Summary
Denna modell startar från en myofibroblast-befolkade fibringel som kan användas för att studera endogent kollagen (om) organisering realtid på ett icke-förstörande sätt. Modellen systemet är mycket avstämbar, eftersom den kan användas med olika cellkällor, medelstora tillsatser, och kan anpassas lätt till specifika behov.
Abstract
Kollagen innehåll och organisation för att utveckla kollagena vävnader kan påverkas av lokala vävnad stammar och vävnad tvång. Tissue ingenjörer strävar efter att använda dessa principer för att skapa vävnader med fördefinierade kollagen arkitekturer. En fullständig förståelse av de exakta bakomliggande processer kollagen ombyggnad för att styra den sista vävnaden arkitekturen, dock saknas. I synnerhet, är lite känt om det (åter) orientering av kollagenfibrer som svar på förändringar i vävnad mekaniska belastningsförhållanden. Vi utvecklade en in vitro modellsystem, bestående av biaxiellt tvungna myofibroblast-seedade fibrin konstruktioner, för att ytterligare belysa kollagen (re) orientering som svar på i) återgå biaxial för enaxliga statiska belastningsförhållanden och ii) cyklisk enaxlig belastning av biaxiellt begränsas- konstruktioner före och efter en förändring i lastning riktning, med användning av Flexcell FX4000T laddningsanordningen. Time-lapse konfokala avbildning används till visualize kollagen (re) orientering i ett icke-förstörande sätt.
Cell-och kollagen organisation i konstruktionerna kan visualiseras i realtid, samt en intern referens systemet tillåter oss att flytta celler och strukturer kollagen för time-lapse-analys. Olika aspekter av modellsystemet kan justeras, liksom cellkälla eller användning av friska och sjuka celler. Tillsatser kan användas för att ytterligare klarlägga mekanismerna bakom kollagen ombyggnad, exempelvis genom att lägga MMP eller blockering integriner. Form och storlek på konstruktionen kan enkelt anpassas till specifika behov, vilket resulterar i en mycket avstämbara modellsystem för att studera cell-och kollagen (om) organisering.
Introduction
Kardiovaskulära vävnader har en framträdande bärande funktion. Särskilt innehåll och organisation kollagenfibrer i den extracellulära matrisen bidrar till bärande egenskaper och dominera totalt vävnad styrka 1. I tissue engineering mekanisk konditionering av konstruktionen används - oftast bestående av (cykliska) ansträngde regimer - att öka vävnad organisation och mekaniska egenskaper 2,3. Full förståelse av stam-inducerad kollagen organisation i komplexa vävnad geometrier för att skapa vävnader med fördefinierade kollagen arkitektur har ännu inte uppnåtts. Detta beror främst på vår begränsade kunskap om kollagen ombyggnad i utvecklingsländer vävnader. Befintliga modeller ger främst information om den slutliga nettot av kollagen ombyggnad med användning av statisk belastning 4-6. Här ger vi en mycket avstämbara modellsystem som möjliggör studier av kollagen (om) organisering i realtid mode, i 3D, under påverkanav statisk eller cyklisk belastning. Vävnaden konstruktionerna är fibrin-baserade, se till att allt kollagenet i konstruktionen är endogen. Cell-och kollagen organisation i konstruktionerna är visualiseras, och ett inre referenssystem tillåter oss att flytta celler och strukturer kollagen för time-lapse-analys. I detta protokoll kommer vi att beskriva användningen av modellen för mänskliga Vena saphena Cells (HVSCs), eftersom dessa celler är kända för deras ökade extracellulära matrix produktion och förmåga att bygga om matrisen och våra etablerade användning i iscensatte kardiovaskulära vävnader 7 baserat, om arbetet i de Jonge et al. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Kultur för mänskliga Vena saphena Cells
- Isolera celler från vena saphena magna, förvärvades från en donator i enlighet med riktlinjer för sekundär användning material, enligt protokollet från Schnell et al. 9 och lagra dessa i flytande kväve. Från den del av vena saphena magna från en bitar donor skuren av 2 x 2 mm till kultur i en sex-brunnar. Använd 2 stycken per brunn. Generellt tillräckligt med celler kan erhållas för att fylla omkring 3 injektionsflaskor med 0,25 x 10 6 celler i flytande kväve. HVSCs karakteriseras som myofibroblasts, genom att visa uttryck av vimentin, inget uttryck för desmin och en delpopulation som uttrycker α glattmuskelaktin 10. Nästa starta protokollet att tina cellerna från det flytande kvävet för att öka antalet av celler.
