Summary
Bu model sistem bir tahribatsız şekilde endojen kolajen (yeniden) organizasyonu gerçek zamanlı çalışma için kullanılabilecek bir miyofibroblast nüfuslu fibrin jel başlar. Bu model sistemi, farklı hücre kaynakları, orta katkı maddeleri ile birlikte kullanılabilir gibi çok ayarlanabilir, ve özel ihtiyaçlarına göre kolay bir şekilde adapte edilebilir.
Abstract
Kolajen içerik ve kollajen doku gelişmekte olan organizasyon lokal doku suşları ve doku kısıtlaması tarafından etkilenebilir. Doku mühendisleri önceden tanımlanmış kollajen mimarileri ile dokuları oluşturmak için bu ilkeleri kullanmayı hedefliyoruz. Son mimari dokusu kontrol etmek için kollajen yeniden tam yatan süreçlerin tam bir anlayış, ancak eksik olduğunu. Özellikle, küçük bir doku mekanik yükleme koşullarındaki değişikliklere yanıt olarak kollajen liflerinin (yeniden) yönlendirme hakkında bilinmektedir. Biz daha kollajen aydınlatmak için, iki taraflı-kısıtlı miyofibroblast numaralı seribaşı fibrin yapıları oluşan, in vitro model sistem bir geliştirilen i yanıt olarak (yeniden) yönlendirme) tek eksenli statik yükleme koşulları ve ii iki eksenli geri alma) Çift yönlü-kısıtlı siklik tek eksenli yükleme Flexcell FX4000T yükleme cihazı kullanımı ile, yön değişikliği yükleme öncesi ve sonrası yapıları. Time-lapse konfokal görüntüleme vi için kullanılırbir tahribatsız şekilde kolajen (yeniden) yönlendirme sualize.
Yapıları hücre ve kollajen organizasyon gerçek zamanlı olarak görüntülenmiştir olabilir, ve bir iç referans sistemi bize zaman atlamalı analizi için hücreleri ve kollajen yapı taşınmaya sağlar. Model sisteminin çeşitli yönleri hücre kaynağı ya da sağlıklı ve hastalıklı hücrelerin kullanımı gibi, ayarlanabilir. Katkı maddeleri örneğin MMP ekleyerek veya integrinler tarafından bloke edilmesi için, daha altta yatan mekanizmalar kollajen yeniden aydınlatmak için kullanılabilir. Bu yapı şekli ve büyüklüğü kolayca hücresi ve kollajen (yeniden) organizasyonu incelemek için bir çok ayarlanabilir modeli sistemi ile sonuçlanan, özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir.
Introduction
Kardiyovasküler dokular önemli bir taşıyıcı fonksiyonu var. Hücre dışı matriks kollajen liflerinin belirli bir içerik ve organizasyonda yük taşıyan özellikleri katkı ve genel doku gücü 1 hakim. Doku mühendisliği yapı mekanik klima kullanılır - genellikle (döngüsel) süzme rejimlerinin oluşan - doku organizasyonu ve mekanik özellikleri 2,3 artırmak için. Önceden tanımlanmış kollajen mimarisi ile doku oluşturmak için karmaşık doku geometrilerde gerginlik kaynaklı kollajen organizasyonu tam bir anlayış henüz elde edilmiştir değil. Bu gelişmekte olan dokularda kollajen yeniden bizim sınırlı bilgi kaynaklanmaktadır. Mevcut modeller ağırlıklı olarak statik zorlanma 4-6 kullanımı ile kollajen yeniden nihai net sonucu hakkında bilgi vermek. Burada etkisi altında, 3D, gerçek zamanlı bir şekilde kolajen (yeniden) örgütün çalışma sağlayan son derece ayarlanabilir model sistem sağlarStatik veya siklik suşunun. Doku yapıları yapı tüm kollajen endojen sağlamak, fibrin tabanlı. Yapıları hücre ve kollajen organizasyon görüntülenmiştir ve bir iç referans sistemi bize zaman atlamalı analizi için hücreleri ve kollajen yapı taşınmaya sağlar. Bu hücreler dayalı olarak gelişmiş hücre dışı matriks üretim ve mühendislik kardiyovasküler dokularda 7 matris ve kurulan kullanım bozulmasina yeteneği, tanınırlar beri bu protokolde, İnsan Vena Saphena Hücreleri (HVSCs) için model sisteminin kullanımı anlatacağım de Jonge ve ark. 8 çalışmalarına
