Summary
Ce système de modèle commence à partir d'un gel de fibrine myofibroblastes peuplée qui peut être utilisé pour étudier collagène endogène (ré) organisation en temps réel de façon non destructive. Le système de modèle est très accordable, comme il peut être utilisé avec des sources différentes de cellules, des additifs moyen, et peut être adapté facilement à des besoins spécifiques.
Abstract
teneur en collagène et de l'organisation dans le développement de tissus collagènes peuvent être influencés par des souches de tissus locaux et des contraintes de tissu. ingénieurs de tissus visent à utiliser ces principes pour créer des tissus avec des architectures de collagène prédéfinis. Une pleine compréhension des processus sous-jacents exactes de remodelage du collagène de contrôler l'architecture finale de tissu, cependant, est manquant. En particulier, on sait peu au sujet de l'orientation (re) des fibres de collagène en réponse aux changements des conditions de chargement mécaniques des tissus. Nous avons développé un système modèle in vitro, composé de bi-contraints myofibroblastes tête de série fibrine constructions, à élucider collagène orientation (re) en réponse à i) revenant biaxial à des conditions de chargement statique uniaxiaux et ii) chargement cyclique uniaxial de la bi-contraint constructions avant et après un changement de direction de chargement, avec l'utilisation du dispositif de chargement FX4000T flexcell. Imagerie confocale time-lapse est utilisé pour visualize collagène orientation (re) d'une manière non-destructive.
organisation de cellules et de collagène dans les constructions peuvent être visualisées en temps réel et un système de référence interne nous permet de délocaliser les cellules et les structures de collagène pour l'analyse time-lapse. Divers aspects du système de modèle peuvent être ajustés, comme source ou l'utilisation de cellules saines et malades cellule. Des additifs peuvent être utilisés pour élucider les mécanismes remodelage du collagène sous-jacent, par exemple en ajoutant MMP ou le blocage des intégrines. Forme et la taille de la construction peuvent être facilement adaptés à des besoins spécifiques, résultant en un système modèle très configurable pour étudier la cellule et du collagène (ré) organisation.
Introduction
Les tissus cardiovasculaires ont une fonction de charge importante. En particulier, le contenu et l'organisation des fibres de collagène dans la matrice extracellulaire contribuer aux propriétés porteuses et dominer la force globale de tissus 1. Dans l'ingénierie tissulaire conditionnement mécanique de la construction est utilisée - généralement composé d'(cyclique) des régimes rude épreuve - afin d'améliorer l'organisation des tissus et des propriétés mécaniques 2,3. Une bonne compréhension de l'organisation du collagène induite par contrainte dans des géométries complexes de tissus pour créer des tissus à l'architecture de collagène prédéfinie n'a pas encore été atteint. Ceci est principalement dû à notre connaissance limitée de remodelage du collagène dans les tissus en voie de développement. Les modèles existants donnent surtout des informations sur le résultat net final de remodelage du collagène avec l'utilisation des contraintes statiques 4-6. Ici nous fournissons un système modèle très configurable qui permet l'étude de collagène (ré) organisation d'une manière en temps réel, en 3D, sous l'influencede contrainte statique ou cyclique. Les constructions de tissus sont à base de fibrine, s'assurer que tous collagène dans la construction est endogène. organisation de cellules et de collagène dans les constructions est visualisée, et un système de référence interne nous permet de relocaliser les cellules et les structures de collagène pour l'analyse time-lapse. Dans ce protocole, nous allons décrire l'utilisation du système de modèle pour les cellules Saphena Vena humaines (HVSCs), puisque ces cellules sont connus pour leur meilleure production supplémentaire cellulaire de la matrice et la capacité de remodeler la matrice et notre usage établi dans les tissus cardiovasculaires ingénierie 7, sur la base sur les travaux de de Jonge et al. 8
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Protocol
1. Culture des droits de veine saphène Cells
- Isoler des cellules de la veine saphène, acquises à partir d'un donneur conformément à des directives pour l'utilisation de matière secondaire, selon le protocole par Schnell et al. 9 et stocker ceux-ci dans de l'azote liquide. Dans le cadre de la veine saphène à une des pièces découpées de donneur de 2 x 2 mm à la culture dans une plaque à six puits. Utilisez 2 éléments par puits. Assez généralement cellules peuvent être obtenues à remplir environ 3 flacons à 0,25 x 10 6 cellules dans l'azote liquide. HVSCs sont caractérisés comme myofibroblastes, en montrant l'expression de la vimentine, aucune expression de la desmine et une sous-population exprimant α actine musculaire lisse 10. Suivant démarrer le protocole de décongeler les cellules de l'azote liquide pour augmenter le nombre de cellules.
