Summary
Questo sistema modello parte da un gel di fibrina myofibroblast popolata che può essere usato per studiare collagene endogeno (ri) organizzazione in tempo reale in modo non distruttivo. Il sistema modello è molto sintonizzabile, in quanto può essere usato con sorgenti cellulari differenti, additivi medie, e può essere facilmente adattato alle esigenze specifiche.
Abstract
Contenuto di collagene e di organizzazione per lo sviluppo di tessuti di collagene possono essere influenzati dai ceppi dei tessuti locali e di vincolo dei tessuti. Ingegneri dei tessuti hanno lo scopo di utilizzare questi principi per creare tessuti con architetture collagene predefiniti. Una piena comprensione delle esatte sottostanti processi di rimodellamento del collagene per controllare l'architettura del tessuto finale, però, è carente. In particolare, si conosce poco l'orientamento (ri) delle fibre di collagene in risposta ai cambiamenti nelle condizioni di carico meccanico del tessuto. Abbiamo sviluppato un sistema modello in vitro, composto da bi-costretti myofibroblast testa di serie fibrina costrutti, per chiarire ulteriormente il collagene (ri) orientamento in risposta ad i), tornando biassiale a condizioni di carico statico monoassiali e ii) ciclica monoassiale carico del bi-vincolato costrutti prima e dopo un cambio di direzione del carico, con l'uso del dispositivo di caricamento Flexcell FX4000T. Time-lapse imaging confocale viene utilizzato a visualize collagene orientamento (ri) in modo non distruttivo.
Organizzazione cellulare e collagene nei costrutti possono essere visualizzati in tempo reale, e di un sistema di riferimento interno ci permette di trasferire le cellule e le strutture di collagene per l'analisi time-lapse. Vari aspetti del sistema modello può essere regolata, come fonte cellulare o l'uso di cellule sane e malate. Additivi possono essere utilizzati per chiarire ulteriormente i meccanismi sottostanti rimodellamento del collagene, per esempio con l'aggiunta di MMPs o blocco integrine. Forma e dimensioni del costrutto possono essere facilmente adattati alle esigenze specifiche, risultante in un sistema modello per lo studio altamente sintonizzabile organizzazione cellulare e collagene (ri).
Introduction
Tessuti cardiovascolari hanno una funzione di primo piano portante. In particolare, i contenuti e l'organizzazione delle fibre di collagene nella matrice extracellulare contribuire alle proprietà portanti e dominare la forza del tessuto complessivo 1. In ingegneria dei tessuti è utilizzato condizionata meccanica del costrutto - costituiti in genere da (ciclico) regimi sforzare - per migliorare l'organizzazione dei tessuti e le proprietà meccaniche 2,3. Piena comprensione di organizzazione collagene deformazione indotta in geometrie complesse dei tessuti per creare tessuti con architettura collagene predefinito non è stato ancora raggiunto. Ciò è dovuto principalmente alla nostra conoscenza limitata del rimodellamento del collagene nei tessuti sviluppo. Modelli esistenti forniscono principalmente informazioni sul risultato netto finale di rimodellamento del collagene con l'utilizzo di sforzo statico 4-6. Qui forniamo un sistema modello altamente sintonizzabile che consente lo studio del collagene (ri) organizzazione in un modo tempo reale, in 3D, sotto influenzadi deformazione statica o ciclico. I costrutti tissutali sono basati fibrina, assicurando che tutta collagene nel costrutto è endogena. Organizzazione cellulare e collagene nei costrutti viene visualizzato, e un sistema di riferimento interno ci permette di trasferire le cellule e le strutture di collagene per l'analisi time-lapse. In questo protocollo verrà descritto l'uso del sistema modello per umani Vena safena Cells (HVSCs), poiché queste cellule sono noti per la loro maggiore produzione di matrice extracellulare e la capacità di rimodellare la matrice e il nostro uso stabilita in ingegnerizzati tessuti cardiovascolari 7, basato sul lavoro di de Jonge et al. 8
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Protocol
1. Cultura di umani Vena safena Cells
- Isolare le cellule dalla vena safena magna, acquisita da un donatore in conformità alle linee guida per l'uso materiale secondario, secondo il protocollo di Schnell et al. 9 e memorizzare questi in azoto liquido. Dalla parte della vena safena magna da un donatore pezzi tagliati di 2 x 2 mm a coltura in una piastra a sei pozzetti. Usare 2 pezzi per pozzetto. Generalmente sufficienti cellule possono essere ottenute per riempire circa 3 flaconcini con 0,25 x 10 6 cellule in azoto liquido. HVSCs sono caratterizzati come miofibroblasti, mostrando espressione di vimentina, nessuna espressione di desmin e una sottopopolazione che esprime muscolo liscio α actina 10. Successiva avviare il protocollo di scongelare le cellule dal azoto liquido per aumentare il numero di cellule.
