Summary
इस मॉडल प्रणाली एक nondestructive ढंग से अंतर्जात कोलेजन (फिर) संगठन वास्तविक समय अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक myofibroblast आबादी आतंच जेल से शुरू होता है. मॉडल प्रणाली यह अलग सेल स्रोतों, मध्यम additives के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में बहुत ट्यून करने योग्य है, और विशिष्ट जरूरतों को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
कोलेजन सामग्री और श्लेषजनउत्पादी ऊतकों के विकास में संगठन स्थानीय ऊतक उपभेदों और ऊतकों की कमी से प्रभावित हो सकते हैं. टिश्यू इंजीनियरों पूर्वनिर्धारित कोलेजन आर्किटेक्चर के साथ ऊतकों बनाने के लिए इन सिद्धांतों का उपयोग करना है. अंतिम ऊतक वास्तुकला को नियंत्रित करने के कोलाजेन remodeling के सटीक अंतर्निहित प्रक्रियाओं की एक पूरी समझ है, तथापि, कमी है. विशेष रूप से, छोटे ऊतक यांत्रिक लोड की स्थिति में बदलाव के जवाब में कोलेजन फाइबर की (फिर) अभिविन्यास के बारे में जाना जाता है. हम आगे कोलेजन स्पष्ट करने के लिए, biaxially विवश myofibroblast वरीयता प्राप्त आतंच निर्माणों से मिलकर, इन विट्रो मॉडल प्रणाली में विकसित मैं के जवाब में (फिर) ओरिएंटेशन) अक्षीय स्थिर लोड की स्थिति और द्वितीय के लिए द्विअक्षीय लौटना) biaxially-विवश की चक्रीय अक्षीय लोडिंग Flexcell FX4000T लोडिंग उपकरण के उपयोग के साथ, दिशा लदान में बदलाव के पहले और बाद में निर्माणों. समय चूक confocal इमेजिंग vi करने के लिए प्रयोग किया जाता हैएक nondestructive ढंग से कोलेजन (फिर) ओरिएंटेशन sualize.
निर्माणों में सेल और कोलेजन संगठन वास्तविक समय में देखे जा सकते हैं, और एक आंतरिक संदर्भ प्रणाली हमें समय व्यतीत विश्लेषण के लिए कोशिकाओं और कोलेजन संरचनाओं स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है. मॉडल प्रणाली के विभिन्न पहलुओं सेल स्रोत या स्वस्थ और रोगग्रस्त कोशिकाओं के उपयोग की तरह, समायोजित किया जा सकता है. Additives उदाहरण एम एम पी जोड़ने या इंटेग्रिन रोकने के लिए से, आगे तंत्र अंतर्निहित कोलेजन remodeling के स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. निर्माण की आकृति और आकार को आसानी से सेल और कोलेजन (फिर) संगठन का अध्ययन करने के लिए एक उच्च tunable मॉडल प्रणाली में जिसके परिणामस्वरूप, विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Introduction
हृदय के ऊतकों एक प्रमुख लोड असर समारोह है. बाह्य मैट्रिक्स में कोलेजन फाइबर का विशेष सामग्री और संगठन में लोड असर गुणों में योगदान और समग्र ऊतक शक्ति 1 हावी है. ऊतक इंजीनियरिंग में निर्माण के यांत्रिक कंडीशनिंग प्रयोग किया जाता है - आम तौर पर (चक्रीय) दबाव regimens के मिलकर - ऊतक संगठन और यांत्रिक गुणों 2,3 बढ़ाने के लिए. पूर्वनिर्धारित कोलेजन वास्तुकला के साथ ऊतकों बनाने के लिए जटिल ऊतक geometries में तनाव प्रेरित कोलेजन संगठन की पूरी समझ अभी तक हासिल नहीं किया गया है. यह विकासशील ऊतकों में कोलेजन remodeling के अपने सीमित ज्ञान की वजह से है. मौजूदा मॉडल मुख्य रूप से स्थिर तनाव 4-6 के उपयोग के साथ कोलेजन remodeling के अंतिम शुद्ध परिणाम के बारे में जानकारी दे. यहाँ हम प्रभाव में, 3 डी में, एक वास्तविक समय फैशन में कोलेजन (फिर) संगठन के अध्ययन की अनुमति देता है कि एक उच्च tunable मॉडल प्रणाली प्रदानस्थिर या चक्रीय तनाव