Summary
Dieses Modell geht von einem System myofibroblast besiedelten Fibringel, die verwendet werden, um die endogene Kollagen (Re-) Organisation in Echtzeit in einer zerstörungsfreien Weise studieren kann. Das Modell ist sehr abstimmbaren, wenn er auf verschiedene Zellquellen Medium Zusatzstoffe verwendet werden, und kann leicht an spezifische Anforderungen angepasst werden.
Abstract
Collagen Inhalt und Organisation bei der Entwicklung kollagenen Gewebe kann durch lokale Stämme Gewebe und Gewebe Einschränkung beeinflusst werden. Tissue-Ingenieure sind bestrebt, diese Prinzipien zu verwenden, um Gewebe mit vordefinierten Kollagen Architekturen erstellen. Ein vollständiges Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse genauen Umbau von Kollagen, um die endgültige Architektur Gewebe steuern, jedoch fehlen. Insbesondere ist über die (Re-) Ausrichtung der Kollagenfasern in Reaktion auf Veränderungen im Gewebe mechanischen Beanspruchungen bekannt. Wir entwickelten ein in vitro-Modell, bestehend aus biaxial eingeschränkten myofibroblast ausgesät Fibrin-Konstrukte, die weitere Aufklärung Kollagen (re) Orientierung in Reaktion auf i) Rückgriff auf zweiachsigen einachsigen statischen Lastbedingungen und ii) zyklische einachsige Belastung des biaxial eingeschränkt Konstrukte vor und nach einer Änderung der Belastungsrichtung, unter Verwendung des Flexcell FX4000T Ladevorrichtung. Zeitraffer-konfokale Bildgebung verwendet wird, um visualize Kollagen (re) Orientierung in einer zerstörungsfrei.
Zell-und Kollagen-Organisation in den Konstrukten können in Echtzeit visualisiert und eine interne Referenz-System ermöglicht es uns, Zellen und Kollagen-Strukturen für Zeitraffer-Analyse zu verlagern. Verschiedene Aspekte des Modells kann eingestellt werden, wie Zellquelle oder Verwendung von gesunden und kranken Zellen. Additive können zur weiteren aufzuklären zugrunde liegenden Kollagen Umbau werden, zum Beispiel durch Zugabe von MMPs oder Sperrung Integrine. Form und Größe des Konstrukts kann leicht an spezifische Bedürfnisse angepasst werden, was zu einer sehr abstimmbaren Modellsystem zur Zelle und Kollagen (Re-) Organisation zu studieren.
Introduction
Herz-Kreislauf-Gewebe haben einen prominenten tragende Funktion. Insbesondere werden Inhalte und Organisation der Kollagenfasern in der extrazellulären Matrix zu den tragenden Eigenschaften beitragen und dominieren insgesamt Gewebefestigkeit 1. In Tissue Engineering mechanische Konditionierung des Konstrukts verwendet wird - in der Regel bestehend aus (zyklisch) belasten Regimen - um Gewebe Organisation und mechanischen Eigenschaften 2,3 verbessern. Volles Verständnis von Stamm-induzierte Kollagen Organisation in komplexen Geometrien Gewebe zu Gewebe mit vordefinierten Kollagen Architektur zu schaffen, hat noch nicht erreicht worden. Dies ist vor allem aufgrund unseres begrenzten Wissens von Kollagen Umbau in entwickelnde Gewebe. Bestehende Modelle vor allem Aufschluss über die endgültige Nettoergebnis von Kollagen Umbau mit der Nutzung der statischen Belastung 4-6. Hier bieten wir eine sehr abstimmbaren Modellsystem, das die Studie von Kollagen (Re-) Organisation ermöglicht in einer Echtzeit-Mode, in 3D, unter dem Einflussstatische oder zyklische Belastung. Die Gewebe Konstrukte sind Fibrin-basierte, sicherzustellen, dass alle Kollagen in dem Konstrukt endogenen ist. Zell-und Kollagen-Organisation in den Konstrukten wird visualisiert, und eine interne Referenz-System ermöglicht es uns, Zellen und Kollagen-Strukturen für Zeitraffer-Analyse zu verlagern. In diesem Protokoll werden wir beschreiben die Verwendung des Modells für humane Vena Saphena Cells (HVSCs), da diese Zellen für ihre erhöhte extrazelluläre Matrix-Produktion und die Fähigkeit, die Matrix und unseren etablierten Einsatz in engineered kardiovaskulärem Gewebe 7 renovieren, sind bekannt auf der Arbeit von de Jonge et al. 8