- Posizionare le cellule da una fiala in un pallone di coltura tissutale T75 e aggiungere mezzo di crescita (GM), costituito Avanzato DMEM, 50 ml di siero bovino fetale (FBS), 5 ml di penicillina /streptomicina e 5 ml di L-glutamax. Cambiare media ogni 2-3 giorni.
- Cellule crescono confluente dopo circa 14 giorni. Negozio 0.5 x 10 6 cellule in un flaconcino in azoto liquido, indicato come passaggio 1.
Nota: Congelamento delle cellule non è necessario quando la raccolta HVSCs, ma viene esclusivamente utilizzato per l'archiviazione.
- Posizionare i HVSCs da una fiala in un pallone di coltura tissutale T175 e aggiungere GM. Cambiare media ogni 2-3 giorni. Cellule crescono confluente dopo circa 7 giorni. Negozio 3 x 10 6 cellule in un flaconcino in azoto liquido, indicato come passaggio 2.
- Mettere le cellule da una fiala in un rollerbottle e aggiungere GM. Cambiare media ogni 2-3 giorni. Cellule crescono confluenti circa dopo 8 giorni. Uno rollerbottle contiene circa 20-30 x 10 6 cellule. Cellule di coltura fino al passaggio 6. Non utilizzare cellule di un passaggio superiore passaggio 9, poiché fenotipo cellulare può cambiare. 2. Ingegneria di costrutti tissutali a base di fibrina
- Preparare colla siliconica miscelando l'elastomero con il catalizzatore (10:1). Tagliare 7 x 3 mm segmenti rettangolari di velcro. Incollare il velcro in una piastra di coltura 6 bene, con membrane flessibili per formare una croce, e di lasciare uno spazio quadrato di 3 mm tra le strisce di velcro.
- Asciugare la colla siliconica durante la notte in un forno a 60 ° C per garantire indurimento della colla. Sterilizzare con l'aggiunta di 70% EtOH ai pozzetti ed incubare per 30 min. Risciacquare 3 volte con PBS e rimuovere tutti PBS dal welLS e il velcro. Mettere sotto UV per 30 minuti e mantenere sterile fino al momento dell'uso.
- Preparare Tissue Ingegneria medie (TM), costituito da GM e 130 mg di acido L-ascorbico 2-fosfato.
- Aggiungere 1 mg / ml di acido caproico ε-Amino (ACA) alla TM. ACA è usato per i primi 7 giorni di coltura per impedire la fibrina dalla degradante 11. Alternativamente, aprotinina può essere utilizzato.
- Per prevenire la formazione di ciuffo, fibrinogeno permettono di raggiungere la temperatura ambiente prima dell'apertura. Senza ciuffi fibrinogeno si dissolverà più facilmente. Sciogliere fibrinogeno ad una concentrazione di 10 mg effettivo proteina / ml TM 7 integrato con ACA. Filtro sterile la soluzione di fibrinogeno, è necessaria la più filtri. Conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Sciogliere trombina ad una concentrazione di 10 UI / ml TM 7 integrato con ACA. Conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso. </ Ol>
- Trypsinize le cellule, risospendere in GM e conteggio.
- Utilizzare 15 x 10 6 cellule / ml per semina i costrutti tissutali fibrina-based (concentrazione basato su metodi di ingegneria tissutale valvole cardiache 7). Un unico gel consiste di 100 pl gof el, e quindi di 1,5 x 10 6 cellule. Mettere 1,5 x 10 6 cellule in una provetta da centrifuga, risultante in altrettanti tubi da centrifuga come il numero di gel che verranno fatte.
- Centrifugare le cellule a 350 xg per 7 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 50 ml di trombina. Aggiungere 4 ml di blu fluorescente microsfere di polistirolo a questa sospensione. Mettere 50 ml di fibrinogeno in un flaconcino. Utilizzare una pipetta a prendere il 50 trombina microlitri con le cellule. Aumentare il volume della pipetta 100 microlitri. Pipettare la soluzione 50 ml di trombina concellule nel flaconcino con il fibrinogeno per mescolare la trombina e fibrinogeno, e occupano la miscela di 100 ml.