- Placera celler från en flaska till en T75 vävnadsodling kolv och tillsätt tillväxt medium (GM), som består av Advanced DMEM, 50 ml fetalt bovint serum (FBS), 5 ml penicillin /streptomycin och 5 ml L-glutamax. Byt medium var 2-3 dagar.
- Celler växer sammanflytande efter ungefär 14 dagar. Affär 0,5 x 10 6 celler i en flaska i flytande kväve, kallad passage 1.
Obs: Frysning av cellerna är inte nödvändigt vid skörd HVSCs, men används endast för förvaring.
- Placera HVSCs från en flaska till en T175 vävnadsodlingskolv och tillsätt GM. Byt medium var 2-3 dagar. Celler växer sammanflytande efter ca 7 dagar. Store 3 x 10 6 celler i en ampull i flytande kväve, som kallas passagen 2.
- Placera celler från en flaska till en rollerbottle och tillsätt GM. Byt medium var 2-3 dagar. Celler växer sammanflytande ungefär efter 8 dagar. En rollerbottle innehåller ca 20-30 x 10 6 celler. Kultur celler upp till passagen 6. Använd inte celler av en passage högre än passagen 9, eftersom cellfenotyp kan förändras. 2. Engineering of Fibrin-baserade Tissue Constructs
- Förbered silikonlim genom blandning av elastomeren med härdningsmedlet (10:01). Klipp 7 x 3 mm rektangulära segment av kardborreband. Limma kardborreband i en 6 bra kultur plattan, med flexibla membran för att bilda ett kors, och lämna en kvadrat utrymme på 3 mm mellan kardborrebanden.
- Torka silikonlim över natten i en ugn vid 60 ° C för att säkerställa härdning av limmet. Sterilisera genom tillsats av 70% EtOH till brunnarna och inkubera under 30 min. Skölj 3x med PBS och ta bort all PBS från wells och kardborreband. Sätt under UV under 30 min och hålla sterilt fram till användning.
- Förbered medelhög Tissue Engineering (TM), som består av GM och 130 mg L-askorbinsyra 2-fosfat.
- Tillsätt 1 mg / ml ε-aminokapronsyra (ACA) till TM. ACA används under de första 7 dagarna av kultur för att förhindra fibrin från förnedrande 11. Alternativt kan aprotinin användas.
- För att förhindra att klumpar bildas, tillåta fibrinogen uppnå rumstemperatur innan den öppnas. Utan klumpar fibrinogen kommer att upplösas lättare. Lös fibrinogen till en koncentration av 10 mg faktiska protein / ml TM 7 kompletteras med ACA. Sterilfiltrera fibrinogenlösningen, kanske flera filter behövas. Förvara på is tills det ska användas.
- Lös trombin till en koncentration av 10 IU / ml TM 7 kompletteras med ACA. Förvara på is tills det ska användas. </ Ol>
- Trypsinize cellerna, resuspendera i GM och räkna.
- Använd 15 x 10 6 celler / ml för ympning av fibrin-baserade vävnad konstruktionerna (koncentration baserad på metoder för hjärtvävnad engineering ventilerna 7). En enda gel består av 100 ^ GOF el, och därmed av 1,5 x 10 6 celler. Sätt 1,5 x 10 6 celler i ett centrifugrör, vilket resulterar i så många centrifugrör som antalet geler som kommer att göras.
