Summary
מערכת מודל זה מתחילה מג'ל הפיברין myofibroblast-מאוכלס שיכול לשמש כדי לחקור קולגן אנדוגני (מחדש) ארגון בזמן האמת באופן הרסני. מערכת המודל היא מאוד מתכונן, כפי שהוא יכול להיות בשימוש עם מקורות תאים שונים, תוספים בינוניים, וניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים.
Abstract
תוכן קולגן והארגון בפיתוח רקמות collagenous יכולים להיות מושפע על ידי זני רקמות מקומיים ואילוץ רקמות. מהנדסי רקמות שואפים להשתמש בעקרונות אלה כדי ליצור רקמות עם ארכיטקטורות קולגן מוגדרות מראש. הבנה מלאה של התהליכים שבבסיס המדויקים של שיפוץ קולגן לשלוט ארכיטקטורת הרקמה הסופית, לעומת זאת, היא חסרה. בפרט, מעט מאוד ידוע על הנטייה (מחדש) של סיבי קולגן בתגובה לשינויים בתנאי העמסה מכאניים של רקמות. אנחנו פיתחה במערכת מודל חוץ גופית, בהיקף של-myofibroblast זרע מבני Biaxially-מוגבלים הפיברין, על מנת להבהיר עוד יותר קולגן (מחדש) בתגובה לנטייתי) חוזר biaxial לתנאי העמסה סטטיים uniaxial ו-II) טוען uniaxial המחזורי של Biaxially-מוגבל מבנים לפני ואחרי שינוי בכיוון טעינה, עם שימוש במכשיר טעינת FX4000T Flexcell. זמן לשגות הדמיה confocal משמשת לVIsualize קולגן נטייה (מחדש) באופן הרסני.
תא וקולגן הארגון במבנים ניתן דמיינו בזמן אמת, ומערכת ייחוס פנימית מאפשרת לנו להעביר את התאים ומבני קולגן לניתוח זמן לשגות. היבטים שונים של מערכת המודל יכולים להיות מותאמים, כמו מקור תא או שימוש בתאים בריאים וחולים. תוספים יכולים לשמש כדי להבהיר מנגנוני שיפוץ קולגן בסיסי עוד יותר, על ידי למשל הוספת MMPs או חסימת integrins. צורה וגודל של המבנה ניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים, וכתוצאה מכך מערכת מודל מתכונן מאוד ללמוד תא וקולגן ארגון (מחדש).
Introduction
יש לי רקמות לב וכלי דם פונקציה בולטת נושאת עומס. בתוכן מסוים וארגון של סיבי קולגן במטריקס לתרום למאפייני עומס הנושאות ולשלוט בכוח רקמות כללי 1. בהנדסת רקמות משמש מיזוג מכאני של המבנה - בדרך כלל בהיקף של (מחזורי) משטרים מתאמצים - על מנת לשפר את הארגון ורקמות תכונות מכאניות 2,3. הבנה מלאה של ארגון קולגן מושרה מתח ברקמות גיאומטריות מורכבות כדי ליצור רקמות עם ארכיטקטורת קולגן מוגדרת מראש עדיין לא הושגה. זה נובע בעיקר מהידע המוגבל שלנו של שיפוץ קולגן ברקמות מתפתחות. מודלים קיימים בעיקר לתת מידע על התוצאה הסופית של שיפוץ הנקי קולגן עם שימוש בלחץ סטטי 4-6. כאן אנו מספקים מערכת מודל מתכונן מאוד שמאפשרת הלימוד של ארגון קולגן (מחדש) באופנה בזמן אמת, ב-3D, תחת השפעהעומס סטטי או מחזורי. מבני הרקמות הם מבוססי הפיברין, על מנת להבטיח שכל קולגן במבנה הוא אנדוגני. תא וקולגן ארגון במבנים הוא דמיינו, ומערכת ייחוס פנימית מאפשרת לנו להעביר את התאים ומבני קולגן לניתוח זמן לשגות. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של מערכת המודל לתאי Saphena הנבוב אנוש (HVSCs), שכן תאים אלה ידועים לייצור שלהם המשופר הנוסף הסלולרי מטריצה והיכולת לשפץ את המטריצה והשימוש שלנו הוקם ברקמות מהונדסות 7 לב וכלי דם, המבוסס על עבודתו של דה יונגה et al. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות של תאי Saphena הנבוב אדם