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Protocol
1. Kultur der Menschenrechte Vena Saphena Cells
- Isolieren von Zellen, die Vena saphena magna, von einem Spender gemäß den Richtlinien für die Weiterverwendung Material erfasst, gemäß dem Protokoll von Schnell et al. 9 und speichert diese in flüssigem Stickstoff. Aus dem Teil der Vena saphena magna von einem Spender-Zuschnitte von 2 x 2 mm zur Kultur in einem Sechs-Well-Platte. Verwenden Sie 2 Stück pro Vertiefung. Im Allgemeinen genügend Zellen erhalten werden, um etwa 3 Ampullen mit 0,25 x 10 6 Zellen in flüssigem Stickstoff zu füllen. HVSCs als Myofibroblasten gekennzeichnet, durch die die Expression von Vimentin, keine Expression von Desmin und eine Subpopulation exprimieren α Glattmuskelaktin 10. Weiter starten Sie das Protokoll, um die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff aufgetaut, um die Anzahl der Zellen zu erhöhen.
- Legen Sie die Zellen aus einem Fläschchen in eine T75 Zellkulturflasche und fügen Wachstumsmedium (GM), bestehend aus Erweiterte DMEM, 50 ml fötalem Rinderserum (FBS), 5 ml Penicillin /Streptomycin und 5 ml L-Glutamax. Ändern Medium alle 2-3 Tage.
- Zellen wachsen etwa nach 14 Tagen konfluent. Shop 0,5 x 10 6 Zellen in einem Fläschchen in flüssigem Stickstoff, die als Durchgang 1.
Hinweis: Das Einfrieren der Zellen ist nicht notwendig, wenn die Ernte HVSCs, ist aber ausschließlich für die Lagerung verwendet.
- Legen Sie die HVSCs aus einem Fläschchen in eine T175 Zellkulturflasche und fügen GM. Ändern Medium alle 2-3 Tage. Zellen wachsen nach ca. 7 Tage konfluent. Shop 3 x 10 6 Zellen in einem Fläschchen in flüssigem Stickstoff, die so genannte Passage 2.
- Legen Sie die Zellen aus einem Fläschchen in eine rollerbottle und fügen GM. Ändern Medium alle 2-3 Tage. Zellen wachsen etwa nach 8 Tagen konfluent. Eine rollerbottle enthält etwa 20-30 x 10 6 Zellen. Kultur-Zellen bis zu Kanal 6. Verwenden Sie keine Zellen einer Passage über Kanal 9, da Zellphänotyp ändern kann. 2. Engineering Fibrin-basierten Tissue Konstrukte
- Bereiten Silikonkleber durch Mischen des Elastomers mit dem Härter (10:1). Cut 7 x 3 mm rechteckige Segmente Klettverschluss. Kleben Sie das Klettband in einem 6-Loch-Zellkulturplatten mit flexiblen Membranen, eine Flanke zu bilden und einen eckigen Raum von 3 mm zwischen den Klettbändern verlassen.
- Trocknen der Silikonkleber über Nacht in einem Ofen bei 60 ° C, um Härtung des Klebers zu erreichen. Sterilisieren durch Zugabe von 70% EtOH in die Vertiefungen und Inkubation für 30 min. Spülen 3x mit PBS und entfernen Sie alle PBS aus der wells und der Klettverschluss. Setzen Sie unter UV für 30 min und bis zur Verwendung steril zu halten.
- Bereiten Tissue Engineering Medium (TM), bestehend aus GM und 130 mg L-Ascorbinsäure-2-Phosphat.
- 1 mg / ml ε-Aminocapronsäure (ACA) an die TM. ACA ist für den ersten 7 Tagen der Kultur verwendet, um das Fibrin aus erniedrigender 11 zu verhindern. Alternativ kann Aprotinin verwendet werden.