- Placez les cellules provenant d'une fiole dans un flacon de culture de tissu T75 et ajouter du milieu de croissance (GM), composé d'avancée DMEM, 50 ml de sérum de veau fœtal (FBS), 5 ml de pénicilline /streptomycine et 5 ml de L-glutamax. Changer le milieu tous les 2-3 jours.
- Les cellules croissent confluent environ après 14 jours. Magasin 0,5 x 10 6 cellules dans un flacon dans de l'azote liquide, dénommé passage 1.
Note: La congélation des cellules n'est pas nécessaire lors de la récolte HVSCs, mais il est uniquement utilisé pour le stockage.
- Placez les HVSCs d'une fiole dans un flacon de culture tissulaire et T175 ajouter GM. Changer le milieu tous les 2-3 jours. Les cellules croissent confluent après environ 7 jours. Magasin 3 x 10 6 cellules dans un flacon dans de l'azote liquide, appelé passage 2.
- Placez les cellules provenant d'un flacon dans un rollerbottle et ajouter GM. Changer le milieu tous les 2-3 jours. Les cellules croissent confluent environ après 8 jours. Un rollerbottle contient environ 20-30 x 10 6 cellules. cellules en culture jusqu'à passage 6. Ne pas utiliser des cellules d'un passage supérieur à 9 passage, depuis le phénotype cellulaire peut changer. 2. Ingénierie des constructions de tissu à base de fibrine
- Préparation de la colle silicone par le mélange de l'élastomère avec l'agent de durcissement (10:01). Couper 7 x 3 segments rectangulaires mm de Velcro. Coller le Velcro dans une plaque de culture 6 puits, avec des membranes flexibles pour former une croix, et à laisser un espace carré de 3 mm entre les bandes de Velcro.
- Sécher la colle de silicone pendant une nuit dans une étuve à 60 ° C pour assurer le durcissement de la colle. Stériliser en ajoutant 70% de EtOH dans les puits et incuber pendant 30 min. Rincer 3x avec PBS et retirez tous PBS à partir du wells et le Velcro. Mettez sous UV pendant 30 min et garder stérile jusqu'à l'utilisation.
- Préparer moyen Tissue Engineering (TM), composé de GM et de 130 mg d'acide L-ascorbique 2-phosphate.
- Ajouter 1 mg / ml caproïque ε-amino (ACA) à la TM. ACA est utilisée pendant les 7 premiers jours de culture pour empêcher la fibrine à partir dégradants 11. Alternativement, l'aprotinine peut être utilisé.
- Pour éviter la formation de touffe, laissez fibrinogène à atteindre la température ambiante avant ouverture. Sans touffes fibrinogène va se dissoudre plus facilement. Dissoudre le fibrinogène à une concentration de 10 mg réelle protéine / ml de TM 7 supplémenté avec ACA. Filtre stérile la solution de fibrinogène, de multiples filtres pourrait être nécessaire. Stocker sur la glace jusqu'à utilisation.
- Dissoudre la thrombine à une concentration de 10 UI / ml de TM 7 supplémenté avec ACA. Stocker sur la glace jusqu'à utilisation. </ Ol>
- Trypsiniser les cellules, remettre en suspension dans GM et le nombre.
- Utilisez 15 x 10 6 cellules / ml pour ensemencer les constructions de tissu à base de fibrine (concentration basée sur les méthodes de valves cardiaques de l'ingénierie tissulaire 7). Un seul gel est constitué de 100 pi GOF el, et ainsi de 1,5 x 10 6 cellules. Mettez 1,5 x 10 6 cellules dans un tube de centrifugeuse, résultant en autant de tubes de centrifugeuses que le nombre de gels qui seront faites.