की. ऊतक निर्माणों के निर्माण में सभी कोलेजन अंतर्जात है यह सुनिश्चित करना कि आतंच आधारित हैं. निर्माणों में सेल और कोलेजन संगठन कल्पना की है, और एक आंतरिक संदर्भ प्रणाली हमें समय व्यतीत विश्लेषण के लिए कोशिकाओं और कोलेजन संरचनाओं स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है. इन कोशिकाओं के आधार पर अपने बढ़ाया अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स उत्पादन और इंजीनियर हृदय के ऊतकों में 7 मैट्रिक्स और हमारे स्थापित उपयोग फिर से तैयार करने की क्षमता के लिए जाना जाता है के बाद से इस प्रोटोकॉल में हम, मानव रग Saphena कोशिकाओं (HVSCs) के लिए मॉडल प्रणाली के उपयोग का वर्णन करेंगे डी जोंगे एट अल. 8 के काम पर
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Protocol
1. मानव रग Saphena कोशिकाओं की संस्कृति
- Schnell एट अल द्वारा प्रोटोकॉल के अनुसार माध्यमिक उपयोग सामग्री के लिए दिशा निर्देशों के अनुसार एक दाता से अधिग्रहीत रग saphena मैग्ना,,. 9 से कोशिकाओं को अलग और तरल नाइट्रोजन में इन स्टोर. एक छह अच्छी तरह से थाली में संस्कृति के लिए 2 एक्स 2 मिमी की एक दाता कटौती टुकड़े से रग saphena मैग्ना के हिस्से से. प्रति अच्छी तरह से 2 टुकड़े का उपयोग करें. आम तौर पर पर्याप्त कोशिकाओं तरल नाइट्रोजन में 0.25 x 10 6 कोशिकाओं के साथ के बारे में 3 शीशियों भरने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. HVSCs vimentin, desmin का कोई अभिव्यक्ति और α चिकनी पेशी actin 10 व्यक्त subpopulation की अभिव्यक्ति दिखाकर, पेशीतंतुकोशिकाओं रूप में होती हैं. अगला कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए तरल नाइट्रोजन से कोशिकाओं पिघलना करने के लिए प्रोटोकॉल शुरू.
- एक T75 टिशू कल्चर फ्लास्क में एक शीशी से कोशिकाओं प्लेस और उन्नत DMEM, 50 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / से मिलकर मध्यम विकास (जीएम), जोड़स्ट्रेप्टोमाइसिन और 5 मिलीग्राम एल Glutamax. 2-3 दिनों हर माध्यम बदलें.
- कोशिकाओं लगभग 14 दिनों के बाद मिला हुआ हो जाना. स्टोर 0.5 तरल नाइट्रोजन में एक शीशी में x 10 6 कोशिकाओं, 1 बीतने के रूप में भेजा.
नोट: कक्षों की बर्फ़ीली HVSCs कटाई जब आवश्यक नहीं है, लेकिन पूरी तरह से भंडारण के लिए प्रयोग किया जाता है.
- एक T175 टिशू कल्चर फ्लास्क में एक शीशी से HVSCs प्लेस और जीएम जोड़ें. 2-3 दिनों हर माध्यम बदलें. कोशिकाओं लगभग 7 दिनों के बाद मिला हुआ हो जाना. स्टोर 3 तरल नाइट्रोजन में एक शीशी में x 10 6 कोशिकाओं, मार्ग 2 के रूप में भेजा.
- एक rollerbottle में एक शीशी से कोशिकाओं प्लेस और जीएम जोड़ें. 2-3 दिनों हर माध्यम बदलें. कोशिकाओं लगभग 8 दिनों के बाद मिला हुआ हो जाना. एक rollerbottle लगभग 20-30 x 10 6 कोशिकाओं में शामिल है. पारित होने के 6 से संस्कृति कोशिकाओं. सेल phenotype बदल सकता है, के बाद से पारित होने के 9 से अधिक एक मार्ग की कोशिकाओं का उपयोग न करें. 2. आतंच आधारित ऊतक constructs की इंजीनियरिंग
- इलाज एजेंट (10:1) के साथ elastomer के मिश्रण से सिलिकॉन गोंद तैयार करते हैं. वेल्क्रो के 7 एक्स 3 मिमी आयताकार खंडों में कटौती. एक क्रॉस के लिए फार्म, और वेल्क्रो स्ट्रिप्स के बीच 3 मिमी की चुकता जगह छोड़ने के लिए लचीला झिल्ली के साथ एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में गोंद वेल्क्रो,.
