肌成纤维细胞和约束的应用工程纤维蛋白的​​组织结构和应变诱导细胞和胶原蛋白（RE）组织

Summary

这个模型系统开始从填充的成肌纤维细胞的血纤维蛋白凝胶，可用于研究内源性的胶原蛋白（重）非破坏性的方式组织实时。系统的模型是非常可调谐的，因为它可以用不同的细胞来源，培养基添加剂，可以容易地适应具体需要。

Abstract

在开发胶原组织的胶原蛋白含量和组织可以影响局部组织的菌株和组织约束。组织工程师的目标是利用这些原则来创建与预定义的胶原蛋白结构组织。胶原重构，以控制最终的组织结构的确切相关的过程的充分理解，但是，是缺乏的。特别是（重新）胶原纤维的方向响应在组织机械负荷条件的变化知之甚少。我们开发了一个体外模型系统，包括双向约束肌成纤维细胞的种子纤维蛋白结构，进一步阐明胶原蛋白（重）响应我的方向）恢复双轴单轴静载荷条件及ii）循环单轴载荷双向约束在装载方向，使用FLEXCELL FX4000T装载装置之前和之后的变化的构造。时间推移共聚焦成像到visualize胶原蛋白（重新）方向，一个非破坏性的方式。

细胞和胶原组织中的构造可以进行实时可视化，和一个内部参考系统使我们能够移居时间推移分析细胞和胶原结构。可以调整的模型系统的各个方面，如健康和患病细胞的细胞来源或使用。可以使用添加剂，以进一步阐明相关机制胶原重构，例如，通过添加蛋白酶或阻断整合。该构建体的形状和大小可以很容易地适应特定需要的，从而导致在一个高度可调的模型系统来研究细胞和胶原蛋白组织（重）。

Introduction

心血管组织有一个突出的承载功能。在特定的内容和组织中的细胞外基质的胶原纤维向承重性能和支配整体组织强度^1。在组织工程机械空调的构造被使用-通常包括（循环）使劲方案是-以增强组织的组织和机械性能^2,3。充分的了解应变诱导胶原蛋白组织创建与预定义的胶原蛋白结构的组织的复合组织的几何形状还没有被实现。这主要是由于我们有限的知识，在发展组织的胶原蛋白的重塑。现有的车型主要使用静态应变^4-6胶原重塑，最终净结果信息。在这里，我们提供了一个高度可调的模型系统，它允许在一个实时的方式，在三维胶原蛋白（重）组织的研究，受到影响的情况下的静态或环状的应变。组织结构的纤维蛋白为主，确保所有构造中的胶原蛋白是内源性的。在构建体的细胞和胶原组织的可视化，和一个内部参考系统使我们能够移居时间推移分析细胞和胶原结构。在这个协议中，我们将描述人类腔小隐的细胞（HVSCs），因为这些细胞被称为增强细胞外基质生产和改造能力在工程心血管组织⁷矩阵和我们既定的用途，根据使用的模型系统的容格等^[8]的工作

Protocol

1。文化人类腔小隐细胞

1. 隔离腔小隐蚤，根据二次使用材料的指引从供体获得，根据协议等施耐尔⁹细胞，并储存在液氮中。从2×2毫米在6孔板培养一个捐助者的裁片的部分小隐静脉蚤。使用2枚，每口井。一般来说足够的细胞可以得到以填补约3瓶0.25×10 ⁶个细胞在液氮中。的HVSCs的特点是肌纤维母细胞，显示波形蛋白，不表达结蛋白和亚群表达α平滑肌肌动蛋白^10的表达。下一次启动的协议从液氮中解冻的细胞，细胞的数量增加。
2. 成的T75组织培养瓶，将细胞从一个小瓶，加入生长培养基（GM），包括先进的DMEM培养液，5毫升，50毫升胎牛血清（FBS），青霉素/链霉素和5毫升L-的glutamax的。更改介质每隔2-3天。
3. 细胞生长汇合后约14天。存储0.5×10 ⁶细胞在一个小瓶在液氮中，简称为通道1。