- Centrifuger les cellules à 350 g pendant 7 min et jeter le surnageant. Reprendre les cellules dans 50 ul de thrombine. Ajouter 4 pi de microsphères de polystyrène bleu fluorescent à cette suspension. Mettez 50 pl de fibrinogène dans un flacon. Utiliser une pipette pour prendre la thrombine 50 pi avec des cellules. Augmenter le volume de la pipette à 100 pi. Introduire à la pipette la solution de 50 pi avec de la thrombinecellules dans le flacon de fibrinogène pour mélanger les thrombine et le fibrinogène, et prennent le mélange de 100 pi.
- Pipeter le mélange de gel dans et entre les bandes de Velcro. Le temps de gélification typique des gels de fibrine, une fois que les composants sont mélangés, est de l'ordre de 20 s.
- Incuber suspensions pendant 30 min à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée à 95% d'air / 5% de CO 2 incubateur pour permettre la gélification avant d'ajouter la culture TM avec l'ACA.
- Remplacer TM avec l'ACA tous les 2-3 jours pendant les 7 premiers jours. Les gels sont assez stable après une semaine à être cultivé sans ACA. Après la première semaine TM remplacer tous les 2-3 jours. Ajouter 6 ml de TM par puits. Le jour 12 cellules ont produit suffisamment de collagène pour la visualisation.
- Allongement statique est appliquée directement par les cellules, dues à l'accélération de la cellule et de compactage 12. Pour induire une réorganisation du collagène, couper le tissu construire lâche de deux bandes Velcro dans un seul sens. Il en résulte des contraintes unidirectionnelles (figure 1A). Effectuez cette 12e jour, puisque le concept est alors assez stable et le collagène a été déposé.
- Appliquer déformation cyclique en appliquant un vide à la partie inférieure des plaques de culture avec des membranes flexibles, avec l'utilisation du système FX4000T flexcell. Placez les plaques sur une plaque de base, en plus de postes de chargement (qui sont une partie de ee dispositif de chargement cyclique). La pompe applique un vide sur la membrane et tire ainsi la membrane sur le poteau rectangulaire se trouvant en dessous. En raison des fixations en forme de croix du tissu construit sur la membrane (via le Velcro) et le poste rectangulaire la souche cyclique appliqué est uniaxe (figure 1B).
- Initialement, utilisez culture statique pendant 5 jours pour atteindre l'intégrité mécanique initial, avant l'application de la contrainte cyclique à partir du jour 6. Programme un protocole tache cyclique dans l'unité de commande pour la pompe à vide. Par exemple en utilisant un protocole de déformation cyclique intermittente établi précédemment, à l'orientation uniaxiale 13. Il est composé d'une souche intermittent d'une onde sinusoïdale à 1 Hz, l'effort de 0 à 5% de déformation, pour des périodes de 3 heures, alternant avec des périodes de repos de 3 heures. Effectuez ce protocole de déformation cyclique pendant 7 jours, induisant une organisation de collagène alignés.
- Typiquement, après 12 jours HVSCs ont produit une organizatio de collagène alignésn. Après une organisation de collagène alignée est atteinte, changer la direction de déformation cyclique uniaxiale, à être perpendiculaire à la direction de la souche originale. Pour ce faire, en tournant les messages rectangulaires de 90 °.
- Pour visualiser, le remodelage du collagène active en temps réel, des échantillons d'étiquettes avec des sondes qui ne gênent pas la viabilité cellulaire ou de la formation de collagène. Utiliser des sondes pour colorer fluorescence du cytoplasme des cellules et de collagène.
- Alternativement génération de second harmonique en utilisant la microscopie confocale à balayage laser peut être utilisé pour visualiser les structures de collagène à l'aide autofluorescence 14, avec une excitation à 780 nm et la détection entre 500-550 nm.
- Retirez les plaques de culture à partir de la configuration et de l'incubateur, pour les échantillons de manière cyclique tendues au cours de la période de repos de 3 heures, et de les transporter à un microscope confocal à balayage laser pour visualiser les cellules et de collagène.
Notes: utiliser uniquement le côté doux du velcro et faire face à ce côté vers le haut. En collant le Velcro, ne couvrent que le Velcro avec colle silicone, ne se propage pas à travers la colle bien. Comme les plaques de culture ont un fond de la membrane en silicone, utiliser quelque chose en dessous de la plaque de puits pour le renforcement des membranes flexibles, afin d'assurer le collage facile dans la plaque.
Note: Pour dissoudre mélange de fibrinogène doucement pour éviter la formation de mousse trop.