- Um Klumpenbildung zu verhindern, erlauben Fibrinogen auf Raumtemperatur vor dem Öffnen zu erreichen. Ohne Klumpen Fibrinogen wird leichter aufzulösen. Lösen Fibrinogen in einer Konzentration von 10 mg tatsächlichen Protein / ml TM 7 mit ACA ergänzt. Sterilfilter der Fibrinogen-Lösung, vielleicht mehrere Filter benötigt werden. Lagern auf Eis bis zum Gebrauch.
- Lösen Thrombin in einer Konzentration von 10 IU / ml TM 7 mit ACA ergänzt. Lagern auf Eis bis zum Gebrauch. </ Ol>
- Trypsinize die Zellen, in GM und zählen erneut zu suspendieren.
- Mit 15 x 10 6 Zellen / ml für die Aussaat die Fibrin-basierten Gewebe Konstrukte (Konzentration auf Methoden für das Tissue Engineering Herzklappen 7 basiert). Eine einzelne Gel besteht aus 100 ul gof el und damit von 1,5 x 10 6 Zellen. Setzen 1,5 x 10 6 Zellen in einem Zentrifugenröhrchen, was in vielen Zentrifugenröhrchen wie die Anzahl der Gele, die vorgenommen werden.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 xg für 7 min und den Überstand verwerfen. Die Zellen in 50 ul Thrombin. In 4 ul blau fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokugeln zu dieser Suspension. Setzen Sie 50 ul von Fibrinogen in einem Fläschchen. Verwenden Sie eine Pipette zur Aufnahme der 50 ul Thrombin mit Zellen. Erhöhen Sie die Lautstärke der Pipette zu 100 ul. Pipettieren Sie die 50 ul Lösung von Thrombin mitZellen in das Fläschchen mit Fibrinogen zu mischen die Thrombin und Fibrinogen, und nehmen die 100 ul Mischung.
- Pipettieren Sie die Gel-Gemisch in und zwischen den Klettbändern. Die typische Gelierzeit für die Fibrin-Gelen, wenn die Komponenten gemischt werden, ist in der Größenordnung von 20 Sekunden.
- Inkubieren Suspensionen für 30 min bei 37 ° C in einer befeuchteten 95% Luft / 5% CO 2-Inkubator, um die Gelierung bevor Kultur TM mit ACA ermöglichen.
- Ersetzen TM mit ACA alle 2-3 Tage für die ersten 7 Tage. Gele sind stabil genug, nach einer Woche ohne ACA kultiviert werden. Nach der ersten Woche ersetzen TM alle 2-3 Tage. In 6 ml TM pro Vertiefung. Am Tag 12 Zellen haben genügend Kollagen zur Visualisierung erzeugt.
- Statische Belastung wird von den Zellen direkt durch Zellen Traktion und Verdichtung 12 angelegt. Um Kollagen Reorganisation zu induzieren, schneiden das Gewebe konstruieren lose aus zwei Klettbändern in eine Richtung. Dies führt zu Einschränkungen unidirektionalen (1A). Führen Sie diese am Tag 12, da das Konstrukt dann stabil genug und Kollagen abgelagert worden.
- Anwenden zyklischen Beanspruchung durch Anlegen eines Vakuums an die Unterseite der Kulturplatten mit flexiblen Membranen unter Verwendung der Flexcell FX4000T System. Legen Sie die Platten auf einer Grundplatte, auf der Oberseite des Ladens Beiträge (die sind ein Teil der the zyklischer Belastung Gerät). Die Pumpe gilt ein Vakuum auf die Membran und damit zieht die Membran über dem rechteckigen Beitrag darunterliegenden. Durch die kreuzförmige Anhängen des Gewebes konstruiert, um die Membran (über den Klettverschluss) und die rechteckigen Beitrag die angelegte Spannung zyklisch uniaxial (1B).