- בודד תאים מוריד saphena Magna, שנרכש מתורם בהתאם להנחיות לשימוש בחומרים משני, על פי הפרוטוקול על ידי שנל ואח'. 9 ולאחסן אותם בחנקן נוזלי. מהחלק מוריד saphena Magna מאחת חתיכות לחתוך תורמות של 2 מ"מ x 2 לתרבות בצלחת שש היטב. השתמש 2 חתיכות בכל טוב. ניתן להשיג באופן כללי מספיק תאים כדי למלא כ 3 צלוחיות עם 0.25 x 10 6 תאים בחנקן נוזלי. HVSCs מאופיין כmyofibroblasts, על ידי הצגת ביטוי של vimentin, לא ביטוי של desmin וsubpopulation להביע שריר חלק α אקטין 10. הבא יתחילו הפרוטוקול להפשיר את התאים מהחנקן הנוזלי כדי להגדיל את מספר התאים.
- מניחים את התאים מבקבוקון אחד לתוך בקבוק תרבית רקמה T75 ולהוסיף מדיום גידול (GM), בהיקף של מתקדם DMEM, 50 מיליליטר סרום שור העובר (FBS), 5 מ"ל פניצילין /סטרפטומיצין ו5 מיליליטר L-Glutamax. מדיום לשנות כל 2-3 ימים.
- תאים גדלים כ מחוברות לאחר 14 ימים. חנות 0.5 x 10 6 תאים בבקבוקון אחד בחנקן נוזלי, המכונה קטע 1.
הערה: הקפאה של התאים אינה הכרחית כאשר קצירת HVSCs, אבל משמשת אך ורק לאחסון.
- מניחים את HVSCs מבקבוקון אחד לתוך בקבוק תרבית רקמה T175 ולהוסיף GM. מדיום לשנות כל 2-3 ימים. תאים גדלים מחוברות לאחר כ 7 ימים. חנות 3 x 10 6 תאים בבקבוקון אחד בחנקן נוזלי, המכונה מעבר 2.
- מניחים את התאים מבקבוקון אחד לrollerbottle ולהוסיף GM. מדיום לשנות כל 2-3 ימים. תאים גדלים כ מחוברות לאחר 8 ימים. rollerbottle אחת מכיל כ 20-30 x 10 6 תאים. תרבות תאים עד חלוף 6. אל תשתמשו בתאים של מעבר גבוהים יותר מאשר מעבר 9, מאז פנוטיפ התא עשוי להשתנות. 2. הנדסת רקמות של מבנים מבוססי הפיברין
- הכן את דבק סיליקון על ידי ערבוב עם אלסטומר סוכן הריפוי (10:1). לחתוך 7 x 3 מ"מ מגזרים מלבניים של סקוטש. דבק סקוטש ל6 צלחת תרבות היטב, עם קרום גמיש כדי ליצור צלב, ולהשאיר מקום בריבוע של 3 מ"מ בין רצועות סקוטש.
- ייבש את דבק סיליקון הלילה בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס, כדי להבטיח התקשות של הדבק. לעקר על ידי הוספת 70% EtOH לבארות והדגירה למשך 30 דקות. לשטוף 3x עם PBS ולהסיר את כל PBS מwelLS וסקוטש. לשים תחת UV למשך 30 דקות ולשמור סטרילי עד לשימוש.
- להכין מדיום הנדסת רקמות (TM), בהיקף של GM ו130 מ"ג של חומצה אסקורבית L-2-פוספט.
- הוסף 1 מ"ג / חומצה קפרואית ε-אמין מ"ל (ACA) למדיטציה הטרנסנדנטלית. ACA משמש במשך 7 הימים הראשונים של התרבות כדי למנוע הפיברין מ -11 משפילים. לחלופין, ניתן להשתמש aprotinin.