注：冻结的细胞是没有必要的收获时HVSCs，但仅用于存储。

4. 从一小瓶将HVSCs，成T175组织培养瓶，并添加GM。更改介质每隔2-3天。细胞生长汇合后约7天。商店3×10 ⁶细胞在液氮中在一个小瓶中，简称为通道2。
5. 将细胞从一个小瓶到rollerbottle中添加GM。更改介质每隔2-3天。细胞生长汇合后约8天。一个rollerbottle包含约20-30×10 ⁶细胞。培养细胞通过6。不要使用高于9代细胞的一个通道，因为可能会改变细胞的表型。
2。工程纤维蛋白为基础的组织结构
1. 准备有机硅胶与固化剂（10:1）混合的弹性体。切7×3毫米的矩形段的魔术贴。胶魔术贴到6孔培养板中，以形成交叉，并且留下为3毫米的方形空间的维可牢尼龙搭扣带之间的柔性膜。

注：仅使用软边魔术贴面对这一侧向上。魔术贴粘合时，只覆盖魔术贴，硅胶胶水，不扩散以及整个胶。由于文化板块有硅膜的底部，使用的东西孔板下方增强柔性膜，以确保易于胶合板。

2. 聚硅氧烷胶在60℃的烘箱中过夜干燥，以确保胶的硬化。孔中并孵育30分钟，加入70％乙醇消毒。用PBS冲洗3次，并删除所有PBS从WELLS和魔术贴。认在紫外光下30分钟，并保持无菌状态，直到使用。
3. 准备组织工程介质（商标），由转基因和130毫克的L-抗坏血酸-2 - 磷酸。
4. 添加1毫克/毫升的ε-氨基己酸（ACA）的TM。 ACA是用于文化的第7天，以防止纤维蛋白降解^11。或者，可以使用抑肽酶。
5. 为了防止丛形成，使纤维蛋白原开幕前达到室温。无团块纤维蛋白原会更容易溶解。溶解纤维蛋白原的浓度为10 mg蛋白/ ml实际TM ⁷辅以ACA。无菌过滤纤维蛋白原的解决方案，可能需要多个过滤器。贮存，直到用冰。

注：溶解纤维蛋白原，轻轻混匀，以防止过 ​​多的泡沫形成。

6. 凝血酶溶解的浓度为10国际单位/毫升TM ⁷辅以ACA。贮存，直到用冰。
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注意：在冰上存储需要，以防止早期凝胶化，凝血酶和纤维蛋白原。

7. 胰蛋白酶消化细胞，重悬在通用和计数。
8. 使用15×10 ⁶个细胞/ ml，用于播种的血纤维蛋白为基础的组织结构（浓度根据用于组织工程心脏瓣膜^7的方法）。包括一个单一的凝胶100微升GOF埃尔，从而为1.5×10 ⁶细胞。将1.5×10 ⁶个细胞在一个离心管中，在尽可能多的离心管中，将要进行的凝胶数量。
9. 离心机的细胞在350×g离心7分钟，弃上清。细胞重悬在50μl的凝血酶。 4微升的蓝色荧光聚苯乙烯微球添加这种悬挂。将50微升纤维蛋白原在一个小瓶。用吸管取50微升细胞凝血酶。增加至100μl的体积移液管。移取50微升凝血酶溶液细胞瓶中混合的凝血酶和纤维蛋白原与纤维蛋白原，需要100微升的混合物。

注意 ：荧光聚苯乙烯微球用作内部参考标记，用于图像分析。当混合凝血酶和纤维蛋白原，防止形成气泡，通过仔细地移液混合物。气泡将导致在纤维蛋白凝胶中的孔。

10. 移液器凝胶混合物和Velcro带之间。为血纤维蛋白凝胶的典型的胶凝时间，一旦组件混合，20秒的顺序。

注 ：这样做尽可能快地防止凝胶混合物滴在孔板前。练习使用前细胞和珠。

11. 在湿润的95％空气/ 5％CO ₂培养箱_中在37℃下孵育30分钟的悬浮液允许凝胶化之前添加的培养TM与ACA。
12. 与ACA的第7天，每2-3天更换TM。凝胶是不够稳定，一个星期后要培养无ACA。第一个星期后更换TM每隔2-3天。加入6毫升TM每口井。第12天细胞产生足够的胶原蛋白的可视化。