- Centrifugera cellerna vid 350 x g under 7 min och kassera supernatanten. Resuspendera cellerna i 50 | il trombin. Lägg 4 pl av blåfluorescerande polystyren mikrosfärer till denna suspension. Sätt 50 | il av fibrinogen i en injektionsflaska. Använd en pipett för att ta upp 50 | il trombin med celler. Öka volymen av pipetten till 100 ^. Pipettera 50 | il lösning av trombin medceller i flaskan med fibrinogen att blanda trombin och fibrinogen, och ta upp 100 l blandning.
- Pipettera gelblandningen in i och mellan de kardborrband. Den typiska gelningstid för fibringeler, när komponenterna blandas, är i storleksordningen av 20 sek.
- Inkubera suspensioner för 30 min vid 37 ° C i en fuktig 95% luft / 5% CO2 inkubator för att möjliggöra gelning före tillsats kultur TM med ACA.
- Byt TM med ACA var 2-3 dagar för de första 7 dagarna. Geler är stabila nog efter en vecka som ska odlas utan ACA. Efter den första veckan ersätta TM var 2-3 dagar. Tillsätt 6 ml TM per brunn. På dag 12 celler har producerat tillräckligt med kollagen för visualisering.
- Statisk belastning appliceras av cellerna direkt, på grund av cell dragkraft och packning 12. Att inducera kollagen omorganisation, skära vävnad konstruera loss från två kardborrband i en riktning. Detta resulterar i enkelriktade begränsningar (Figur 1A). Utför detta på dag 12, eftersom konstruktionen är stabil nog och kollagen har deponerats.
- Applicera cyklisk stammen genom att applicera ett vakuum till botten av odlingsplattorna med flexibla membran, med användning av Flexcell FX4000T systemet. Placera plattorna på en bottenplatta, ovanpå lastning inlägg (som är en del av the cyklisk belastningsanordningen). Pumpen applicerar ett vakuum på membranet och därigenom drar membranet över den rektangulära stolpen liggande undertill. På grund av den korsformade bilagor i vävnaden konstruktioner till membranet (via kardborre) och rektangulära stolpen den tillämpade cykliska stammen är enaxlig (Figur 1B).
- Initialt använder statisk odling under fem dagar för att uppnå initial mekanisk integritet, före applicering av cyklisk belastning början på dag 6. Programmera en cyklisk fläck protokoll i regulatorn för vakuumpump. Till exempel använder en tidigare etablerad intermittent protokoll cyklisk belastning, med enaxlig riktning 13. Denna består av en intermittent stam av en sinusvåg med en Hz, sila från 0 till 5% töjning, i perioder om 3 tim, omväxlande med 3 tim viloperioder. Utför denna cykliska påfrestningar protokoll för 7 dagar, inducera en linje kollagen organisation.
- Vanligtvis efter 12 dagar HVSCs har producerat en linje kollagen organization. Efter en inriktad kollagen organisation nås, ändrar enaxlig riktning cyklisk-stam, att vara vinkelrät mot den ursprungliga stammen riktning. Gör detta genom att vrida de rektangulära inlägg av 90 °.
- Att visualisera aktiv, realtid kollagen ombyggnad, etikett prover med prober som inte stör cellernas livskraft eller kollagen bildas. Använd sonder till fluorescerande fläck cellens cytoplasma och kollagen.
- Alternativt kan andra harmoniska generationen använder konfokalmikroskopi laserskanning kan användas för att visualisera kollagen strukturer med hjälp av autofluorescens 14, med excitation vid 780 nm och detektion mellan 500-550 nm.
- Ta odlingsplattoma från installationen och inkubatorn, för cykliskt ansträngda prover under 3 h viloperiod, och transportera dem till en konfokala laserskanning mikroskop för att visualisera celler och kollagen.
Anteckningar: Använd endast den mjuka sidan av kardborrband och möta denna sidan uppåt. Vid limning av kardborreband, bara täcka kardborreband med silikon lim, inte sprids lim över hela väl. Eftersom odlingsplattoma har bottnar silikonmembranet, använd något under brunnar för att förstärka de flexibla membran, för att säkerställa enkel limning in till plattan.
Obs: För att lösa upp fibrinogen blanda försiktigt för att förhindra att för mycket skum bildas.
Obs: Lagring på is behövs för att förhindra tidig gelning av trombin och fibrinogen.