- गोंद की सख्त सुनिश्चित करने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में रातोंरात सिलिकॉन गोंद सूखी. 30 मिनट के लिए कुओं और सेते के लिए 70% EtOH जोड़कर जीवाणुरहित. पीबीएस के साथ 3x कुल्ला और wel से सभी पीबीएस हटानेलोकसभा और वेल्क्रो. 30 मिनट के लिए यूवी नीचे रखो और उपयोग करें जब तक बाँझ रखना.
- टिशू इंजीनियरिंग जीएम से मिलकर मध्यम (टीएम), और एल ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट की 130 मिलीग्राम की तैयारी.
- टीएम के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल ε-एमिनो कैप्रोइक एसिड (एसीए) जोड़ें. एसीए अपमानजनक 11 से आतंच को रोकने के लिए संस्कृति के पहले 7 दिनों के लिए प्रयोग किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, aprotinin इस्तेमाल किया जा सकता है.
- पेड़ों का झुरमुट गठन को रोकने के लिए, फाइब्रिनोजेन खोलने से पहले कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं. झुरमुटों फाइब्रिनोजेन बिना अधिक आसानी से भंग होगा. एसीए के साथ पूरक 10 मिलीग्राम वास्तविक प्रोटीन / एमएल टीएम 7 की एकाग्रता को फाइब्रिनोजेन भंग. बाँझ फिल्टर फाइब्रिनोजेन समाधान, कई फिल्टर की आवश्यकता हो सकती है. उपयोग करें जब तक बर्फ पर स्टोर.
- एसीए के साथ पूरक 10 आइयू / एमएल टीएम 7 की एकाग्रता को थ्रोम्बिन भंग. उपयोग करें जब तक बर्फ पर स्टोर. </ राजभाषा>
- जीएम और गिनती में resuspend कोशिकाओं, Trypsinize.
- आतंच आधारित ऊतक निर्माणों (ऊतक इंजीनियरिंग हृदय वाल्व 7 तरीकों के आधार पर एकाग्रता) बोने के लिए 15 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल का प्रयोग करें. एक ही जेल में 100 μl GOF एल, और इस प्रकार 1.5 x 10 6 कोशिकाओं के होते हैं. प्रयास किए जाएंगे कि जैल की संख्या के रूप में के रूप में कई अपकेंद्रित्र ट्यूबों में है, जिसके परिणामस्वरूप एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में 1.5 x 10 6 कोशिकाओं रखो.
- 7 मिनट के लिए 350 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 50 μl थ्रोम्बिन में कोशिकाओं Resuspend. इस निलंबन को नीले फ्लोरोसेंट पॉलीस्टीरिन microspheres की 4 μl जोड़ें. एक शीशी में फाइब्रिनोजेन के 50 μl रखो. कोशिकाओं के साथ 50 μl थ्रोम्बिन को लेने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें. 100 μl विंदुक की मात्रा बढ़ाएँ. थ्रोम्बिन के 50 μl समाधान के साथ पिपेटफाइब्रिनोजेन साथ शीशी में कोशिकाओं थ्रोम्बिन और फाइब्रिनोजेन मिश्रण है, और 100 μl मिश्रण हाथ में ले लिया.
- में और वेल्क्रो पट्टियों के बीच में जेल मिश्रण पिपेट. आतंच जैल के लिए ठेठ जमाना समय, एक बार घटकों मिश्रित कर रहे हैं, 20 सेकंड के आदेश की है.
- एसीए के साथ संस्कृति टीएम जोड़ने से पहले जमाना अनुमति देने के लिए एक humidified 95% हवा / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए निलंबन सेते.