3。应用应变及诱导变化的应变和约束

1. 静态应变施加直接的细胞，由于细胞的牵引力和压实^12。要诱导胶原蛋白重组，削减组织构建在一个方向从两个尼龙搭扣松动。这将导致在单向约束（ 图1A）。执行第12天，因为结构是不够稳定，胶原蛋白已存入。
2. 应用循环应变与柔性膜的培养板的底部通过施加真空，与使用FLEXCELL的FX4000T系统。板放置在基板上，顶部装载职位（其中的一部分，日ê循环荷载装置）。该泵适用于真空到膜上，从而拉膜在矩形后，躺在下面。由于组织十字形附件构造的膜（通过魔术贴）和矩形柱的施加的循环应变，是单轴晶体的（ 图1B）。
3. 最初，使用静置培养5天，以实现最初的机械完整性，在第6天开始之前应用循环应变。程序一个环状污垢协议到控制器的真空泵。例如，使用先前建立的间歇循环应变协议，与单轴方向^13。由间歇性的菌株，用1赫兹的正弦波，，使劲从0到5％的应变，3小时的期间，交替进行3小时的休息时间。执行此循环应变协议，7天，诱导一个对准胶原组织。
4. 通常生产后12天HVSCs对准胶原蛋白的工作单位名词达到一个对齐的胶原蛋白组织后，更改的单轴循环应变方向，是垂直于原始菌株方向。做到这一点，把矩形职位90°。

4。可视化的细胞与胶原

1. 为了形象化活跃，实时胶原蛋白的重塑，标签样本的探针不干扰细胞活力或胶原蛋白的形成。使用探针的荧光染色的细胞的细胞质和胶原蛋白。
2. 或者二次谐波的产生，使用共聚焦激光扫描显微镜可用于可视化的胶原蛋白的结构^14，自体荧光，激发波长为780纳米和500-550纳米之间的检测。
3. 从安装和孵化器中取出培养板中，在3小时的休息期间的循环应变的样品，并将它们传送到共焦激光扫描显微镜的可视化细胞和胶原。

Representative Results

这个模型系统允许种子培养成肌纤维细胞纤维蛋白凝胶。 图1A显示了一个组织首先培养静态双轴约束下的。组织的约束通过切割纤维蛋白凝胶从两个约束被释放，以创建单轴静态约束，和组织压块和重塑之后（ 图1A）。对于循环应变，组织培养以及静态双轴约束下。 5天之后，可以应用于周期性单轴拉伸（ 图1B）。为了诱导胶原蛋白的重新取向，单轴应变的方向是可以改变的垂直方向（ 图1B）。的微球与凝胶混合物种子，显示的随机图案，这是用来移居到预定义的时间推移成像位置（ 图2），图2A和图2C示出的细胞，胶原蛋白和有孔玻璃珠的图像。这些相同的图像扫描3天（FIGURÉ2B）和2天（ 图2D）后，分别。细胞和胶原模式有所改变，但珠模式被用来搬迁细胞和胶原蛋白。培养了12天的结果足够的数量时，用共聚焦显微镜观察（ 图3和4）中的内源性的胶原蛋白的生产样品。无论是使用静态的或环状的培养结果明显不同的胶原蛋白组织，其中双轴静态培养产生一个随机的胶原蛋白组织（ 图3A）和单轴循环应变施加到对准的胶原蛋白的结构（ 图4A和B中的双轴约束的组织的结果） 。随着时间的推移，这个胶原蛋白组织可以研究，同时改变的静态约束或改变动应变方向。当静态约束改为双轴单轴，胶原取向的变化，从一个随机的方向（ 图3A）对准的方向（ 图3B）。循环应变诱导组织（ 图4A和C）的表面的取向的改变，但后3天，观察到组织的核心没有变化（ 图4B和D）。

图1。培养结构的双轴约束下，重组胶原蛋白（A）释放静态限制在一个方向，或由（B）改变循环应变方向。装载职位由虚线黑线表示。比例尺显示3毫米。

图2。典型的例子，使用胎圈图案移居到预定义的三维位置，在这种情况下，在静态培养样本显示红色，绿色和蓝色的珠子中的胶原蛋白细胞，A和 C显示图像的细胞，胶原蛋白和珠。这些图像扫描3天（B）和后2天（D），分别为。珠子的模式被用来移居细胞和胶原。比例尺表示50微米。

