliggende cellebestanddele 15.
Hvad der følger er en beskrivelse af en kombination af optiske og elektronmikroskopi metoder til at undersøge konstruktioner hvis C-terminale hydrofobe domæner er indsat i membranen af ER, og en analyse af deres dynamiske adfærd og virkningerne af deres overekspression på ER domæne arkitektur i dyrkede celler (se figur 1 viser et flowdiagram af den eksperimentelle protokol).
Protocol
Representative Results
Discussion
De protokoller og billedteknik, der er beskrevet i dette papir er blevet brugt til at undersøge fordelingen og mobilitet transficerede TA fluorescerende proteiner er hjemmehørende i Skadestuen af levende celler. Vi har også analyseret virkningen af over-ekspression af disse proteiner på arkitektur i dette subcellulært afsnit ved hjælp af ultrastrukturelle analyser.
Kombinationen af live-cell konfokal billedbehandling og elektronmikroskopi repræsenterer er en meget kr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelige for Fondazione Filarete for sin hjælp og støtte i offentliggørelsen af denne artikel. Vi vil også gerne takke Centro Europeo di Nanomedicina for brug af Tecnai G2 transmissions elektron mikroskop.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
References
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
- Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
- Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
- Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
- Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
- Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
- Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
- Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
- Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
- Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
- Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
- Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).