- पहले 7 दिनों के लिए एसीए 2-3 दिनों हर साथ टीएम बदलें. एक सप्ताह एसीए के बिना सभ्य होना करने के बाद जैल काफी स्थिर रहे हैं. पहले सप्ताह के बाद हर 2-3 दिनों टीएम जगह. प्रति अच्छी तरह टीएम के 6 मिलीलीटर जोड़ें. दिन में 12 कोशिकाओं के दृश्य के लिए पर्याप्त कोलेजन का उत्पादन किया है.
- स्टेटिक तनाव सेल कर्षण और संघनन 12 के कारण सीधे कोशिकाओं द्वारा लागू की गई है. कोलेजन पुनर्गठन को उत्पन्न करने के लिए, ऊतक एक दिशा में दो वेल्क्रो स्ट्रिप्स से ढीला निर्माण में कटौती. यूनिडायरेक्शनल बाधाओं (चित्रा 1 ए) में यह परिणाम है. निर्माण तो स्थिर पर्याप्त है और कोलेजन जमा किया गया है, के बाद से 12 दिन पर यह प्रदर्शन.
- Flexcell FX4000T प्रणाली के उपयोग के साथ, लचीला झिल्ली के साथ संस्कृति प्लेटों के नीचे करने के लिए एक वैक्यूम लगाने से चक्रीय तनाव लागू करें. लोड हो रहा है पदों के ऊपर (जो वें का एक हिस्सा हैं, पर एक baseplate पर प्लेटें प्लेसई चक्रीय लोड डिवाइस). पंप झिल्ली पर एक निर्वात लागू होता है और इस तरह के नीचे झूठ बोल आयताकार पद पर झिल्ली खींचती है. ऊतक के पार आकार अनुलग्नकों के कारण झिल्ली (वेल्क्रो) के माध्यम से constructs और आयताकार पोस्ट लागू चक्रीय तनाव (चित्रा 1 बी) एक अक्षीय है.
- प्रारंभ में, चक्रीय तनाव के आवेदन के दिन 6 पर शुरू करने से पहले, प्रारंभिक यांत्रिक अखंडता को प्राप्त करने के लिए 5 दिनों के लिए स्थिर संस्कृति का उपयोग करें. वैक्यूम पंप के लिए नियंत्रक में कार्यक्रम एक चक्रीय दाग प्रोटोकॉल. उदाहरण के लिए एक अक्षीय दिशा 13 के साथ, एक पहले से स्थापित विरामी चक्रीय तनाव प्रोटोकॉल का उपयोग करें. इस 3 घंटा आराम समय के साथ alternated 3 घंटे की अवधि के लिए 0 से 5% तनाव के लिए दबाव 1 हर्ट्ज के साथ एक साइन लहर, के एक आंतरायिक तनाव के होते हैं. एक गठबंधन कोलेजन संगठन उत्प्रेरण, 7 दिनों के लिए यह चक्रीय तनाव प्रोटोकॉल प्रदर्शन करना.
- आम तौर पर 12 दिनों के बाद HVSCs एक गठबंधन कोलेजन organizatio का उत्पादन किया हैएन. एक गठबंधन कोलेजन संगठन पर पहुंच गया है, के बाद मूल तनाव दिशा को सीधा करने के लिए, एक अक्षीय चक्रीय तनाव दिशा बदलते हैं. 90 डिग्री से आयताकार पदों बदल कर यह मत करो.
- सेल व्यवहार्यता या कोलेजन गठन के साथ हस्तक्षेप नहीं करते कि जांच के साथ सक्रिय, वास्तविक समय कोलेजन remodeling, लेबल नमूने कल्पना करने के लिए. Fluorescently सेल cytoplasm और कोलेजन दाग जांच का प्रयोग करें.
- लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग वैकल्पिक रूप से दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी के 780 एनएम और 500-550 एनएम के बीच का पता लगाने में उत्तेजना के साथ autofluorescence 14 का उपयोग कर कोलेजन संरचनाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 3 घंटा बाकी अवधि के दौरान cyclically तनावपूर्ण नमूने लिए, सेटअप और इनक्यूबेटर से संस्कृति प्लेटों निकालें, और कोशिकाओं और कोलेजन कल्पना करने के लिए एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के लिए उन्हें परिवहन.