图3，R代表人图像12天静态应变双轴约束（A）和调整由于单轴限制于7天内（B），比例尺表示50微米。

图4。后12天（5天静态的，随后的7天循环应变）的代表图像在表面的循环应变（甲循环应变方向（后12天），在表面重新定向（C）的细胞和胶原的变化，但不改变后的组织（D）的核心能够被看见的后）和〜60微米到组织（B）。 3天。

Discussion

描述的模型系统研究细胞和胶原细胞填充的纤维蛋白结构具有很大的潜力（重新）组织（德容格等^15），如用于组织工程的目的。通过使用作为初始细胞载体的血纤维蛋白，纤维蛋白降解后，组织细胞和内源性矩阵只创建。以这种方式，细胞受到刺激进行反应的应变，无论是静态的或环状的性质，通过施加收缩力^16,17，检测边界^12，刚度或显示菌株避免的。

意义：纤维蛋白结构已被用于研究前胶原（重新）组织^18，但与的能力，应用循环应变和/或研究随时间推移的方式，这两者都是可能的在此方法中的构造。 ¹⁹日前已经使用的尼龙搭扣，这个模型系统中的约束，但结合技术与文化柔性膜板允许应用较长时间的循环应变。培养这些板块允许容易添加和删除介质和可视化的结构同时还连着无菌。这使得学习时间失效，甚至实时的有关重塑过程。

修改和未来的应用：未来的应用程序的系统，可以发现在操纵三维重构过程，例如，通过添加金属蛋白酶或代理人整合组件或信号干扰。下一步，添加剂的应用，系统的模型的组件可以很容易地修改时，研究细胞和胶原组织（重）。不同的细胞源，健康和患病细胞的胶原基质（ 例如，通过改变培养时间）的到期，以及构建体的形状和大小，可适应具体需要。该系统是井的设计其他来源的细胞，代替目前使用的HVSCs uited。我们已经使用这个系统培养内皮细胞集落形成细胞（ECFCs PlosOne，接受出版），在那里我们看到，ECFCs他们生产的胶原蛋白后，不同的循环应变比HVSCs的方向。

的技术的局限性 ：当前的模型系统的一个限制是体积相对较大的组织，当使用15×10 ⁶细胞/ ml的细胞密度时，需要1.5×10 ⁶个细胞每构造。这可能会造成可用的细胞来源少的情况下，将使用中存在的问题。另一个限制是目前的厚度（约1毫米）的结构，这是由于（厚）魔术贴附件。这限制了只有部分的整个样本的共焦扫描。这是可能达到的深度最大为200μm的组织，这是足够的可视化当前组织的核心内的细胞的反应，但ES不会导致全层概述。

关键步骤和故障排除 ：由于模型系统的基础上形成的组织粘扣带附着点之间，这也包括在协议中的关键步骤。正确的切割和胶合是必不可少的，特别应注意小心移取凝胶混合物的组织，这是至关重要的运用循环应变正确连接到尼龙搭扣。进一步的决定性的步骤，可以发现在选择的细胞来源和培养基添加剂。优化时，将需要以不同的细胞来源的培养。目前，结构与ACA培养7天，阻止纤维蛋白降解。甲不同的细胞源也可能会导致在不同的时间帧与胶原形成和纤维蛋白降解方面。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipettes
Advanced DMEM	Gibco	12491
Fetal bovine serum	Greiner	758075
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer and curing agent	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Bioflex culture plates	Flexcell Int	BF-3001U	Untreated
L-Ascorbic Acid 2-phosphatase	Sigma	A8960
ε-Amino Caproic Acid	Sigma-Aldrich	D7754
Bovine thrombin	Sigma	T4648
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630
0.45 syringe filter	Whatmann (Schleicher and Scheul)	10462100
Polystyrene microspheres	Invitrogen	F-8829	Blue fluorescent, 10 μm diameter
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Includes rectangular loading posts
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss		LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode
Amphotericin	Gibco	15290-018	Needed for cell isolation