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İnsan Vena Saphena Hücreleri Kültür
- Schnell ve arkadaşları tarafından protokole göre ikincil kullanım malzeme kurallarına uygun olarak bir donörden alınan vena safena magna,,. 9 hücreleri izole ve sıvı azot içinde bu saklayın. Altı plaka kültürüne 2 x 2 mm bir donör kesim parçalardan vena safena magna kısmından. Başına iyi 2 adet kullanın. Genel olarak yeterli hücreleri, sıvı nitrojen içinde 0.25 x 10 6 hücre ile yaklaşık 3 şişeleri doldurmak için elde edilebilir. HVSCs vimentin, desmin hiçbir ifade ve α düz kas aktini 10 ifade bir alt ifade göstererek, miyofibroblastlar olarak karakterize edilirler. Sonraki hücrelerinin sayısını arttırmak için sıvı azottan hücreleri çözülme için protokol başlar.
- T75 doku kültürü şişesi içine bir tüpten hücreleri yer ve İleri DMEM, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), 5 ml penisilin / oluşan büyüme ortamı (GM), eklemestreptomisin ve 5 ml L-glutamax. 2-3 günde bir orta değiştirin.
- Hücreler yaklaşık 14 gün sonra birleşik büyür. Store 0,5 sıvı azot içinde bir cam şişe içinde x 10 6 hücre, geçit 1 olarak adlandırılır.
Not: Hücrelerin dondurularak HVSCs hasat zaman gerekli değildir, fakat sadece depolama için kullanılır.
- Bir T175 doku kültürü şişesi içine bir tüpten HVSCs yerleştirin ve GM ekleyin. 2-3 günde bir orta değiştirin. Hücreler yaklaşık 7 gün sonra birleşik büyür. Mağaza 3 ve sıvı azot içinde bir cam şişe içinde x 10 6 hücre, geçit 2 olarak anılacaktır.
- Bir rollerbottle içine bir tüpten hücreleri yer ve GM ekleyin. 2-3 günde bir orta değiştirin. Hücreler, yaklaşık 8 gün sonra konfluent büyür. Bir rollerbottle yaklaşık 20-30 x 10 6 hücre içerir. Geçit 6 Kültür hücreleri. Hücre fenotip değişebilir, çünkü geçit 9 daha yüksek bir geçiş hücreleri kullanmayın. 2. Fibrin tabanlı Doku Yapıları Mühendislik
- Sertleştirici (10:1) ile elastomer karıştırılarak silikon yapıştırıcı hazırlayın. Velcro 7 x 3 mm dikdörtgen parçaları kesin. Bir çapraz oluşturmak için, ve cırt bant arasında 3 mm kare boşluk bırakmak esnek membran ile 6 kuyu kültür plaka içine tutkal Velcro,.
- Tutkalın sertleştirme sağlamak için 60 ° C'de bir fırın içerisinde gece boyunca silikon yapıştırıcı kurutun. 30 dakika boyunca inkübe kuyular ve% 70 EtOH eklenerek sterilize edin. PBS ile 3x durulayın ve wel tüm PBS kaldırmakls ve Velcro. 30 dakika UV altına ve kullanılıncaya kadar steril tutmak.
- Doku mühendisliği GM oluşan orta (TM) ve L-askorbik asit 2-fosfat ve 130 mg hazırlayın.
- TM, 1 mg / ml 'ε-amino kaproik asit (ACA) ekleyin. ACA kırıcı 11 fibrin önlemek için kültürün ilk 7 gün için kullanılır. Alternatif olarak, aprotinin kullanılabilir.
