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Immunology and Infection

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

A Listeria monocytogenes é uma bactéria patogénica gram positiva frequentemente utilizado como um importante modelo para o estudo de parasitismo intracelular. Imagiologia tarde L. monocytogenes fases de infecção dentro do contexto de telas de ARN pequenos interferentes permite o estudo global de vias celulares necessários para a infecção bacteriana de células hospedeiras alvo.

Abstract

Patógenos intracelulares bacterianas podem ser concebidas como ferramentas moleculares para dissecar as cascatas de sinalização celular, devido à sua capacidade de manipular requintadamente e subverter as funções das células que são necessários para a infecção dos tecidos-alvo do hospedeiro. Entre estes agentes patogénicos bacterianos, Listeria monocytogenes é um microrganismo gram-positivo que tem sido usada como um paradigma para parasitismo intracelular na caracterização das respostas imunes celulares, e que tem desempenhado as funções instrumentais na descoberta de vias moleculares que controlam citoesqueleto e membrana dinâmica de tráfico. Neste artigo, os autores descrevem um ensaio microscópico robusto para a detecção de níveis de infecção celular final de L. monocytogenes baseado na marcação fluorescente do inLC, uma proteína bacteriana segregada que se acumula no citoplasma de células infectadas, o ensaio pode ser acoplado a high-throughput telas pequenas automatizados ARN interferentes, de modo a characterize vias de sinalização celular envolvidas no cima ou para baixo-regulação da infecção.

Introduction

A bactéria Gram positiva Listeria monocytogenes é um agente patogénico de origem alimentar que invade células hospedeiras, interrompe a sua internalização vacúolo e replica-se no citoplasma das células hospedeiras 1. L. monocytogenes facilidade de manipulação no âmbito de laboratório (crescimento rápido, uma baixa toxicidade para os indivíduos saudáveis) associada à persistência de traços de virulência da bactéria observadas em modelos celulares e animais (actividade hemolítica, leucocitose) permitiu o seu uso inicial em 1960 como um modelo para a maior o estudo do parasitismo intracelular e para o estabelecimento dos fundamentos teóricos da imunidade celular contra a infecção 2. No final de 1980 e início de 1990, a dissecação do ciclo intracelular bacteriana 3, bem como a caracterização molecular da virulência bacteriana mais importante fatores 4-7 favoreceu o uso de L. monocytogenes como ferramenta molecular chave para a manipulação e cravoy de funções da célula hospedeira. A presença de avirulent (L. innocua) e (L. monocytogenes) espécies virulentas do gênero Listeria pavimentou o caminho para estudos genômicos comparativos 8 que, juntamente com a recente criação da L. completo monocytogenes transcriptoma 9, aumentamos nossa compreensão da evolução de L. Listeria como um patogénico humano e como um sistema modelo para estudos de infecção de 10.

L. monocytogenes induz sua internalização em células hospedeiras após a interação das proteínas da superfície bacteriana inla e inlB com seus receptores da célula hospedeira E-caderina e MET, respectivamente 11-12. Estudos de base candidata inicial levou à identificação de uma ligação cateninas-actina α / β como um componente significativo da via inla-13 e invasão da fosfoinositida 3-quinase (PI 3-K) como um efector crucial do inlB- dependente casca invasãode 14-15. Ensaios de proteômica e baseados em funcional, posteriormente, permitiu a identificação de novos elementos do citoesqueleto 16 e lipídios segundos mensageiros 17 necessários para a invasão da célula hospedeira. Estudos de transcrição 18 e proteômica baseada em espectrometria de massa quantitativos 19 lançaram recentemente uma nova luz sobre a ativação da sinalização de acolhimento cascatas ea repressão da resposta imune durante L. monocytogenes infecção. Biologia de sistemas abordagens baseadas na inativação de grandes conjuntos de genes (kinomes, genomas completos) por pequeno RNA de interferência (siRNA) silenciamento abriram recentemente novos caminhos para a análise do acolhimento global de cascatas de sinalização no contexto de funções celulares específicas, incluindo a fagocitose e patógeno internalização 20. Telas siRNA Genome-wide foram previamente realizados para investigar cascatas celulares necessários para a infecção de L. monocytogenes em fagocitária Drosophila 21-22 células S2, mas este tipo de análise não foi realizada em células não fagocíticas, que representam alvos importantes para a infecção in vivo.