नोट: केवल वेल्क्रो के नरम पक्ष का उपयोग करें और यह ऊपर की ओर का सामना. जब gluing, वेल्क्रो, केवल सिलिकॉन गोंद के साथ वेल्क्रो कवर, अच्छी तरह से भर गोंद फैल नहीं है. संस्कृति प्लेटों सिलिकॉन झिल्ली के नीचे है, थाली करने में आसान चिपकाने सुनिश्चित करने के लिए, लचीला झिल्ली को मजबूत करने के लिए अच्छी तरह से थाली के नीचे कुछ का उपयोग करें.
नोट: बहुत ज्यादा फोम बनने से रोकने के लिए धीरे फाइब्रिनोजेन मिश्रण को भंग करने के लिए.
नोट: बर्फ पर संग्रहण थ्रोम्बिन और फाइब्रिनोजेन का जल्दी जमाना रोकने की जरूरत है.
नोट: फ्लोरोसेंट पॉलीस्टीरिन microspheres छवि विश्लेषण के लिए आंतरिक संदर्भ मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है. मिश्रण थ्रोम्बिन और फाइब्रिनोजेन, ध्यान से मिश्रण pipetting द्वारा हवाई बुलबुले के गठन को रोकने है. एयर बुलबुले आतंच जेल में छेद में परिणाम होगा.
नोट: मिश्रण अच्छी तरह से थाली में pipetted है पहले जमाना रोकने के लिए जल्दी से जल्दी यह मत करो. कोशिकाओं और मोती का उपयोग करने से पहले अभ्यास करें.
3. तनाव और बाधाओं में लागू करने से तनाव और उत्प्रेरण परिवर्तन
4. Visualizing कोशिकाओं और कोलेजन
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Representative Results
इस मॉडल प्रणाली संवर्धन myofibroblast वरीयता प्राप्त आतंच जैल के लिए अनुमति देता है. चित्रा 1 ए स्थिर द्विअक्षीय बाधाओं के तहत पहली सुसंस्कृत एक ऊतक से पता चलता है. ऊतक बाधाओं अक्षीय स्थिर बाधाओं बनाने के लिए, दो बाधाओं से आतंच जेल काटने के द्वारा जारी की है, और ऊतक काम्पैक्ट और बाद में remodels (चित्रा 1 ए) कर रहे हैं. चक्रीय तनाव के लिए, ऊतक के रूप में अच्छी तरह से स्थिर द्विअक्षीय बाधाओं के तहत सुसंस्कृत है. 5 दिनों के बाद चक्रीय अक्षीय तनाव (चित्रा 1 बी) लागू किया जा सकता है. कोलेजन पुनरभिविन्यास को उत्पन्न करने के लिए, एक अक्षीय तनाव दिशा सीधा दिशा (चित्रा 1 बी) को बदला जा सकता है. जेल मिश्रण के साथ microspheres वरीयता प्राप्त, (चित्रा 2) समय चूक इमेजिंग के लिए पूर्वनिर्धारित स्थानों पर स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो एक यादृच्छिक पैटर्न, प्रदर्शित करते हैं. आंकड़े 2A और 2C कोशिकाओं, कोलेजन और मोतियों की एक छवि दिखा. ये वही छवियों 3 दिन (Figur स्कैन कर रहे हैंई 2 बी) तथा बाद में 2 दिन (चित्रा 2 डी),. कोशिकाओं और कोलेजन पैटर्न बदल दिया है, लेकिन मनका पैटर्न कोशिकाओं और कोलेजन स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया जाता है. Confocal माइक्रोस्कोपी (आंकड़े 3 और 4) के साथ देखे जा करने के लिए पर्याप्त मात्रा में अंतर्जात कोलेजन उत्पादन में 12 दिनों के परिणाम के लिए संवर्धन नमूने. द्विअक्षीय स्थिर संस्कृति एक गठबंधन कोलेजन संरचना (आंकड़े -4 ए और बी) में एक biaxially विवश ऊतक परिणाम के लिए लागू एक यादृच्छिक कोलेजन संगठन (चित्रा 3) और एक अक्षीय चक्रीय तनाव को जन्म देता है, जहां अलग अलग कोलेजन संगठन में स्थिर या चक्रीय संस्कृति परिणामों का उपयोग . स्थैतिक बाधाओं को बदलने या चक्रीय तनाव दिशा बदल रहा है, जबकि यह कोलेजन संगठन, समय के साथ अध्ययन किया जा सकता है. स्थैतिक बाधाओं एक यादृच्छिक अभिविन्यास (चित्रा 3 से द्विअक्षीय से अक्षीय, कोलेजन उन्मुखीकरण परिवर्तन करने के लिए बदल रहे हैं) एक गठबंधन अभिविन्यास (3B चित्रा) के लिए. चक्रीय तनाव ऊतक (आंकड़े -4 ए और सी) की सतह पर उन्मुखीकरण के एक बदलाव लाती है, लेकिन 3 दिन के बाद, ऊतक के मूल में कोई परिवर्तन (आंकड़े 4 बी और डी) मनाया जाता है.