- כדי למנוע היווצרות גוש, פיברינוגן לאפשר להגיע לטמפרטורת חדר לפני הפתיחה. ללא פיברינוגן גושים יתמוססו בקלות רבה יותר. ממיסים פיברינוגן לריכוז של 10 מ"ג בפועל חלבון / מיליליטר TM 7 בתוספת ACA. סינון סטרילי פתרון פיברינוגן, מסננים מרובים עשויים להיות נחוצים. אחסן על קרח עד לשימוש.
- ממיסים תרומבין לריכוז של 10 IU / מיליליטר TM 7 בתוספת ACA. אחסן על קרח עד לשימוש. </ Ol>
- Trypsinize התאים, resuspend בGM ולספור.
- השתמש 15 x 10 6 תאים / מ"ל לזריעת מבני הרקמות מבוססי הפיברין (ריכוז המבוסס על שיטות לרקמות מסתמי לב הנדסי 7). הג'ל יחיד מורכב מ100 μl GOF אל, ובכך של 1.5 x 10 6 תאים. שים 1.5 x 10 6 תאים בצינור צנטריפוגות אחד, וכתוצאה מצינורות צנטריפוגה רבות כמו מספר ג'לי שיבוצע.
- צנטריפוגה התאים ב XG 350 במשך 7 דקות וזורקים supernatant. Resuspend התאים 50 תרומבין μl. הוסף 4 μl של כחול ניאון הקלקר microspheres להשעיה זו. לשים 50 μl של פיברינוגן בבקבוקון. השתמש פיפטה לקחת את תרומבין μl 50 עם תאים. הגבר את עוצמת הקול של פיפטה μl עד 100. פיפטה פתרון μl 50 של תרומבין עםתאים לתוך הבקבוקון עם פיברינוגן לערבב תרומבין ופיברינוגן, ולקחת את תערובת μl 100.
- פיפטה את התערובת לתוך הג'ל ובין רצועות סקוטש. זמן gelation האופייני לג'לי הפיברין, ברגע שהרכיבים הם מעורבים, הוא בסדר גודל של 20 שניות.
- דגירה השעיות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באוויר 95% / 5% CO 2 באינקובטור humidified לאפשר gelation לפני הוספת התרבות TM עם ACA.
- החלף TM עם ACA כל 2-3 ימים במשך 7 הימים הראשונים. ג'לי הוא יציב מספיק אחרי שבוע אחד כדי להיות מתורבת ללא ACA. אחרי השבוע הראשון להחליף TM כל 2-3 ימים. הוסף 6 מ"ל של TM בכל טוב. ביום 12 תאים יצרו מספיק קולגן להדמיה.
- מתח סטטי מיושם על ידי התאים באופן ישיר, עקב מתיחה ודחיסת תא 12. כדי לגרום לארגון מחדש קולגן, לחתוך את הרקמה לבנות רופפת משתי רצועות סקוטש בכיוון אחד. התוצאה הוא חד כיווני אילוצים (איור 1 א). לבצע את זה ביום 12, שכן המבנה הוא אז מספיק יציב וקולגן הופקד.
- החל לחץ מחזורי על ידי הפעלת ואקום לתחתית של צלחות התרבות עם קרומים גמישים, עם השימוש במערכת FX4000T Flexcell. מניחים את הצלחות על baseplate, על גבי הודעות טעינה (שהנן חלק של המכשיר העמסה מחזורי ה). משאבת ואקום חלה על הממברנה ובכך מושכת את הקרום מעל ההודעה המלבנית השוכבת מתחתיו. בשל את הקבצים המצורפים בצורת הצלב של הרקמה בונה על הקרום (דרך סקוטש) וההודעה המלבנית עומס המחזורי מיושם היא uniaxial (איור 1).