- Yığın oluşumunu önlemek için, fibrinojen açmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Kümeleri fibrinojen olmadan daha kolay eriyecektir. ACA ile takviye edilmiş 10 mg gerçek protein / ml TM 7 arasında bir konsantrasyona fibrinojen çözülür. Steril filtre fibrinojen çözüm, birden çok filtre gerekebilir. Kullanılana kadar buz üzerinde muhafaza edin.
- ACA ile takviye edilmiş 10 IU / ml 'TM 7 arasında bir konsantrasyona trombin çözülür. Kullanılana kadar buz üzerinde muhafaza edin. </ Ol>
- GM ve sayısında tekrar süspansiyon hücreleri, Trypsinize.
- , Fibrin tabanlı doku yapıları (doku mühendisliği kalp kapakçıkları 7 metotlara göre konsantrasyon) tohum için 15 x 10 6 hücre / ml 'kullanın. Tek bir jel 100 ul GOF El ve böylece 1.5 x 10 6 hücre oluşur. Yapılacaktır jellerin sayısı kadar santrifüj tüpleri ile sonuçlanan bir santrifüj tüpü içinde 1.5 x 10 6 hücre koyun.
- 7 dakika 350 x g'de hücreleri Santrifüj ve süpernatant atın. 50 ul trombin hücrelerin tekrar süspansiyon. Bu süspansiyon mavi floresan polistiren mikro 4 ul ekleyin. Bir şişe içinde, fibrinojen 50 ul koyun. Hücreleri ile 50 ul trombin almak için bir pipet kullanın. 100 ul pipet hacmi artırın. Trombin çözeltisi ile 50 ul Pipetfibrinojen ile şişenin içine hücreleri trombin ve fibrinojen karıştırın ve 100 ul karışımı almak.
- Içine ve Velcro şeritleri arasında jel karışımı pipetle. Fibrin jel için tipik jelleşme süresi, bir kez bileşenler karıştırılır, 20 sn 'dir.
- ACA ile kültür TM eklemeden önce jelleşme izin vermek için, nemlendirilmiş bir% 95 hava /% 5 CO2 kuluçka makinesinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe süspansiyonlar.
- Ilk 7 gün ACA 2-3 gün her ile TM değiştirin. Bir hafta ACA olmadan kültive edilecek sonra jeller yeterince stabildir. İlk haftadan sonra 2-3 günde TM değiştirin. Başına iyi TM 6 ml ekleyin. Günde 12 hücreleri görünüm için yeterli kolajen doğurmuştur.
- Statik yük hücresi çekiş ve sıkıştırma 12 nedeniyle, doğrudan hücre tarafından uygulanır. Kollajen yeniden ikna etmek için, doku tek yönde iki cırt bant gevşek inşa kesti. Tek yönlü kısıtlamaları (Şekil 1A) ile sonuçlanır. Yapı daha sonra istikrarlı yeterli ve kollajen tevdi beri, 12. günde bu gerçekleştirin.
- Flexcell FX4000T sisteminin kullanımı ile, esnek bir membran ile kültür plakalarının altına bir vakum uygulanarak siklik gerilme uygulanır. Yükleme mesajların üst (ki inci bir parçası olan üzerinde, bir kaide üzerine tabak koyunE döngüsel yükleme cihazı). Pompa, membran üzerine bir vakum uygulanır ve böylece altında yatan dikdörtgen sonrası üzerinde membran çeker. Doku haç biçimli ekleri olarak, membranın (Velcro ile) oluşturur ve dikdörtgen sonrası uygulanan siklik suşu (Şekil 1B) tek eksenli.