- Pipettare il composto in gel e tra le strisce di velcro. Il tipico tempo di gelificazione per i gel di fibrina, una volta che i componenti sono miscelati, è dell'ordine di 20 sec.
- Incubare sospensioni per 30 min a 37 ° C in un umidificata 95% aria / 5% CO 2 incubatore per consentire gelificazione prima di aggiungere cultura TM con ACA.
- Sostituire il TM con ACA ogni 2-3 giorni per i primi 7 giorni. I gel sono abbastanza stabili dopo una settimana per essere coltivato senza ACA. Dopo la prima settimana TM sostituire ogni 2-3 giorni. Aggiungere 6 ml di TM per pozzetto. Il giorno 12 celle hanno prodotto abbastanza collagene per la visualizzazione.
- Deformazione statica viene applicato direttamente dalle cellule, dovute alla trazione cella e compattazione 12. Per indurre il collagene di riorganizzazione, ha tagliato il tessuto costruire sciolto da due strisce di velcro in una sola direzione. Ciò si traduce in vincoli unidirezionali (Figura 1A). Eseguire questo il giorno 12, dal momento che il costrutto è quindi abbastanza stabile e il collagene è stato depositato.
- Applicare deformazione ciclica applicando un vuoto al fondo delle piastre di coltura con membrane flessibili, con l'utilizzo del sistema FX4000T Flexcell. Posizionare le piastre su una piastra di base, sulla parte superiore del post carico (che sono una parte del secolodispositivo di carico ciclico e). La pompa si applica un vuoto sulla membrana e tira in tal modo la membrana sopra il post rettangolare giace sotto. Dovuto alle allegati sagomate trasversali del tessuto costruisce alla membrana (attraverso il velcro) e il post rettangolare il ceppo ciclico applicato è monoassiale (Figura 1B).
- Inizialmente, utilizzare la cultura statica per 5 giorni per raggiungere l'integrità meccanica iniziale, prima dell'applicazione di sforzo ciclico a partire dal giorno 6. Programma un protocollo macchia ciclico nel regolatore per la pompa del vuoto. Ad esempio, utilizzare un protocollo ceppo ciclica intermittente precedentemente stabilito, con la direzione monoassiale 13. Questo consiste in un ceppo intermittente di un'onda sinusoidale con 1 Hz, tendendo da 0 a 5% di deformazione, per periodi di 3 ore, alternate con periodi di riposo 3 ore. Eseguire questo protocollo sforzo ciclico per 7 giorni, inducendo una organizzazione collagene allineate.
- In genere dopo 12 giorni HVSCs hanno prodotto un organizatio collagene allineaten. Dopo aver raggiunto una organizzazione collagene allineata, cambiare la direzione di deformazione ciclica uniassiale, per essere perpendicolare alla direzione ceppo originale. Fare questo girando i posti rettangolari di 90 °.
- Per visualizzare attivo, in tempo reale rimodellamento del collagene, i campioni di etichette con le sonde che non interferiscono con la vitalità delle cellule o la formazione di collagene. Utilizzare sonde a macchiare fluorescently citoplasma della cellula e collagene.
- In alternativa generazione di seconda armonica con microscopio confocale a scansione laser può essere usato per visualizzare le strutture di collagene mediante autofluorescenza 14, con eccitazione a 780 nm e il rilevamento tra 500-550 nm.
- Rimuovere le piastre di coltura dalla configurazione e l'incubatore, per i campioni ciclicamente tese durante il periodo di riposo di 3 ore, e trasportarli in un microscopio confocale a scansione laser per visualizzare le cellule e collagene.
Note: usare il lato morbido del velcro solo e questo lato verso l'alto. Per incollare il velcro, coprono solo il velcro con colla al silicone, non si diffondono colla tutto il bene. Poiché le piastre di coltura hanno fondo membrana di silicone, usare qualcosa sotto la piastra bene per rinforzare le membrane flessibili, per garantire il facile incollaggio alla piastra.
Nota: Per sciogliere mix fibrinogeno delicatamente per evitare la formazione di schiuma eccessiva.