- בתחילה, השתמש בתרבות סטטית במשך 5 ימים כדי להשיג את השלמות מכאנית ראשונית, לפני היישום של מתח מחזורי מתחיל ביום 6. תכנית פרוטוקול כתם מחזורי לתוך הבקר למשאבת הוואקום. לדוגמא שימוש בפרוטוקול מתח מחזורי לסירוגין הוקם בעבר, עם כיוון uniaxial 13. זה מורכב מזן לסירוגין של גל סינוס עם 1 הרץ, מאמץ של 0 עד 5% מאמץ, לתקופות של 3 שעות, לסירוגין עם 3 תקופות מנוחה משאבי אנוש. לבצע פרוטוקול מתח מחזורי זה למשך 7 ימים, גרימת ארגון קולגן מיושר.
- בדרך כלל לאחר 12 ימים HVSCs יצרו organizatio קולגן מיושרn. לאחר שיושג ארגון קולגן מיושר, לשנות את כיוון העומס המחזורי uniaxial, כדי להיות בניצב לכיוון הזן המקורי. עושה זאת על ידי הפיכת את ההודעות המלבניות ב -90 מעלות.
- כדי להמחיש את שיפוץ פעיל, בזמן אמת, קולגן, דגימות תווית עם בדיקות שאינם מפריעות לכדאיויות תא או היווצרות קולגן. השתמש בבדיקות להכתים את הציטופלסמה התא וקולגן fluorescently.
- דור השני הרמוני לחלופין באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal יכול לשמש כדי לחזות מבני קולגן באמצעות 14 autofluorescence, עם עירור ב 780 ננומטר וזיהוי בין 500-550 ננומטר.
- הסר את צלחות התרבות מההגדרה והחממה, לדגימות מחזורית המתוחות במהלך תקופת מנוחת שעות 3, ולהעביר אותם למיקרוסקופ סריקת לייזר confocal לדמיין תאים וקולגן.
הערות: יש להשתמש בצד הרך של סקוטש ולהתמודד עם הצד הזה כלפי מעלה. כאשר הדבקת סקוטש, רק לכסות סקוטש עם סיליקון דבק, אינו מתפשט בכל דבק היטב. מאז יש לי את צלחות תרבות תחתית קרום סיליקון, להשתמש במשהו מתחת לצלחת גם לחיזוק הקרומים הגמישים, על מנת להבטיח הדבקה קלה לצלחת.
הערה: כדי לפזר את התערובת בעדינות פיברינוגן כדי למנוע היווצרות קצף רבה מדי.
הערה: יש צורך בשמירה על קרח כדי למנוע gelation המוקדם של תרומבין ופיברינוגן.
הערה: קלקר microspheres הניאון משמשות כסמני התייחסות פנימיות לניתוח תמונה. כאשר תרומבין ופיברינוגן ערבוב, למנוע היווצרות של בועות אוויר על ידי pipetting את התערובת בזהירות. בועות אוויר תגרום לחורים בג'ל הפיברין.
הערות: עשה זאת במהירות אפשרית כדי למנוע gelation לפני תערובת pipetted בצלחת היטב. להתאמן לפני שימוש בתאים וחרוזים.