- Başlangıçta, döngüsel gerginlik uygulama gün 6 başlamadan önce, ilk mekanik bütünlük elde etmek için 5 gün boyunca statik kültür kullanın. Vakum pompası için kumanda içine programı döngüsel bir leke protokolü. Örneğin tek eksenli yön 13 ile, daha önce kurulmuş aralıklı döngüsel gerginlik protokolünü kullanır. Bu, 3 saat dinlenme süreleri ile dönüşümlü olarak 3 saat dönemleri boyunca 0 dan% 5 suşu için süzme 1 Hz ile bir sinüs dalgası, bir aralıklı gerginlik oluşur. Bir uyumlu kollajen organizasyon uyararak, 7 gün boyunca bu döngüsel gerginlik protokol yapın.
- Tipik olarak 12 gün sonra, bir HVSCs hizalanmış kolajen organ ürettilern. Hizalanmış bir kolajen kuruluş ulaşıldıktan sonra, orijinal gerilme yönüne dik olduğu, tek eksenli siklik suşu yönünü değiştirmek. 90 ° dikdörtgen mesajları çevirerek yapın.
- Hücre canlılığı veya kollajen oluşumu ile karışmaz probları ile aktif, gerçek zamanlı kollajen yeniden, etiket örnekleri görselleştirmek için. Floresan hücre sitoplazma ve kollajen leke prob kullanın.
- Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak Alternatif olarak ikinci harmonik üretimi 780 nm ve 500-550 nm arasında algılama de uyarma ile otofloresansı 14, kullanarak kollajen yapıları görselleştirmek için kullanılabilir.
- 3 saat dinlenme süresi boyunca periyodik olarak gergin örnekler için, kurulum ve inkübatör kültür plakaları çıkarın ve hücreleri ve kollajen görselleştirmek için bir konfokal lazer tarama mikroskobu taşırlar.
Notlar: Sadece Velcro yumuşak tarafı kullanın ve bu yan yukarı yüz. Ne zaman yapıştırma Velcro, sadece silikon yapıştırıcı ile Velcro kapağı, iyi boyunca tutkal yayılmış yok. Kültür plakaları silikon membran dipleri olduğundan, plaka için kolay yapıştırma sağlamak için, esnek zarlar takviye için plaka altında bir şey kullanın.
Not: Çok fazla köpük oluşumunu önlemek için yavaşça fibrinojen karışımı çözülür için.
Not: Buz Depolama trombin ve fibrinojen erken jelleşme önlemek için gereklidir.
Not: floresan polistiren mikro görüntü analizi için dahili referans işaretleri kullanılmaktadır. Karıştırma trombin ve fibrinojen, dikkatli bir karışım, pipetleme hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek zaman. Hava kabarcıkları, fibrin jel delik neden olur.
Notlar: karışım plaka pipetle önce jelleşme önlemek için mümkün olduğunca çabuk yapın. Hücreleri ve boncuklar kullanmadan önce uygulama.
3. Gerilme ve Kısıtlamalar içinde uygulamak Gerilme ve indükleyen değişiklikler
4. Görselleştirme Hücreler ve Kollajen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu model sistem kültür miyofibroblast numaralı seribaşı fibrin jeller için izin verir. Şekil 1A statik iki eksenli kısıtlar altında ilk kültüre bir doku gösterir. Doku kısıtlamaları tek eksenli statik kısıtlamaları oluşturmak için, iki kısıtlamaları fibrin jel kesim tarafından yayımlanan ve doku kompakt ve daha sonra remodels (Şekil 1A) vardır. Siklik bir suş için, doku hem de statik eksenli kısıtlamalar altında kültürlenir. 