Obs: Den fluorescerande polystyren mikrosfärer används som inre referens markörer för bildanalys. Vid blandning av trombin och fibrinogen, förhindra uppkomsten av luftbubblor genom att försiktigt pipettera blandningen. Luftbubblor kommer att resultera i hål i fibringelen.
Anteckningar: Gör detta så fort som möjligt för att förhindra gelning innan blandning pipetteras i brunnar. Öva innan du använder celler och pärlor.
Tre. Tillämpa stam och Induktion Förändringar i stam och begränsningar
4. Visualisera celler och kollagen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna modell system möjliggör odling myofibroblast-seedade fibringeler. Figur 1A visar en vävnad odlas först under statiska biaxiella begränsningar. Tissue begränsningar frigörs genom att skära fibringelen från två begränsningar, för att skapa enaxliga statiska begränsningar, och komprimerar vävnad och bygger om efteråt (Figur 1A). För cyklisk belastning, är vävnaden odlas under statiska tvåaxiala begränsningar också. Efter 5 dagar cykliska enaxlig belastning kan appliceras (figur 1B). För att inducera kollagen omorientering, kan enaxlig spänningsriktning ändras till den vinkelräta riktningen (Figur 1B). Mikrosfärerna ympades med gelblandningen, visa ett slumpmässigt mönster, som används för att flytta fördefinierade platser för tidsförlopp imaging (Figur 2). Figurerna 2A och 2C visar en bild av celler, kollagen och pärlor. Samma bilder scannas 3 dagar (Figure 2B) och 2 dagar (Figur 2D) senare, respektive. Celler och mönster kollagen har förändrats, men pärla mönster används för att flytta celler och kollagen. Odling prover för 12 dagar resulterar i endogen kollagen produktion i tillräckliga mängder för att visualiseras med konfokalmikroskopi (figur 3 och 4). Med antingen statiska eller cyklisk kultur resulterar i helt olika kollagen organisation där biaxiell statisk odling ger upphov till en slumpmässig kollagen organisation (figur 3A) och enaxlig cyklisk stam applicerades på en biaxiellt begränsade vävnad resulterar i en inriktad kollagen struktur (fig 4A och B) . Denna kollagen organisation kan studeras över tid, när du byter statiska begränsningar eller ändrar den cykliska påfrestningar riktning. När statiska begränsningar ändras från biaxial till enaxlig, kollagen orienteringen ändras från en slumpmässig orientering (Figur 3A) Till en inriktad orientering (figur 3B). Cyklisk belastning inducerar en förändring av orienteringen vid ytan av vävnaden (figur 4A och C), men efter 3 dagar, har inga förändringar i kärnan av vävnaden observerades (figur 4B och D).
Figur 1. Konstruktioner odlas under biaxiella begränsningar, som används för att omorganisera kollagen genom (A) som godkänner statiska begränsningar i en riktning, eller genom (B) ändrar cyklisk spänningsriktning. Loading inlägg anges med prickade svarta linjer. Skalstrecken indikerar 3 mm.
Figur 2. Typiska exempel på användning av pärla mönster att flytta fördefinierade platser i 3D, i detta fall i statisktodlade prover. celler visas i rött, kollagen i grönt och pärlor i blått. A och C visar en bild av celler, kollagen och pärlor. Dessa bilder scannas 3 dagar (B) och 2 dagar (D) senare, respektive. Bead mönster används att flytta celler och kollagen. Skala stapel visar 50 pm.
Figur 3. R epresentative bilder av 12 dagars statisk belastning med biaxiella begränsningar (A) och omorientering grund enaxlade begränsningar inom 7 dagar (B). Skalfält visar 50 pm.