Note: Stockage sur la glace est nécessaire pour éviter la gélification début de la thrombine et fibrinogène.
Remarque: Les microsphères de polystyrène fluorescentes sont utilisés en tant que marqueurs de référence interne pour l'analyse de l'image. Lorsque la thrombine et le fibrinogène mélange, éviter la formation de bulles d'air par aspiration soigneusement le mélange. Les bulles d'air se traduira par des trous dans le gel de fibrine.
Notes: Pour ce faire, le plus rapidement possible pour éviter la gélification avant que le mélange est introduit à la pipette dans la plaque bien. Pratique avant d'utiliser des cellules et des perles.
3. Application de souche et induisant des changements dans la souche et contraintes
4. Cellules visualisation et de collagène
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Representative Results
Ce système modèle permet pour la culture des myofibroblastes ensemencées gels de fibrine. Figure 1A montre un tissu cultivé d'abord sous contraintes biaxiales statiques. contraintes de tissus sont libérés en coupant le gel de fibrine à partir de deux contraintes, à créer des contraintes statiques uniaxiaux et compacte de tissus et remodèle la suite (figure 1A). Par déformation cyclique, le tissu est cultivé dans des contraintes statiques biaxiales ainsi. Après 5 jours souche uniaxial cyclique peut être appliquée (figure 1B). Pour induire une réorientation du collagène, de la direction de déformation uniaxiale peut être modifié à la direction perpendiculaire (figure 1B). Les microsphères ensemencées avec le mélange de gel, d'afficher de façon aléatoire, qui est utilisé pour déplacer des emplacements prédéfinis pour l'imagerie time-lapse (Figure 2). Figures 2A et 2C montrent une image de cellules, le collagène et de perles. Ces mêmes images sont numérisées 3 jours (Figure 2B) et 2 jours (figure 2D) plus tard, respectivement. Les cellules et les modèles de collagène ont changé, mais les modèles de perles sont utilisées pour déplacer les cellules et de collagène. des échantillons de culture pendant 12 jours en résulte la production de collagène endogène en quantité suffisante pour être visualisée par microscopie confocale (figures 3 et 4). En utilisant soit les résultats de culture statique ou cyclique dans l'organisation du collagène est nettement différente, où la culture statique biaxiale donne lieu à une organisation de collagène aléatoire (figure 3A) et la déformation cyclique uniaxiale appliquée à un résultat de tissu biaxial contraintes dans une structure de collagène alignés (figures 4A et B) . Cette organisation de collagène peut être étudiée au fil du temps, tout en changeant les contraintes statiques ou en changeant la direction de déformation cyclique. Lorsque les contraintes statiques sont modifiés à partir de deux axes à uniaxial, les changements d'orientation de collagène à partir d'une orientation aléatoire (figure 3A) À une orientation alignée (figure 3B). Déformation cyclique induit un changement d'orientation à la surface du tissu (figures 4A et C), mais après 3 jours, on n'observe pas de modification de la base du tissu (figures 4B et D).
Figure 1. Constructions cultivées sous des contraintes biaxiales, utilisés pour réorganiser collagène par (A) la libération de contraintes statiques dans une direction, ou par (B) du changement de direction de la déformation cyclique. Postes de chargement sont indiqués par des lignes noires en pointillé. Barres d'échelle indiquent 3 mm.
Figure 2. Un exemple typique de l'utilisation de modèles de perles de déménager emplacements prédéfinis en 3D, dans ce cas statiqueéchantillons de culture. Cellules sont indiquées en rouge, le collagène en vert et des perles en bleu. A et C montrent une image de cellules, le collagène et de perles. Ces images sont numérisées 3 jours (B) et 2 jours (D) plus tard, respectivement. Modèles de perles sont utilisées pour déplacer des cellules et de collagène. La barre d'échelle indique 50 um.
Figure 3. Images eprésentant R de contrainte statique de 12 jours avec des contraintes biaxiales (A) et la réorientation en raison de contraintes uniaxiales dans les 7 jours (B) bar. D'échelle indique 50 um.
Figure 4. Des images représentatives au bout de 12 jours (5 jours statiques, suivis de 7 jours souche cyclique) de déformation cyclique à la surface (A) Et ~ 60 um dans le tissu (B). Après un changement de direction de la déformation cyclique (après 12 jours), les cellules de surface et de collagène réorienter (C) mais pas de changements sont observés dans le noyau du tissu (D) après 3 jours.
