Summary
Este modelo de sistema começa a partir de um gel de fibrina miofibroblastos povoada que pode ser usado para estudar colagénio endógeno (re) organização em tempo real de uma forma não destrutiva. O modelo de sistema é muito sintonizável, como ele pode ser usado com diferentes fontes de células, aditivos médio, e pode ser facilmente adaptada às necessidades específicas.
Abstract
Conteúdo de colágeno e organização no desenvolvimento de tecidos de colágeno pode ser influenciada por cepas do tecido local e restrição dos tecidos. Engenheiros de tecidos pretendem usar esses princípios para criar tecidos com arquiteturas de colágeno pré-definidos. A plena compreensão dos processos subjacentes exatas de remodelação do colágeno para controlar a arquitetura do tecido final, no entanto, é inexistente. Em particular, pouco se sabe sobre a orientação a (re) das fibras de colagénio, em resposta a alterações nas condições de carga mecânica dos tecidos. Nós desenvolvemos um sistema em modelo in vitro, que consiste em biaxialmente limitados miofibroblastos semeado construções de fibrina, para elucidar ainda mais colágeno (re) orientação em resposta ao i) reversão biaxial para condições de carga estática uniaxiais e ii) carga cíclica uniaxial do biaxialmente constrangido construções, antes e depois de uma mudança de direcção de carga, com a utilização do dispositivo de carregamento FX4000T Flexcell. Time-lapse confocal de imagem é utilizado para visualize colagénio (re) orientação de uma maneira não destrutiva.
Organização celular e colágeno nas construções podem ser visualizados em tempo real, e um sistema de referência interna nos permite mudar as células e estruturas de colágeno para a análise de lapso de tempo. Vários aspectos do sistema do modelo podem ser ajustados, como fonte de células ou a utilização de células saudáveis e doentes. Aditivos podem ser utilizados para elucidar os mecanismos subjacentes a remodelação do colagénio, por exemplo, por adição de MMPs ou bloqueio integrinas. A forma eo tamanho da construção pode ser facilmente adaptada para necessidades específicas, resultando em um sistema modelo altamente ajustável para o estudo de células e colagénio (re) organização.
Introduction
Tecidos cardiovasculares têm uma função de suporte de carga de destaque. Em particular, o conteúdo ea organização das fibras de colágeno na matriz extracelular contribuem para as propriedades de suporte de carga e dominar a força do tecido total 1. Na engenharia de tecidos condicionado mecânica da construção é usada - geralmente constituídos por (cíclica) regimes esforçando - para melhorar a organização do tecido e propriedades mecânicas 2,3. Entendimento completo da organização do colagénio induzida por deformação em geometrias complexas para criar tecidos tecidos de colagénio com uma arquitectura predefinida ainda não foi alcançada. Isto é principalmente devido ao nosso conhecimento limitado de remodelação do colágeno nos tecidos em desenvolvimento. Modelos existentes, principalmente, dar informações sobre o resultado líquido final de remodelação do colágeno com o uso de pressão estática 4-6. Aqui nós fornecemos um sistema modelo altamente ajustável que permite o estudo da organização do colagénio (re) de uma forma em tempo real, em 3D, sob influênciada estirpe estático ou cíclico. As construções de tecido são à base de fibrina, assegurando que toda colagénio no construto é endógena. Organização celular e colágeno nas construções é visualizado, e um sistema de referência interna nos permite mudar as células e estruturas de colágeno para a análise de time-lapse. Neste protocolo, iremos descrever o uso do sistema de modelo de veia safena Humanos Células (HVSCs), uma vez que estas células são conhecidos pela sua produção aumentada de matriz extracelular e capacidade para remodelar a matriz e a utilização conhecida em engenharia de tecidos cardiovasculares 7, baseado na obra de Jonge et al. oito
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Protocol
1. Cultura de células humanas veia safena
- Isolar células da veia safena magna, adquirido a partir de um doador de acordo com as orientações para utilização de material secundário, de acordo com o protocolo de Schnell et ai. 9 e armazená-las em azoto líquido. A partir da parte da veia safena magna peças cortadas a partir de um doador de 2 x 2 mm a cultura numa placa de seis poços. Use dois pedaços por poço. Geralmente, as células podem ser obtidas suficientes para encher frascos com cerca de 3 0,25 x 10 6 células em azoto líquido. HVSCs são caracterizados como miofibroblastos, mostrando a expressão de vimentina, sem expressão da desmina e uma subpopulação expressando α actina de músculo liso 10. Ainda iniciar o protocolo para descongelar as células a partir do azoto líquido para aumentar o número de células.