Figur 4. Bilderna är efter 12 dagar (5 dagar statiska, följt av 7 dagar cyklisk belastning) för cyklisk belastning vid ytan (A) Och ~ 60 um in i vävnaden (B). Efter en förändring av cyklisk belastning riktning (efter 12 dagar), på ytan celler och kollagen omorientera (C) men inga förändringar ses i kärnan av vävnaden (D) efter 3 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna modellen system för cell-befolkade fibrin konstruktioner har stor potential för studier av cell-och kollagen (om) organisering (de Jonge et al. 15), t.ex. för att användas för ändamål tissue engineering. Genom att använda fibrin som den ursprungliga cellen transportören, efter fibrinnedbrytningsprodukter, är en vävnad skapad med celler och endogena matrix bara. På detta sätt stimuleras cellerna att reagera på påfrestningar, antingen statisk eller cyklisk till sin natur, genom att tillämpa sammandragande krafter 16,17, avkänning gränsen styvhet 12, eller visa stam undvikande.
Betydelse: Fibrin konstruktioner har använts tidigare för att studera kollagen (om) organisering 18, men inte med förmågan att tillämpa cyklisk belastning och / eller studera konstruktioner i en time-lapse sätt, båda är möjliga i detta presenterade metoden. De kardborrband som ger begränsningar i detta modellsystem har använts före den 19,men kombinera denna teknik med odlingsplattor med flexibla membran gör det möjligt att tillämpa cyklisk belastning under längre tidsperioder. Odling i dessa plattor möjliggör enkel tillsats och avlägsnande av mediet och visualisering av konstruktioner samtidigt fäst och steril. Detta möjliggör att studera relevanta remodeling processer tid förfallit eller ens realtid.
Ändringar och framtida tillämpningar: framtida tillämpningar av systemet kan hittas i att manipulera 3D remodelleringsprocessen, till exempel genom att lägga metalloproteinaser eller medel som stör integrin montering eller signalering. Bredvid tillämpningen av tillsatser, kan komponenterna i modellen systemet enkelt modifieras när man studerar celler och kollagen (om) organisering. Olika cellkällor, friska och sjuka celler, löptid kollagenmatrisen (t.ex. genom att variera kultur tid), och formen och storleken av konstruktionen kan anpassas till specifika behov. Systemet är väl suited för andra cellkällor, i stället för de för närvarande använda HVSCs. Vi har redan använt detta system för att kultur endotelceller kolonibildande celler (ECFCs, PlosOne, accepterad för publicering), där vi observerar att ECFCs inrikta sin producerade kollagen annorlunda vid cyklisk belastning än HVSCs.
Begränsningar av tekniken: En begränsning av den nuvarande modellen systemet är den relativt stora storleken av vävnader, som kräver 1,5 x 10 6 celler per konstruktionen när man använder en cell densitet på 15 x 10 6 celler / ml. Detta kan utgöra ett problem i de fall där mindre tillgängliga cellkällor kommer att användas. En annan begränsning är den aktuella tjockleken av konstruktionerna (ungefär 1 mm), vilket beror på de (tjock) Velcro bilagor. Detta begränsar den konfokala skanning till endast en del av hela provet. Det är möjligt att nå ett djup av max 200 nm i vävnaden, vilket är tillräckligt för att visualisera cellulära svar i kärnan av de nuvarande vävnader, men göres inte resultera i en full tjocklek översikt.
Kritiska steg och felsökning: Eftersom modellen bygger på bildandet av vävnad mellan Velcro fästpunkter, detta omfattar även de kritiska stegen i protokollet. Korrekt kapning och limning är nödvändig och särskild uppmärksamhet bör ägnas noggrann pipettering av gelen blandningen i kardborrebanden för korrekt infästning av vävnaden, vilket är avgörande för tillämpningen av cyklisk belastning. Ytterligare Determinative steg finns i valet av cellkällan och tillsatser mediet. Optimering kommer att behövas vid odling med en annan cell källa. För närvarande är konstruktioner odlade med ACA i 7 dagar, för att stoppa fibrin från nedbrytning. En annan cell källa kan också resultera i en annan tidsram med avseende på både kollagen bildning och fibrin nedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie utfördes i forskningsprogrammet för de biomedicinska material (BMM) Institute. BMM är samfinansierat av det nederländska ekonomiministeriet, jordbruk och innovation. Det ekonomiska bidraget från Nederlandse Hartstichting är tacksamt erkänns.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