3. שינויי זן והתרמה החלו בזנים ואילוצים
4. תאי קולגן ולדמיין
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת מודל זה מאפשר לג'לי הפיברין myofibroblast-זרע culturing. איור 1 א מציגה רקמת תרבית הראשונה תחת אילוצי biaxial סטטיים. אילוצי רקמות משתחררים על ידי חיתוך בג'ל הפיברין משני אילוצים, כדי ליצור אילוצים סטטיים uniaxial, ומחזק רקמות וremodels לאחר מכן (איור 1 א). למתח מחזורי, הרקמה בתרבית תחת אילוצי biaxial סטטיים גם כן. לאחר 5 ימים ניתן ליישם זן uniaxial מחזורי (איור 1). כדי לגרום לארגון מחדש קולגן, כיוון זן uniaxial ניתן לשנות לכיוון המאונך (איור 1). זורעי microspheres עם תערובת ג'ל, יציגו תבנית אקראית, המשמש להעביר מקומות מוגדרים מראש לזמן לשגות הדמיה (איור 2). איורים 2 א ו 2 ג להראות תמונה של תאים, קולגן וחרוזים. אלה אותם התמונות נסרקות 3 ימים (Figurדואר 2B) ו2 ימים (איור 2 ד) מאוחר יותר, בהתאמה. תאים ודפוסי קולגן השתנו, אבל דפוסי חרוז משמשים כדי להעביר את התאים וקולגן. דגימות culturing לתוצאות 12 ימים בייצור הקולגן אנדוגני בכמויות מספיקות כדי להיות דמיינו עם מיקרוסקופיה confocal (איורים 3 ו -4). באמצעות אחת תוצאות התרבית סטטיים או מחזורית בארגון של קולגן שונה במובהק, שבו התרבות סטטית biaxial מעוררת ארגון אקראי קולגן (איור 3 א) ומתח מחזורי uniaxial מוחל על תוצאות רקמות מוגבלים Biaxially במבנה קולגן מיושר (איורים 4 א ו-B) . ארגון קולגן זו ניתן ללמוד לאורך זמן, תוך שינוי האילוצים סטטיים או שינוי כיוון העומס המחזורי. כאשר אילוצי סטטיות השתנו מbiaxial לuniaxial, משנה את האורינטציה של קולגן מכיוון אקראי (איור 3 א) לכיוון מיושר (איור 3). זן מחזורי גורם לשינוי באורינטציה על פני השטח של הרקמה (איורים 4 א וג), אבל אחרי 3 ימים, לא חלו שינוי בליבה של הרקמה הוא ציין (איורים 4B ו-D).
איור 1. תרבית מבנים תחת אילוצי biaxial, המשמשים לארגון מחדש של קולגן על ידי () שחרור אילוצים סטטיים בכיוון אחד, או על ידי (ב) שינוי כיוון עומס מחזורי. הודעות טוענים מסומנות על ידי קווים שחורים מנוקדים. ברים סולם מצביעים על 3 מ"מ.
איור 2. דוגמה אופיינית לשימוש בדפוסי חרוז להעביר מקומות מוגדרים מראש ב-3D, במקרה זה באופן סטטידגימות תאים בתרבית. מוצגות באדום, ירוק וקולגן בחרוזים בצבע כחול. ו-C להראות תמונה של תאים, קולגן וחרוזים. תמונות אלו נסרקות 3 ימים (ב ') ו2 ימים (ד') מאוחר יותר, בהתאמה. דפוסי חרוז משמשים כדי להעביר את התאים וקולגן. בר סולם מציין 50 מיקרומטר.
איור 3. תמונות epresentative R של מתח סטטי 12 יום עם אילוצי biaxial () ואורינטציה בשל אילוצי uniaxial בתוך 7 ימים (ב ') בר. סולם מציינת 50 מיקרומטר.
איור 4. נציג תמונות לאחר 12 ימים (5 ימים סטטיים, ואחריו מתח מחזורי ימים 7) לעומס מחזורי על פני השטח () ו ~ 60 מיקרומטר לתוך הרקמה (ב '). לאחר שינוי בכיוון עומס מחזורי (לאחר 12 ימים), על פני שטח תאים וארגון מחדש של קולגן (C), אבל לא חל שינויים נראים בליבה של הרקמה (ד') לאחר 3 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת המודל המתוארת של מבני הפיברין תא מאוכלסים יש פוטנציאל גדול למחקר של תאים וקולגן (מחדש) ארגון (דה יונגה et al. 15), למשל, כדי לשמש למטרות הנדסת רקמות. באמצעות הפיברין כנשא התא הראשוני, אחרי השפלת הפיברין, רקמה נוצרה עם תאים ומטריקס אנדוגני בלבד. בדרך זו, תאי מגורה להגיב להתאמץ, או סטטי או מחזורי בטבע, על ידי החלת כוחות התכווצות 16,17, חישת גבול נוקשות 12, או הצגת הימנעות מתח.