Nota: Stoccaggio in ghiaccio è necessaria per evitare la gelificazione precoce di trombina e fibrinogeno.
Nota: La fluorescente microsfere di polistirolo vengono utilizzate come marcatori di riferimento interni per l'analisi dell'immagine. Quando trombina e fibrinogeno miscelazione, impediscono la formazione di bolle d'aria pipettando accuratamente la miscela. Bolle d'aria si tradurrà in fori nel gel di fibrina.
Note: Fate questo il più rapidamente possibile per evitare la gelificazione prima che la miscela viene pipettato nella piastra bene. Pratica prima di utilizzare le cellule e perline.
3. Applicazione Strain e indurre cambiamenti in Strain e Vincoli
4. Visualizzare cellule e collagene
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Representative Results
Questo sistema consente di effettuare la coltura myofibroblast teste di serie gel di fibrina. Figura 1A mostra un tessuto coltivato prima sotto vincoli biassiali statiche. Vincoli dei tessuti vengono rilasciati tagliando il gel di fibrina da due vincoli, per creare vincoli statici monoassiali e compatta del tessuto e rimodella dopo (Figura 1A). Per deformazione ciclica, il tessuto viene coltivato sotto vincoli biassiali statiche pure. Dopo 5 giorni deformazione uniassiale ciclico può essere applicata (Figura 1B). Per indurre collagene riorientamento, direzione uniassiale ceppo può essere cambiato in direzione perpendicolare (Figura 1B). Le microsfere seminato con la miscela di gel, visualizzare un modello casuale, che viene utilizzato per trasferire destinazioni predefinite per time-lapse imaging (Figura 2). Figure 2A e 2C mostrano un'immagine di cellule, collagene e perline. Queste stesse immagini vengono scansionati 3 giorni (Figure 2B) e 2 giorni (Figura 2D) più tardi, rispettivamente. Cellule e modelli di collagene sono cambiati, ma i modelli tallone sono utilizzati per trasferire le cellule e collagene. Campioni di coltura per 12 giorni risultati nella produzione di collagene endogeno in quantità sufficiente per essere visualizzato con microscopia confocale (figure 3 e 4). Utilizzando sia i risultati della coltura statici o ciclici in organizzazione collagene è nettamente diverso, dove la cultura statica biassiale dà luogo ad una organizzazione di collagene casuale (Figura 3A) e la tensione ciclica uniassiale applicato a un risultato di tessuto biassiale vincolati a una struttura di collagene allineate (Figure 4A e B) . Questa organizzazione collagene può essere studiato nel tempo, pur cambiando i vincoli statici o cambiando la direzione deformazione ciclica. Quando i vincoli statici vengono modificate da biassiale a monoassiale, collagene cambia orientamento da un orientamento casuale (Figura 3A) Ad un orientamento allineata (Figura 3B). Ceppo ciclico induce un cambiamento di orientamento alla superficie del tessuto (figure 4A e C), ma dopo 3 giorni, si osserva alcun cambiamento nel nucleo del tessuto (Figure 4B e D).
Figura 1. Costrutti in coltura sotto vincoli biassiali, utilizzati per riorganizzare il collagene da (A) rilasciando vincoli statici in una direzione, oppure (B) cambiare direzione sforzo ciclico. Caricamento messaggi sono indicati da linee nere tratteggiate. Barre di scala indicano tre millimetri.
Figura 2. Tipico esempio l'uso di modelli branello di trasferire posizioni predefinite in 3D, in questo caso in modo staticocampioni in coltura. cellule sono mostrati in rosso, collagene nel verde e perline in blu. A e C mostrano un'immagine di cellule, collagene e perline. Queste immagini vengono scansionati tre giorni (B) e 2 giorni (D) più tardi, rispettivamente. Schemi di perline vengono utilizzate per trasferire le cellule e collagene. Barra di scala indica 50 micron.
Figura 3. R immagini epresentative di 12 giorni ceppo statico con vincoli biassiali (A) e il riorientamento a causa di vincoli uniassiali entro 7 giorni (B), bar. Scala indica 50 micron.
Figura 4. Immagini rappresentative dopo 12 giorni (5 giorni statici, seguiti da 7 giorni deformazione ciclica) per deformazione ciclica in superficie (A) E ~ 60 ìm nel tessuto (B). Dopo un cambiamento di direzione ceppo ciclico (dopo 12 giorni), le cellule superficiali e collagene riorientare (C), ma non si osservano variazioni nel nucleo del tessuto (D) dopo 3 giorni.