चित्रा 1. निर्माणों (ए) एक ही दिशा में स्थिर बाधाओं को रिहा द्वारा कोलेजन पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया द्विअक्षीय बाधाओं, के तहत सुसंस्कृत, या (बी) चक्रीय तनाव दिशा बदल रहा है. लोड हो रहा है पदों बिंदीदार काले लाइनों द्वारा संकेत कर रहे हैं के द्वारा. स्केल सलाखों 3 मिमी से संकेत मिलता है.
चित्रा 2. स्थैतिक रूप में इस मामले में, 3 डी में पूर्वनिर्धारित स्थानों पर स्थानांतरित करने के लिए मनका पैटर्न के उपयोग की विशिष्ट उदाहरणसुसंस्कृत नमूने. प्रकोष्ठों लाल, हरे और नीले रंग के मोतियों में कोलेजन में दिखाए जाते हैं. ए और सी कोशिकाओं, कोलेजन और मोतियों की एक छवि दिखा. इन छवियों को क्रमश: 3 दिन (बी) और 2 दिन (डी) बाद में स्कैन कर रहे हैं. मनका पैटर्न कोशिकाओं और कोलेजन स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया जाता है. स्केल बार 50 माइक्रोन इंगित करता है.
द्विअक्षीय बाधाओं (ए) और 7 दिनों के भीतर एक अक्षीय की कमी के कारण पुनरभिविन्यास के साथ 12 दिन स्थिर तनाव का आंकड़ा 3. आर epresentative छवियों (बी). स्केल बार 50 माइक्रोन इंगित करता है.
4 चित्रा. सतह पर चक्रीय तनाव के लिए 12 दिनों के बाद प्रतिनिधि छवियों (7 दिनों चक्रीय तनाव से पीछा स्थिर 5 दिन,) (ए) और ~ ऊतक में 60 माइक्रोन (बी). एक सतह कोशिकाओं और कोलेजन (सी) को नई दिशा में चक्रीय तनाव दिशा (12 दिनों के बाद) में परिवर्तन, लेकिन कोई परिवर्तन के बाद ऊतक (डी) के मूल में देखा जाता है के बाद 3 दिन.
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Discussion
सेल आबादी आतंच निर्माणों की वर्णित मॉडल प्रणाली सेल और कोलेजन के अध्ययन के लिए काफी क्षमता है (फिर) संगठन (डी जोंगे एट अल. 15), ऊतक इंजीनियरिंग प्रयोजनों के लिए प्रयोग की जाने वाली उदा. प्रारंभिक सेल वाहक के रूप में आतंच का उपयोग करके, आतंच गिरावट के बाद, एक ऊतक कोशिकाओं और अंतर्जात मैट्रिक्स ही साथ बनाई गई है. इस तरह, कोशिकाओं सीमा कठोरता 12 संवेदन, या तनाव परिहार प्रदर्शित सिकुड़ा बलों 16,17 लगाने से, प्रकृति में, स्थिर या चक्रीय या तो तनाव के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं.
महत्व: कोलेजन (फिर) संगठन के 18 अध्ययन करने से पहले आतंच निर्माणों इस्तेमाल किया गया है, लेकिन नहीं चक्रीय तनाव और / लागू करने या इस प्रस्तुत पद्धति में संभव हो रहे हैं, जो दोनों के एक समय व्यतीत हो जाने के तरीके, में निर्माणों का अध्ययन करने की क्षमता के साथ. इस मॉडल प्रणाली में बाधाओं प्रदान कि वेल्क्रो स्ट्रिप्स, 19 से पहले इस्तेमाल किया गया हैलेकिन इस तकनीक को लचीला झिल्ली के साथ संस्कृति प्लेटों के साथ संयोजन के समय की लंबी अवधि के लिए चक्रीय तनाव लागू करने के लिए अनुमति देता है. इन प्लेटों में संवर्धन निर्माणों की मध्यम और दृश्य के लिए आसान अलावा और हटाने के लिए अनुमति देता है, अभी भी संलग्न और बाँझ है. यह प्रासंगिक remodeling प्रक्रियाओं वास्तविक समय समय व्यपगत या भी अध्ययन कर सक्षम बनाता है.