- Colocar as células a partir de um frasco para dentro de um frasco de cultura de tecido T75 e adicionar meio de crescimento (GM), consistindo de DMEM avançada, 50 ml de soro fetal bovino (FBS), 5 mL de penicilina /estreptomicina e 5 ml de L-Glutamax. Mudar meio cada 2-3 dias.
- Células crescem confluente aproximadamente após 14 dias. Loja 0,5 x 10 6 células num frasco em azoto líquido, referido como uma passagem.
Nota: Congelamento das células não é necessária quando a colheita HVSCs, mas é usado apenas para armazenamento.
- Coloque os HVSCs de um frasco em frasco de cultura de um T175 tecido e adicione GM. Mudar meio cada 2-3 dias. Células crescem confluentes após cerca de 7 dias. Loja 3 x 10 6 células em um frasco em nitrogênio líquido, conhecido como passagem 2.
- Coloque as células de um frasco em uma rollerbottle e adicione GM. Mudar meio cada 2-3 dias. Células crescem confluente aproximadamente após 8 dias. Uma rollerbottle contém cerca de 20-30 x 10 6 células. Células de cultura até a passagem 6. Não usar células de uma passagem superior a passagem 9, uma vez que o fenótipo celular pode mudar. 2. Engenharia de construções de tecido à base de Fibrina
- Prepare a cola de silicone por mistura do elastómero com o agente de cura (10:1). Corte 7 x 3 segmentos retangulares mm de velcro. Cole o velcro em uma placa de cultura de 6 bem, com membranas flexíveis para formar uma cruz, e deixar um espaço quadrado de 3 mm entre as tiras de velcro.
- Seca-se a cola de silicone durante a noite num forno a 60 ° C para assegurar o endurecimento da cola. Esterilizar por adição de EtOH a 70% aos poços e incubar durante 30 min. Lavar 3x com PBS e remover todo o PBS do wells eo velcro. Colocar sob UV, durante 30 minutos e mantenha estéril até à sua utilização.
- Prepara meio de Engenharia de Tecidos (TM), que consiste em GM e 130 mg de ácido L-ascórbico 2-fosfato.
- Adicionar 1 mg / mL de ácido amino-capróico ε (ACA) para o TM. ACA é utilizado para os primeiros 7 dias de cultura para evitar a degradação de fibrina a partir de 11. Alternativamente, a aprotinina pode ser usado.
- Para evitar a formação de touceira, permitir fibrinogênio atingir a temperatura ambiente antes de abrir. Sem aglomerados fibrinogénio irá dissolver mais facilmente. Dissolve-se o fibrinogénio com uma concentração de 10 mg real de proteína / ml TM 7 suplementado com ACA. Filtro estéril a solução de fibrinogênio, vários filtros podem ser necessários. Guarde em gelo até o uso.
- Dissolve-se trombina para uma concentração de 10 Ul / ml TM 7 suplementado com ACA. Guarde em gelo até o uso. </ Ol>
- Trypsinize as células, ressuspender em GM e contagem.
- Usar 15 x 10 6 células / ml para semear as construções de tecido à base de fibrina (concentração com base em métodos de engenharia de tecidos de válvulas cardíacas 7). Um único gel consiste em 100 ul de gof el e, assim, de 1,5 x 10 6 células. Colocar 1,5 x 10 6 células num tubo de centrífuga, resultando em tantos tubos de centrifugação como o número de geles que serão feitas.
- Centrifugar as células a 350 xg durante 7 minutos e descarta-se o sobrenadante. Ressuspender as células em 50 ul de trombina. Adicionar 4 ml de azul fluorescente microesferas de poliestireno a esta suspensão. Colocar 50 mL de fibrinogénio num frasco. Usar uma pipeta para assumir a trombina 50 uL de células. Aumento do volume da pipeta de 100 uL. Pipete 50 pi da solução de trombina comcélulas no frasco com o fibrinogênio para misturar a trombina eo fibrinogênio, e levar até a mistura de 100 ml.