5 gün sonra, siklik tek eksenli gerilme (Şekil 1B) uygulanabilir. Kollajen yeniden yönlendirilmesi ikna etmek için, tek eksenli gerilme yönü dik yönde (Şekil 1B) için değiştirilebilir. Jel karışımı ile mikroküreler numaralı seribaşı, (Şekil 2) zaman atlamalı görüntüleme için önceden tanımlanmış yerlerde yerini değiştirmek için kullanılan bir rasgele bir desen, görüntülemek. Şekil 2A ve 2C hücreleri, kollajen ve boncuk bir görüntü gösterir. Bu aynı görüntüleri 3 gün (Figür taranıre 2B) ve sırasıyla 2 gün sonra (Şekil 2B). Hücreler ve kollajen desenler değişmiştir fakat boncuk desen hücreleri ve kollajen yeniden konumlandırmak için kullanılır. Konfokal mikroskopi (Şekiller 3 ve 4) ile görüntülenebilmektedir için yeterli miktarda endojen kollajen üretimini içinde 12 gün süre ile kültüre örnekleri. Iki eksenli statik kültür bir uyumlu kollajen yapısı (Şekil 4A ve B) bir çift eksenli kısıtlı doku sonuçlarına uygulanan rasgele bir kollajen organizasyonu (Şekil 3A) ve tek eksenli döngüsel gerginlik neden olur belirgin farklı kollajen organizasyon, statik ya da döngüsel kültür sonuçları kullanarak . Statik kısıtlamaları değiştirme veya döngüsel gerginlik yönünü değiştirirken Bu kollajen örgüt, zaman içinde incelenebilir. Statik kısıtlamaları rastgele bir yönelim (Şekil 3A gelen iki eksenli gelen tek eksenli, kollajen yönlendirme değişikliklere değiştirildiğinde) Bir hizalanmış oryantasyon (Şekil 3B) için. Siklik suşu doku (Şekil 4A ve C) yüzeyinde oryantasyon değişikliği indükler, ama 3 gün sonra, doku çekirdeği herhangi bir değişiklik (Şekiller 4B ve D) görülmektedir.
Şekil 1. Yapıları (A) bir yönde statik kısıtlamaları bırakarak kollajen yeniden düzenlemek için kullanılan iki eksenli kısıtlamalar altında kültüre, ya da (B) döngüsel gerginlik yön değiştirme. Yükleniyor mesajları noktalı siyah çizgiler ile gösterilir tarafından. Ölçek çubukları 3 mm göstermektedir.
Şekil 2. Statik olarak, bu durumda, 3 boyutlu önceden tanımlanmış yerlerde taşınmaya boncuk desen kullanımı tipik bir örneğiKültür örnekleri. hücreler kırmızı, yeşil ve mavi boncuk kolajen gösterilmiştir., A ve C hücreleri, kollajen ve boncuk bir görüntü gösterir. Bu görüntüler, sırasıyla, 3 gün (B) ve 2 gün (B) daha sonra taranır. Boncuk desen hücreleri ve kollajen yeniden konumlandırmak için kullanılır. Ölçek çubuğu 50 mikron gösterir.
Iki eksenli kısıtlamaları (A) ve 7 gün içinde tek eksenli kısıtlamaları nedeniyle yeniden yönlendirilmesi ile 12 gün statik gerilme Şekil 3. R epresentative görüntüleri (B). Ölçek çubuğu 50 um gösterir.
Şekil 4. Yüzeyde siklik suşu boyunca 12 gün sonra Örnek görüntü (7 gün siklik suşu takiben statik 5 gün), (A) Ve ~ dokuya 60 um (B). Bir yüzey hücreleri ve kollajen (C) yeniden yönlendirme de siklik gerilme yönü (12 gün sonra), değişikliği ancak değişiklik sonra doku (D) çekirdek görülür sonra 3 gün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre kalabalık fibrin yapıların tarif model sistem hücre ve kollajen çalışma için büyük bir potansiyele sahiptir (yeniden) organizasyonu (de Jonge ve ark. 15), doku mühendisliği amaçlar için de kullanılabilir örneğin. Ilk hücre taşıyıcı olarak fibrin kullanarak, fibrin bozulduktan sonra, bir doku hücreleri ve endojen matriste ile oluşturulur. Bu şekilde, hücre sınır sertlik 12 algılama veya gerginlik kaçınma gösteren, kasılma güçleri 16,17 uygulayarak, doğada, statik veya döngüsel ya zorlanma tepki uyarılır.