संशोधन और भविष्य अनुप्रयोगों: प्रणाली के भविष्य अनुप्रयोगों इंटीग्रिन विधानसभा या संकेत के साथ हस्तक्षेप metalloproteinases या एजेंटों जोड़कर उदाहरण के लिए, 3 डी remodeling प्रक्रिया से छेड़छाड़ में पाया जा सकता है. सेल और कोलेजन (फिर) संगठन का अध्ययन करते समय additives के आवेदन के आगे, मॉडल प्रणाली के घटकों को आसानी से संशोधित किया जा सकता है. अलग सेल स्रोतों, स्वस्थ और रोगग्रस्त कोशिकाओं, कोलेजन मैट्रिक्स (संस्कृति समय अलग से उदाहरण के लिए) की परिपक्वता, और निर्माण की आकृति और आकार विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. प्रणाली अच्छी तरह से की हैबजाय वर्तमान में इस्तेमाल किया HVSCs के अन्य सेल के सूत्रों के uited. हम निरीक्षण, जहां कि ECFCs पूरबी HVSCs से चक्रीय तनाव पर अलग तरीके से अपनी उत्पादन कोलेजन, हम पहले से ही (PlosOne, प्रकाशन के लिए स्वीकार ECFCs) संस्कृति endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं के लिए इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है.
तकनीक की सीमाएं: मौजूदा मॉडल प्रणाली की एक सीमा है 15 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल घनत्व का उपयोग करते समय निर्माण के प्रति 1.5 x 10 6 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, ऊतकों के अपेक्षाकृत बड़े आकार है. यह कम उपलब्ध सेल स्रोतों का उपयोग किया जाएगा मामलों में जहां एक समस्या खड़ी हो सकती है. एक और सीमा (मोटी) वेल्क्रो अनुलग्नकों के कारण है जो निर्माणों (लगभग 1 मिमी), के वर्तमान मोटाई है. इस पूरे नमूना के केवल एक हिस्से को confocal स्कैनिंग की सीमा. यह वर्तमान ऊतकों की कोर भीतर सेलुलर प्रतिक्रियाओं कल्पना करने के लिए पर्याप्त है जो ऊतकों में अधिकतम 200 मीटर की गहराई तक पहुंचने के लिए संभव है, लेकिन करनातों एक पूर्ण मोटाई सिंहावलोकन में परिणाम नहीं.
कदम क्रिटिकल और समस्या निवारण: मॉडल प्रणाली वेल्क्रो लगाव अंक के बीच ऊतक के गठन पर आधारित है, यह भी प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं. सही काटने और gluing आवश्यक है और विशेष ध्यान चक्रीय तनाव को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है जो ऊतकों के समुचित लगाव के लिए वेल्क्रो स्ट्रिप्स में जेल मिश्रण से सावधान pipetting के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. इसके अलावा निर्धारक कदम सेल स्रोत और मध्यम additives के चुनाव में पाया जा सकता है. जब एक अलग सेल के स्रोत के साथ संवर्धन अनुकूलन की जरूरत होगी. वर्तमान में, निर्माणों अपमानजनक से आतंच को रोकने के लिए, 7 दिनों के लिए एसीए के साथ सुसंस्कृत हैं. एक अलग सेल स्रोत भी कोलेजन गठन और आतंच गिरावट दोनों के संबंध में एक अलग समय सीमा में हो सकता है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस अध्ययन जैव चिकित्सा सामग्री (BMM) संस्थान के अनुसंधान कार्यक्रम में प्रदर्शन किया गया था. BMM आर्थिक मामलों, कृषि और अभिनव के डच मंत्रालय द्वारा cofunded है. Nederlandse Hartstichting की वित्तीय योगदान कृतज्ञता से स्वीकार किया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
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