- Pipeta a mistura de gel dentro e entre as tiras de velcro. O tempo típico para a gelificação do gel de fibrina, uma vez que os componentes são misturados, é da ordem de 20 segundos.
- Incubar as suspensões durante 30 minutos a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% / 5% de CO 2 incubadora para permitir a gelificação antes de adicionar a cultura TM com ACA.
- Substitua TM com ACA cada 2-3 dias para os primeiros 7 dias. Géis são estáveis o suficiente depois de uma semana a ser cultivadas sem ACA. Depois da primeira semana TM substitua cada 2-3 dias. Adicionar 6 ml de TM por poço. No dia 12 células produziram colágeno suficiente para visualização.
- Estirpe estático é aplicado directamente pelas células, devido à tracção e célula de compactação 12. Para induzir a reorganização do colágeno, cortar o tecido construir solta de duas tiras de velcro em uma direção. Isto resulta em limitações unidireccionais (Figura 1A). Executar esta no dia 12, uma vez que a construção é então suficientemente estável e colagénio tenha sido depositado.
- Aplicar a tensão cíclica mediante a aplicação de vácuo ao fundo das placas de cultura com membranas flexíveis, com a utilização do sistema FX4000T Flexcell. Colocar as placas em uma placa de base, em cima dos postos de carregamento (que são uma parte do diae dispositivo de carga cíclica). A aplica-se uma bomba de vácuo sobre a membrana e, assim puxa a membrana sobre o posto rectangulares encontra-se por baixo. Devido aos elementos de montagem em forma de cruz no tecido constrói à membrana (por intermédio do velcro) e o posto rectangulares da estirpe cíclico aplicado é uniaxial (Figura 1B).
- Inicialmente, usar cultura estática, durante 5 dias para atingir a integridade mecânica inicial, antes da aplicação da estirpe cíclico, começando no dia 6. Programa de um protocolo de mancha cíclico para o controlador para a bomba de vácuo. Por exemplo, usar um protocolo estirpe cíclico intermitente previamente estabelecida, com o sentido 13 uniaxial. Este é constituído por uma estirpe intermitente de uma onda sinusoidal com uma Hz, esticando de 0 a 5% de deformação, por períodos de 3 horas, alternadas com períodos de descanso 3 hr. Realizar esse protocolo tensão cíclica por 7 dias, induzindo uma organização de colágeno alinhados.
- Tipicamente, após 12 dias HVSCs ter produzido uma organizatio colagénio alinhadosn. Depois de uma organização do colagénio alinhado é atingido, mudar a direcção de tensão uniaxial cíclico, para ser perpendicular à direcção da tensão inicial. Para fazer isso, transformando os cargos retangulares em 90 °.
- Para visualizar ativa, remodelação do colágeno em tempo real, as amostras de etiquetas com sondas que não interferem com a viabilidade das células ou a formação de colágeno. Use sondas de mancha fluorescente do citoplasma da célula e colágeno.
- Alternativamente segunda geração harmónica utilizando a microscopia confocal a laser pode ser usada para visualizar as estruturas de colagénio utilizando autofluorescência 14, com excitação a 780 nm e entre 500-550 nm de detecção.
- Retire as placas de cultura a partir da configuração e da incubadora, para as amostras ciclicamente tensas durante o período de descanso de 3 horas, e transportá-los para um microscópio de varredura a laser confocal para visualizar as células e colágeno.
Notas: Só use o lado macio do velcro e enfrentar este lado para cima. Ao colar o velcro, apenas cobrir o velcro com cola de silicone, não espalhe cola por todo o bem. Uma vez que as placas de cultivo têm fundo da membrana de silicone, usar algo debaixo da placa bem para reforçar as membranas flexíveis, para assegurar a facilidade de colagem para a placa.
Nota: Para dissolver mistura de fibrinogénio com cuidado para evitar a formação de espuma muito.