- Zunächst verwenden statischer Kultur für 5 Tage zu anfänglichen mechanischen Integrität zu erreichen, vor dem Aufbringen der zyklischen Belastung beginnend am 6. Tag. Programm ein cyclisches Fleck Protokoll in der Steuerung für die Vakuumpumpe. Zum Beispiel mit einem vorher festgelegten intermittierenden zyklischen Belastung Protokoll, mit einachsigen Richtung 13. Diese besteht aus einer intermittierenden Dehnung einer Sinuswelle mit 1 Hz, Pressen von 0 bis 5% Dehnung für die Dauer von 3 Stunden bei 3 h Ruheperioden abwechseln. Führen Sie diese zyklische Belastung Protokoll für 7 Tage, Induktion einer Organisation ausgerichtet Kollagen.
- Typischerweise nach 12 Tagen HVSCs haben eine ausgerichtete Kollagen produziert organisaton. Nach einer ausgerichteten Kollagen Organisation erreicht wird, ändern die einachsigen zyklischen Belastung Richtung senkrecht zu der ursprünglichen Stamm Richtung. Tun Sie dies, indem Sie die rechteckigen Beiträge von 90 °.
- Um eine aktive Echtzeit-Kollagen Umbau, Label Proben mit Sonden, die nicht mit der Lebensfähigkeit der Zellen oder die Bildung von Kollagen nicht stören zu visualisieren. Verwenden Sonden fluoreszierend Fleck Zytoplasma der Zelle und Kollagen.
- Alternativ Erzeugung der zweiten Harmonischen mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet werden, um Kollagen-Strukturen mit Autofluoreszenz 14, mit einer Anregung bei 780 nm und Detektion zwischen 500-550 nm zu visualisieren.
- Entfernen Sie die Kultur Platten aus dem Setup und dem Inkubator, der zyklisch gespannten Proben während der 3 Stunden Ruhezeit, und transportieren sie zu einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, um Zellen und Kollagen zu visualisieren.
Hinweise: Verwenden Sie nur die weiche Seite des Velcro und das Gesicht dieser Seite nach oben. Beim Verkleben der Klettverschluss, decken nur den Klettverschluss mit Silikon kleben, kleben nicht im ganzen gut verteilt. Da die Kultur Platten Siliconmembran Böden haben, verwenden Sie etwas unterhalb des Well-Platte zur Verstärkung der flexiblen Membranen, leicht zu kleben, um die Platte zu gewährleisten.
Hinweis: Um Fibrinogen vorsichtig mischen auflösen zu viel Schaumbildung verhindern.
Hinweis: Lagerung auf Eis benötigt wird, um früh Gelierung von Thrombin und Fibrinogen zu verhindern.
Hinweis: Das fluoreszierende Polystyrol-Mikrokügelchen als interne Referenz-Markierungen zur Bildanalyse verwendet wird. Beim Mischen von Thrombin und Fibrinogen, verhindern die Bildung von Luftblasen durch vorsichtiges Pipettieren der Mischung. Luftblasen in Löcher im Fibringel führen.
Anmerkungen: Tun Sie dies so schnell wie möglich, um die Gelierung zu verhindern, bevor die Mischung in der Well-Platte pipettiert. Üben Sie vor Verwendung von Zellen und Perlen.