משמעות: מבני הפיברין היו בשימוש לפני ללמוד קולגן (מחדש) ארגון 18, אך לא את היכולת של החלת מתח מחזורי ו / או לומד את המבנים באופן זמן לשגות, אשר שניהם אפשרי בשיטה זו שהוצגה. רצועות סקוטש המספקות את האילוצים במערכת מודל זה היו בשימוש לפני 19,אבל שילוב של טכניקה זו עם צלחות תרבות עם קרום גמיש מאפשר ליישם מתח מחזורי לתקופות ממושכות של זמן. Culturing בלוחות אלה מאפשר לתוספת קלה וההסרה של מדיום והדמיה של המבנים ועדיין מחובר וסטרילי. זה מאפשר לימוד תהליכי שיפוץ רלוונטי בזמן שפקעו או אפילו בזמן אמת.
שינויים ויישומים עתידיים: יישומים עתידיים של המערכת ניתן למצוא במניפולציה של תהליך שיפוץ 3D, למשל על ידי הוספת metalloproteinases או סוכנים שמפריעים integrin הרכבה או איתות. בסמוך ליישום של תוספים, ניתן לשנות את המרכיבים של מערכת המודל בקלות כאשר לומדים תא וקולגן ארגון (מחדש). מקורות שונים של תאים, תאים בריאים וחולים, את הבגרות של מטריצת הקולגן (למשל על ידי שינוי זמן התרבות), והצורה והגודל של המבנה יכולים להיות מותאמים לצרכי ספציפיים. המערכת היא גם שלuited למקורות תאים אחרים, במקום HVSCs המשמש כיום. יש לנו כבר בשימוש במערכת זו לתאי אנדותל תרבות מושבה להרכיב (ECFCs; PlosOne, התקבל לפרסום), שבו אנו צופים כי ECFCs אוריינט קולגן המיוצר עליהם באופן שונה ממתח מחזורי HVSCs.
מגבלות של טכניקה: מגבלה של מערכת המודל הנוכחית היא בגודל הגדול יחסית של הרקמות, הדורשים 1.5 x 10 6 תאים לכל מבנה בעת שימוש בצפיפות תאים של 15 x 10 6 תאים / מ"ל. זה עשוי להוות בעיה במקרים בהם ישמשו מקורות תאים פחות זמינים. מגבלה נוספת היא העובי הנוכחי של המבנים (כ 1 מ"מ), הנובע מהקבצים המצורפים (עבה) סקוטש. זה מגביל את הסריקה לconfocal רק חלק מהמדגם כולו. אפשר להגיע לעומק של 200 מיקרומטר מקס ברקמה, וזה מספיק כדי להמחיש תגובות הסלולר בתוך הליבה של הרקמות הנוכחיות, אבל לעשותes לא לגרום לסקירת עובי מלאה.
שלבים קריטיים ופתרון בעיות: כמערכת המודל מבוסס על היווצרות של רקמה בין הנקודות המצורפים סקוטש, זה כולל גם את השלבים הקריטיים בפרוטוקול. חיתוך והדבקה נכון הוא חיוני ותשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם על pipetting זהירה של תערובת ג'ל לתוך רצועות סקוטש לקובץ מצורף תקין של הרקמה, שהיא חיונית להחלת מתח מחזורי. ניתן למצוא צעדים החלטיים נוספים בבחירת מקור תא ותוספים בינוניות. אופטימיזציה תהיה צורך כאשר culturing עם מקור תאים שונה. נכון לעכשיו, בונה בתרבית עם ACA למשך 7 ימים, כדי להפסיק את הפיברין ממשפיל. מקור תא שונה יכול גם לגרום למסגרת זמן שונה בכל קשורים לבניית קולגן וגם פירוק הפיברין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה בוצע בתכנית המחקר של החומרים ביו (BMM) המכון. BMM הוא cofunded על ידי המשרד ההולנדי לעניינים כלכליים, חקלאות וחדשנות. התרומה הכספית של Hartstichting Nederlandse הוא הודה בהכרת תודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