Nota: Armazenamento em gelo é necessário para evitar a gelificação precoce de trombina eo fibrinogênio.
Nota: A fluorescente microesferas de poliestireno são utilizados como marcadores de referência internos para análise de imagem. Quando a mistura de trombina e fibrinogénio, evitar a formação de bolhas de ar, pipetando cuidadosamente a mistura. As bolhas de ar resultará em furos no gel de fibrina.
Notas: Para fazer isso, o mais rapidamente possível para evitar a gelificação antes da mistura é pipetados na placa bem. Pratique antes de usar células e miçangas.
3. Aplicando tensão e induzir mudanças no Strain e Restrições
4. Visualizando Células e colágeno
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Representative Results
Este modelo de sistema permite a cultura myofibroblast-semeados gel de fibrina. Figura 1A mostra um tecido cultivado pela primeira vez sob restrições biaxiais estáticas. Constrangimentos de tecido são libertadas por corte do gel de fibrina a partir de duas restrições, para criar restrições estáticas uniaxiais e compacta do tecido e remodela depois (Figura 1A). Para estirpe cíclico, o tecido é cultivada sob constrangimentos biaxiais estáticos também. Após 5 dias de tensão uniaxial cíclico pode ser aplicado (Figura 1B). Induziu-se a reorientação do colagénio, a direcção de tensão uniaxial pode ser mudada a direcção perpendicular (Figura 1B). As microesferas semeado com a mistura de gel, exibir um padrão aleatório, a qual é utilizada para reposicionar locais predefinidos para lapso de tempo de imagem (Figura 2). Figuras 2A e 2C mostram uma imagem de células, o colagénio e esferas. Essas mesmas imagens são digitalizadas 3 dias (Figure 2B) e 2 dias (Figura 2D), mais tarde, respectivamente. Células de colágeno e padrões mudaram, mas os padrões de contas são usadas para mudar as células e colágeno. As amostras de cultura durante 12 dias resulta na produção de colagénio endógeno em quantidade suficiente para ser visualizada por microscopia confocal (figuras 3 e 4). Utilizando qualquer um dos resultados de cultura estática ou cíclico na organização do colagénio distintamente diferente, onde a cultura estática biaxial dá origem a uma organização do colagénio aleatório (Figura 3A) e estirpe cíclico uniaxial aplicada a um biaxialmente constrangidos resultados tecido numa estrutura de colagénio alinhados (Figuras 4A e B) . Esta organização do colagénio pode ser estudado ao longo do tempo, durante a substituição das restrições estáticas ou mudando a direcção estirpe cíclico. Quando constrangimentos estáticos são alteradas de biaxial para uniaxial, alterações de orientação de colagénio a partir de uma orientação aleatória (Figura 3A) Para uma orientação alinhada (Figura 3B). Estirpe cíclico induz uma mudança de orientação na superfície do tecido (Figuras 4A e C), mas após 3 dias, sem mudança no núcleo do tecido é observada (Figuras 4B e D).
Figura 1. Construções cultivadas sob restrições biaxiais, usados para reorganizar o colágeno por (A) liberar restrições estáticas em uma direção, ou (B) mudando de direção tensão cíclica. Carregando mensagens são indicados por linhas pretas pontilhadas. Barras de escala indicam a 3 mm.
Figura 2. Um exemplo típico do uso de padrões de grânulo para realocar locais predefinidos em 3D, no presente caso na estaticamenteamostras cultivadas. células são mostrados em vermelho, o colágeno em verde e contas em azul. A e C mostram uma imagem de células, colágeno e miçangas. Estas imagens são digitalizadas 3 dias (B) e dois dias (D), mais tarde, respectivamente. Padrões de contas são usadas para mudar as células e colágeno. Barra de escala indica 50 mm.
Figura 3. Epresentative R imagens de 12 dias de tensão estática com constrangimentos biaxial (A) e, devido a limitações de reorientação uniaxiais dentro de 7 dias (B) de barras. Escala indica 50 um.
Figura 4. Imagens representativas Após 12 dias (5 dias estáticas, seguido por 7 dias estirpe cíclico) para a estirpe cíclico na superfície (A) E ~ 60 um para o tecido (B). Após uma mudança de direcção estirpe cíclico (após 12 dias), as células da superfície e colagénio reorientar (C), mas não há mudanças são vistas no núcleo do tecido (D) após 3 dias.