3. Anwenden von Stamm und Inducing Änderungen in Stamm und Constraints
4. Visualisierung von Zellen und Collagen
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Representative Results
Dieses Modell ermöglicht zum Kultivieren Myofibroblasten ausgesät Fibringele. 1A zeigt ein Gewebe zunächst unter statischen Bedingungen biaxial kultiviert. Tissue-Einschränkungen werden durch Schneiden der Fibringel aus zwei Einschränkungen freigegeben, um statische einachsige Zwänge schaffen und Gewebe verdichtet und danach umbaut (Abbildung 1A). Für zyklische Belastung wird das Gewebe unter statischen Bedingungen kultiviert biaxial sowie. Nach 5 Tagen cyclischen uniaxiale Verformung aufgebracht (Fig. 1B) werden. Kollagen Neuausrichtung induzieren kann uniaxiale Verformung Richtung auf die senkrechte Richtung (1B) geändert werden. Die Mikrosphären ausgesät mit dem Gel-Mischung, die Anzeige eines zufälligen Muster, die verwendet werden, um vordefinierte Standorte für Zeitraffer-Aufnahmen verlagern wird (Abbildung 2). 2A und 2C ein Bild von Zellen, Kollagen und Perlen zeigen. Die gleichen Bilder werden 3 Tage (Figur gescannte 2B) und 2 Tage (2D) später auf. Zellen und Kollagen Muster haben sich geändert, aber Kornmuster werden verwendet, um die Zellen und Kollagen zu verlagern. Kultivieren Proben für 12 Tage Ergebnisse der endogenen Produktion von Kollagen in ausreichenden Mengen visualisiert werden konfokale Mikroskopie (3 und 4). Verwendung entweder statisch oder cyclische Kultur ergibt deutlich unterschiedliche Kollagen Organisation, in biaxialen statischen Kultur führt zu einer zufälligen Kollagen Organisation (3A) und einachsigen zyklischen Belastung aufgebracht, um eine biaxial eingeschränkt Gewebe führt zu einer ausgerichteten Kollagen-Struktur (Fig. 4A und B) . Diese Kollagen Organisation kann im Laufe der Zeit untersucht werden, während Sie die statische Einschränkungen oder Änderung der zyklischen Belastung Richtung. Bei statischen Einschränkungen werden von zweiachsigen zu einachsigen, Kollagen Orientierung ändert sich von einer zufälligen Orientierung (3A geändert) Zu einer ausgerichteten Orientierung (Abbildung 3B). Zyklische Belastung induziert eine Änderung der Orientierung an der Oberfläche des Gewebes (Fig. 4A und C), aber nach 3 Tagen, keine Änderung in dem Kern des Gewebes beobachtet (Fig. 4B und D).
Abbildung 1. Konstrukte unter biaxialen Einschränkungen verwendet werden, um Kollagen durch (A) Lösen statischen Bedingungen in einer Richtung neu kultiviert, oder durch (B) ändernden zyklischen Belastung Richtung. Loading Beiträge gestrichelte schwarze Linien angedeutet. Maßstab Balken zeigen 3 mm.
Abbildung 2. Typische Beispiel für die Verwendung von Perlen Muster vorgegebenen Stellen in 3D zu verlagern, in diesem Fall in statischkultivierten Proben. Zellen werden in rot, grün und Kollagen in Perlen in blau dargestellt. A und C zeigen ein Bild von Zellen, Kollagen und Perlen. Diese Bilder werden 3 Tage (B) und 2 Tage (D) später gescannt sind. Bead Muster werden verwendet, um Zellen und Kollagen zu verlagern. Maßstab Balken zeigt 50 um.
Abbildung 3. R epräsentativer Bilder der 12 Tage statische Belastung mit zweiachsigen Zwänge (A) und Neuausrichtung durch einachsige Einschränkungen innerhalb von 7 Tagen (B). Maßstab Balken zeigt 50 um.
Abbildung 4. Repräsentative Bilder nach 12 Tagen (5 Tage statisch, gefolgt von 7 Tagen zyklischen Belastung gefolgt) für die zyklische Belastung an der Oberfläche (A) Und ~ 60 um in das Gewebe (B). Nach der Änderung des zyklischen Belastung Richtung (nach 12 Tagen), an der Oberfläche Zellen und Kollagen umorientieren (C) aber keine Änderungen in den Kern des Gewebes (T) gesehen nach dem 3 Nächte.
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Discussion
Das beschriebene Modell System der Zelle besiedelten Fibrin-Konstrukte hat ein großes Potenzial für die Untersuchung von Zell-und Kollagen (Re-) Organisation (de Jonge et al. 15), z. B. für das Tissue Engineering verwendet werden. Durch die Verwendung von Fibrin als anfängliche Zellträgers nach Fibrinabbauprodukten wird ein Gewebe mit Zellen und endogenen Matrix nur erstellt. Auf diese Weise werden die Zellen stimuliert, um auf Stress reagieren, entweder statisch oder zyklischer Natur, indem Kontraktionskräfte 16,17, Erfassen Grenze Steifigkeit 12, oder die Anzeige Stamm Vermeidung.