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Discussion
Il sistema modello descritto costrutti di fibrina cellula-popolate ha un grande potenziale per lo studio della cellula e collagene (ri) organizzazione (de Jonge et al. 15), ad esempio da utilizzare per scopi di ingegneria tissutale. Utilizzando fibrina come il vettore cellula iniziale, dopo la degradazione della fibrina, un tessuto è creato con cellule e unica matrice endogena. In questo modo, le cellule sono stimolate a reagire a ceppo, o statico o ciclico in natura, applicando forze contrattili 16,17, sensing confine rigidità 12, o la visualizzazione ceppo evitamento.
Significato: costrutti fibrina sono state utilizzate prima per studiare collagene (ri) organizzazione 18, ma non con la capacità di applicare ceppo ciclico e / o studiare i costrutti in maniera temporizzata, entrambi i quali sono possibili in questo metodo presentato. I Velcro che forniscono i vincoli in questo sistema modello sono state utilizzate prima 19,ma combinando questa tecnica con piastre di coltura con membrane flessibili permette di applicare deformazione ciclica per periodi di tempo prolungati. Coltura in queste piastre permette una facile aggiunta e la rimozione di medie e visualizzazione dei costrutti mentre ancora attaccato e sterile. Ciò consente lo studio dei processi di rimodellamento rilevanti e ritardi o addirittura in tempo reale.
Le modifiche e le applicazioni future: future applicazioni del sistema possono essere trovati nel manipolare il processo di rimodellamento 3D, ad esempio con l'aggiunta di metalloproteinasi o agenti che interferiscono con integrina montaggio o segnalazione. Accanto all'applicazione di additivi, i componenti del sistema modello possono essere facilmente modificati quando si studia organizzazione cellulare e collagene (ri). Diverse fonti cellulari, cellule sani e malati, la scadenza della matrice di collagene (ad es variando tempo di coltura), e la forma e le dimensioni del costrutto possono essere adattati alle esigenze specifiche. Il sistema è ben suited per altre fonti cellulari, invece delle HVSCs attualmente usati. Abbiamo già usato questo sistema di coltura le cellule endoteliali che formano colonie (ECFCs; PlosOne, accettato per la pubblicazione), in cui si osserva che ECFCs orientare la loro collagene prodotto in modo diverso su di sforzo ciclico di HVSCs.
Limiti della tecnica: Una limitazione del sistema modello attuale è la dimensione relativamente grande dei tessuti, richiedendo 1,5 x 10 6 cellule per costrutto quando si utilizza una densità cellulare di 15 x 10 6 cellule / ml. Questo può rappresentare un problema nel caso in cui saranno utilizzati fonti di cellule meno disponibili. Un'altra limitazione è lo spessore attuale dei costrutti (circa 1 mm), il che è dovuto alle (spessore) in velcro. Questo limita la scansione confocale a solo una parte dell'intero campione. È possibile raggiungere una profondità di massimo 200 micron di tessuto, che è sufficiente per visualizzare le risposte cellulari nel nocciolo di tessuti attuali, ma does non tradursi in una panoramica a tutto spessore.
Passaggi critici e la risoluzione dei problemi: Come il modello di sistema si basa sulla formazione di tessuto tra i punti di fissaggio in velcro, questo comprende anche le fasi critiche del protocollo. Di taglio e incollaggio corretto è essenziale e particolare attenzione dovrebbe essere prestata alla attenta pipettaggio della miscela gel nelle strisce di velcro per il corretto fissaggio del tessuto, che è cruciale per l'applicazione di deformazione ciclica. Ulteriori passi determinanti possono essere trovati nella scelta della fonte di cellule e additivi medi. Sarà necessaria ottimizzazione quando coltura con una sorgente cella diversa. Attualmente, i costrutti sono coltivate con ACA per 7 giorni, per fermare la fibrina dalla degradante. Una fonte di cellule diverso può anche tradursi in un arco di tempo diverso per quanto riguarda sia la formazione di collagene e la degradazione della fibrina.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo studio è stato eseguito nel programma di ricerca dei materiali biomedici (BMM) dell'istituto. BMM è cofinanziato dal ministero olandese degli Affari economici, dell'agricoltura e dell'innovazione. Il contributo finanziario della Hartstichting Nederlandse Si ringrazia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
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