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Discussion
O sistema modelo descrito de construções de fibrina por células povoadas tem um grande potencial para o estudo de células e colagénio (re) organização (De Jonge et ai. 15), por exemplo, para ser utilizado para fins de engenharia de tecidos. Ao usar fibrina, como o transportador inicial da célula, depois da degradação da fibrina, um tecido é criado com apenas células e matriz endógena. Desta forma, as células são estimuladas para reagir à tensão, estático ou de natureza cíclica, pela aplicação de forças contrácteis 16,17, limite de detecção de 12 rigidez, ou exibindo evitação estirpe.
Significado: construtos de fibrina têm sido usados para estudar antes de colagénio (re) organização de 18, mas não com a capacidade de aplicação de pressão cíclica e / ou estudar as construções de um modo de lapso de tempo, ambos os quais são possíveis neste método apresentado. As tiras de velcro que fornecem as limitações no presente sistema modelo foram usados antes de 19,mas combinar esta técnica com placas de cultura com membranas flexíveis permite aplicar estirpe cíclico, por períodos prolongados de tempo. A cultura nestas placas permite a fácil adição e remoção do meio e visualização das construções enquanto ainda aderente e estéril. Isto permite estudar os processos de remodelação relevantes tempo decorrido, ou mesmo em tempo real.
Modificações e futuras aplicações: aplicações futuras do sistema pode ser encontrado em manipular o processo de remodelação 3D, por exemplo, a adição de metaloproteinases ou agentes que interferem com a integrina montagem ou de sinalização. Alem da aplicação de aditivos, os componentes do sistema de modelo pode ser facilmente modificado quando se estudam células e colagénio (re) organização. Diferentes fontes de células, as células saudáveis e doentes, a maturidade da matriz de colágeno (por exemplo, através da variação do tempo de cultura), ea forma e tamanho da construção pode ser adaptado às necessidades específicas. O sistema é bem sUited para outras fontes de células, em vez das HVSCs actualmente utilizadas. Nós já usamos este sistema para cultura de células endoteliais formadoras de colônias (ECFCs; PlosOne, aceito para publicação), onde observamos que ECFCs orientar sua produção de colágeno de forma diferente sobre a tensão cíclica que HVSCs.
As limitações da técnica: Uma limitação do actual sistema modelo é a dimensão relativamente grande dos tecidos, requerendo 1,5 x 10 6 culas por construto quando usando uma densidade de células de 15 x 10 6 células / ml. Isso pode representar um problema nos casos em que serão utilizadas fontes de células menos disponíveis. Outra limitação é a espessura atual das construções (aproximadamente 1 mm), o que é devido aos (espessura) anexos de velcro. Isto limita o confocal de varredura de apenas uma porção da totalidade da amostra. É possível atingir uma profundidade de no máximo 200 um, no tecido, o que é suficiente para visualizar as respostas celulares dentro do núcleo dos tecidos correntes, mas fazeres não resultar numa síntese de espessura completa.
Passos críticos e resolução de problemas: Como o sistema de modelo é baseado na formação de tecido entre os pontos de fixação Velcro, isto também engloba os passos críticos no protocolo. Correta de corte e colagem é essencial e especial atenção deve ser dada à pipetagem cuidadosa da mistura de gel para as tiras de velcro para fixação adequada do tecido, que é crucial para a aplicação de tensão cíclica. Outros passos determinantes podem ser encontrados na escolha da fonte de células e os aditivos médios. Optimização será necessário quando a cultura de células com uma origem diferente. Atualmente, construções são cultivadas com ACA por 7 dias, para parar a fibrina se degrade. Uma fonte de célula diferente também pode resultar em um tempo diferente no que diz respeito a ambos a formação de colágeno e degradação de fibrina.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi realizado no programa dos materiais biomédicos (BMM), instituto de pesquisa. BMM é cofinanciado pelo Ministério Holandês de Assuntos Econômicos, Agricultura e Inovação. A contribuição financeira da Hartstichting Nederlandse é reconhecido agradecimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
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