Bedeutung: Fibrin-Konstrukte verwendet wurden, bevor Kollagen (Re-) Organisation 18 studieren, aber nicht mit der Fähigkeit der Anwendung zyklischer Belastung und / oder Studium der Konstrukte in einem Zeitraffer-Weise, die beide möglich sind in diesem Verfahren vorgestellt. Die Klettverschlüsse, die die Einschränkungen bieten in diesem Modell-System haben vor 19 verwendet wurde,aber die Kombination dieses Verfahrens mit Kulturplatten mit flexiblen Membranen ermöglicht zyklische Belastung über längere Zeit anwenden. Kultivierung in diesen Platten ermöglicht einfache Hinzufügen und Entfernen von mittleren und Visualisierung der Konstrukte während noch anhaftendem und steril. Dies ermöglicht das Studium relevant Umbauprozesse zeitversetzt oder sogar in Echtzeit.
Änderungen und zukünftige Anwendungen: Zukünftige Anwendungen des Systems können in die Manipulation der 3D-Remodeling-Prozess, zum Beispiel durch Zugabe von Metalloproteinasen oder Agenten, die mit der Montage oder Integrin Signalisierung stören gefunden werden. Neben der Anwendung von Zusatzstoffen lassen sich die Komponenten des Modells System leicht modifiziert werden, wenn das Studium Zelle und Kollagen (Re) Organisation. Verschiedene Zellquellen, gesunden und kranken Zellen, die Laufzeit der Kollagen-Matrix (zB durch Variation Kulturzeit) und die Form und Größe des Konstrukts an spezifische Bedürfnisse angepasst werden. Das System ist auch sUited für andere Quellen Zelle anstelle der gegenwärtig verwendeten HVSCs. Wir haben bereits dieses System zu Kultur endothelialen koloniebildenden Zellen verwendet (ECFCs; PlosOne, zur Veröffentlichung angenommen), wo wir feststellen, dass ECFCs orientieren ihre Kollagen produziert anders auf zyklische Belastung als HVSCs.
Einschränkungen der Technik: Eine Begrenzung des aktuellen Modells ist die relativ große Größe der Gewebe erfordern 1,5 x 10 6 Zellen pro Konstrukt bei Verwendung einer Zelldichte von 15 x 10 6 Zellen / ml. Dies kann ein Problem darstellen, in Fällen, in denen weniger verfügbar Zelle Quellen verwendet werden. Eine weitere Einschränkung ist die aktuelle Dicke der Konstrukte (ca. 1 mm), die aufgrund der (dick) Klettverschlüsse ist. Dies begrenzt die konfokalen auf nur einen Teil der gesamten Probe. Es ist möglich, eine Tiefe von max 200 um in das Gewebe, die genug, um zelluläre Reaktionen im Kern der aktuellen Gewebe zu visualisieren ist zu erreichen, aber tunes nicht in einem vollen Dicke Übersicht führen.
Kritische Schritte und Fehlerbehebung: Da das Modell, das auf der Bildung von Gewebe zwischen den Klettverschluss Punkte basiert, dies umfasst auch die kritischen Schritte im Protokoll. Richtiges Schneiden und Kleben ist unerlässlich und sollte besonderes Augenmerk auf die sorgfältige Pipettieren des Gels Mischung in den Klettbändern zur ordnungsgemäßen Befestigung des Gewebes, die von entscheidender Bedeutung für die Anwendung zyklischer Belastung ist zu zahlen. Ferner bestimmende Schritte können bei der Auswahl der Zelle Quelle und Medium Zusatzstoffe finden. Die Optimierung wird benötigt, wenn Kultivierung mit einer anderen Zelle Quelle werden. Derzeit sind Konstrukte mit ACA für 7 Tage kultiviert, um das Fibrin aus erniedrigender stoppen. Eine andere Zell-Quelle kann auch in einem anderen Zeitrahmen sowohl im Hinblick auf die Bildung von Kollagen und Fibrin-führen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde im Rahmen des Forschungsprogramms der biomedizinischen Materialien (BMM) Institut durchgeführt. BMM wird vom niederländischen Ministerium für Wirtschaft, Landwirtschaft und Innovation kofinanziert. Der finanzielle Beitrag der Nederlandse Hartstichting gedankt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