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Discussion
Le système modèle décrit des constructions de fibrine cellule de population a un grand potentiel pour l'étude des cellules et de collagène (ré) organisation (de Jonge et al. 15), par exemple, être utilisé à des fins d'ingénierie tissulaire. En utilisant la fibrine en tant que support de cellule initiale, après la dégradation de la fibrine, d'un tissu est créé avec des cellules et de la matrice endogène seulement. De cette façon, les cellules sont stimulées à réagir à la souche, soit statique ou cyclique dans la nature, en appliquant des forces contractiles 16,17, sentant la raideur de la frontière 12, ou l'affichage d'évitement de souche.
Signification: constructions de fibrine ont été utilisés avant d'étudier collagène (ré) organisation 18, mais pas avec la capacité d'appliquer déformation cyclique et / ou d'étudier les constructions de manière time-lapse, qui tous deux sont possibles dans cette méthode présentée. Les bandes Velcro qui fournissent les contraintes dans ce système modèle ont été utilisés avant le 19,mais en combinant cette technique avec des plaques de culture avec des membranes souples permet d'appliquer des déformations répétées pendant des périodes de temps prolongées. La culture de ces plaques permet une addition et un retrait facile du support et de la visualisation des produits d'assemblage tout en restant attachée et stérile. Cela permet l'étude des processus de remodelage pertinents temps périmés ou même en temps réel.
Les modifications et les futures applications: les applications futures du système peuvent être trouvés dans la manipulation du processus de remodelage 3D, par exemple en ajoutant métalloprotéinases ou d'agents qui interfèrent avec l'ensemble de l'intégrine ou de signalisation. Suivant l'application d'additifs, les composants du système de modèle peuvent être facilement modifiés pour l'étude cellulaire et le collagène (ré) organisation. Différentes sources de cellules, les cellules saines et malades, la maturité de la matrice de collagène (par exemple en faisant varier le temps de culture), et la forme et la taille de la construction peuvent être adaptées aux besoins spécifiques. Le système est bien sUited pour d'autres sources cellulaires, à la place des HVSCs actuellement utilisés. Nous avons déjà utilisé ce système pour la culture des cellules formant des colonies endothéliales (CPEF; PlosOne, accepté pour publication), où l'on observe que CPEF orienter leur de collagène produit différemment sur déformation cyclique de HVSCs.
Limites de la technique: une limitation du système de modèle courant est la taille relativement importante des tissus, nécessitant 1,5 x 10 6 cellules par construction lors de l'utilisation d'une densité cellulaire de 15 x 10 6 cellules / ml. Cela peut poser un problème dans les cas où les sources de cellules moins disponibles seront utilisés. Une autre limitation est l'épaisseur actuelle des constructions (environ 1 mm), ce qui est dû à l'(épais) attaches Velcro. Cela limite le balayage confocal à une partie seulement de l'échantillon total. Il est possible d'atteindre une profondeur maximale de 200 um dans le tissu, ce qui est suffisant pour visualiser les réponses cellulaires dans le noyau des tissus actuels, mais nees pas aboutir à une vue d'ensemble sur toute son épaisseur.
Les étapes critiques et de dépannage: En tant que système modèle est basé sur la formation de tissu entre les points d'attache Velcro, cela comprend également les étapes critiques dans le protocole. Bonne coupe et le collage est essentielle et une attention particulière devrait être accordée à la pipetage soigneux du mélange de gel dans les bandes Velcro pour fixation correcte du tissu, ce qui est crucial pour l'application de déformation cyclique. D'autres étapes déterminantes peuvent être trouvés dans le choix de la source de la cellule et additifs moyenne. Optimisation seront nécessaires lors de la mise en culture d'une source de cellules différentes. Actuellement, les constructions sont cultivées avec l'ACA pendant 7 jours, pour arrêter la fibrine de se dégrader. Une source de cellules différent peut aussi entraîner un délai différent en ce qui concerne à la fois la formation de collagène et de la dégradation de la fibrine.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Cette étude a été réalisée dans le programme de recherche des matériaux biomédicaux (BMM) Institut. BMM est cofinancé par le ministère néerlandais des Affaires économiques, de l'Agriculture et de l'Innovation. La contribution financière de la Hartstichting Nederlandse est grandement appréciée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
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