Önemi: kolajen (yeniden) organizasyonu 18 çalışma önce Fibrin yapıları kullanılmıştır, ancak döngüsel gerginlik ve / veya uygulamak veya bu sunulan yöntemde olası her ikisi de bir zaman atlamalı bir şekilde, yapıları okuyan yeteneği ile. Bu model sistemde bilgiler sağlayan Velcro şeritleri, 19 daha önce kullanılmışama bu teknik esnek membran ile kültür plakaları ile birleştirerek uzun süre için döngüsel gerginlik uygulamak sağlar. Bu plakalarda kültür yapıları orta ve görselleştirme kolay eklenmesi ve çıkarılması için izin verir hala ekli ve steril ise. Bu, ilgili yeniden süreçleri gerçek zamanlı zaman süresi geçmiş ya da eğitim sağlar.
Değişiklikler ve gelecekteki uygulamalar: Sistemin Geleceği uygulamaları integrin montaj veya sinyal müdahale metaloproteinazlar veya acenteleri ekleyerek örneğin, 3D yeniden süreci manipüle bulunabilir. Hücre ve kollajen (yeniden) organizasyonu eğitim sırasında katkı maddelerinin uygulama yanında, model sisteminin bileşenleri kolayca değiştirilebilir. Farklı hücre kaynakları, sağlıklı ve hastalıklı hücreler kolajen matrisi (kültürünün zaman içinde değişen göre) olgunluğu, ve yapının şekli ve boyutu özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir. Sistemi iyi sBunun yerine, halen kullanılmakta olan HVSCs bölgesinin diğer hücre kaynakları için uited. Biz gözlemlemek burada, bu ECFCs yönlendirmek HVSCs daha döngüsel gerginlik üzerine farklı onların üretilen kolajen, biz zaten (PlosOne, yayına kabul ECFCs) kültür endotel koloni oluşturan hücreler için bu sistemi kullandık.
Bu tekniğin sınırlamaları: Mevcut model sistem bir sınırlaması, 15 x 10 6 hücre / ml 'lik bir hücre yoğunluğuna kullanılıyorsa yapı başına 1.5 x 10 6 hücre gerektiren, dokularda nispeten büyük boyutudur. Bu daha az kullanılabilir hücre kaynakları kullanılacak durumda bir sorun teşkil edebilir. Başka bir sınırlama (kalın) Velcro ek parça nedeniyle yapılar (yaklaşık 1 mm), mevcut kalınlığıdır. Bu Numunenin tamamının yalnızca bir bölümüne konfokal tarama sınırlar. Bu, mevcut dokuların çekirdek içinde hücre yanıtları görselleştirmek için yeterli doku, içinde maksimum 200 mikron derinliğe ulaşmak mümkündür, ama yapmakes bir tam kat bakış ile sonuçlanmaz.
Adımları Kritik ve sorun giderme: model sistem Velcro bağlantı noktaları arasında doku oluşumu dayanır, bu da protokolde kritik adımları kapsar. Doğru kesme ve yapıştırma gereklidir ve özel ilgi döngüsel gerginlik uygulamak için çok önemlidir doku, uygun eki için Velcro şeritler halinde jel karışımının dikkatli pipetleme dikkat edilmelidir. Ayrıca belirleyici adımlar hücre kaynağı ve orta katkı seçiminde bulunabilir. Zaman farklı bir hücre kaynağı ile kültür optimizasyon gerekecektir. Şu anda, yapıları aşağılayıcı gelen fibrin durdurmak için, 7 gün boyunca ACA ile kültür. Farklı bir hücre kaynağı, aynı zamanda kollajen oluşumu ve fibrin bozunma hem ile ilgili farklı bir zaman dilimi ile sonuçlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, Biyomedikal Malzemeler (BMM) enstitü araştırma programı uygulandı. BMM Ekonomik işler, Tarım ve İnovasyon Bakanlığı tarafından Hollanda cofunded edilir. Nederlandse Hartstichting mali katkısı minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