Nós otimizamos um protocolo para a detecção microscópica dos estágios finais da infecção por L. monocytogenes, que é adequada para estudos de alta produtividade siRNA de entrada de bactérias no interior das células epiteliais. Nosso ensaio se aproveita de uma L. altamente invasivo monocytogenes cepa que apresenta uma mutação pontual na PrfA, o principal regulador da transcrição de L. monocytogenes virulência 6: esta mutação (chamado PrfA *) torna PrfA constitutivamente activa 23 e conduz a um aumento da expressão das proteínas de invasão inla inlB e, portanto, favorecer a entrada de bactérias em células não fagocíticas outro modo mal infectados. A nossa leitura de infecção baseia-se na detecção da acumulação citosólica do inLC proteína bacteriana segregada: esta molécula éum efector pleiotrópico que é expressa preferencialmente pelas intra-citoplasmático L. monocytogenes 9 e que não só participa na célula-a-célula bacteriana espalhar 24, mas que também modula as respostas imunitárias do hospedeiro 25. A marcação fluorescente de secreção inLC por bactérias intracelulares não só permite distinguir claramente infectada a partir de células não-infectadas, mas também representa uma leitura de ponto final que pode ser usada para dissecar posteriormente infecção em suas diferentes etapas: entrada, escape vacuolar, citosólica bacteriana proliferação e disseminação célula-a-célula. Este protocolo baseado em microscopia pode ser acoplado a telas de siRNA, por conseguinte, para estudar vias celulares envolvidas na infecção de células hospedeiras por L. monocytogenes.

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Protocol

1. Preparação de culturas celulares e bacterianos, ferramentas de transfecção e Anticorpos Primários

  1. Prepare uma placa de ágar fresco para isolar L. indivíduo monocytogenes colónias a partir de um estoque de glicerol bacteriana (50% glycerol/50% saturada de cultura durante a noite de bactérias líquido) mantida a -80 ° C.
    1. Usando uma cremalheira de alumínio (mantidos à temperatura de -80 ° C) para o transporte de um estoque de glicerol congelado de bactérias, bactérias estrias sobre uma infusão de cérebro e coração (BHI) em placas.
    2. Incubar a placa a 37 ° C durante 48 horas (ou até que as colónias bacterianas individuais podem ser isoladas).
    3. Manter esta placa a trabalhar depois a 4 ° C durante um período máximo de 1 mês (isto irá ser usado para semear culturas líquidas).
    4. Em nosso protocolo, usamos a L. monocytogenes sorotipo 1/2a EGDe.PrfA * estirpe, mas como ilustrado na Figura 1, o L. monocytogenes sorotipo 4b P14.PrfA * tensão dá resultados semelhantes.
  2. EleAs células ATCC CCL2 La são cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) na ausência de antibióticos.
  3. Piscinas independentes de mexidos (controlo) e os anti-Met siRNAs são carregados em 384 placas de cultura de células de microscopia pretas.
    1. Dilui-se 160 pmol de siRNA em 500 mL de água isenta de RNase e adicionam-se 5 ul desta solução por poço (concentração final: 1,6 pmol).
    2. Manter esta placa à temperatura de -20 ° C durante um período máximo de 1 ano.
  4. Os anticorpos policlonais de coelho contra a proteína bacteriana inLC foram obtidos por imunização com uma proteína recombinante inLC-GST, conforme descrito anteriormente 25.

2. Reverter siRNA transfecção celular

  1. 72 horas antes da infecção trazer à temperatura ambiente, uma placa de 384 poços de cultura de células microscopia preto contendo 1,6 pmol siRNA em 5 mL de água livre de RNase em cada poço.
  2. Centrifugar a placa durante 3 minutos a 300rcf à temperatura ambiente para reduzir o siRNA que poderia ter sido depositado nas paredes dos poços.
  3. Prepare a temperatura ambiente DMEM suplementado com 0,4% de Lipofectamine RNAiMAX.
  4. Adicionar 25 ul de meio de transfecção de DMEM / RNAiMAX a cada poço (não incubar o meio de transfecção mais de 20 minutos antes de adicionar o siRNA).
  5. Mover a placa para trás e para misturar o siARN com a solução de transfecção, em seguida, manter a placa durante 1 hora à temperatura ambiente para permitir que os complexos de siRNA-lipofectamina a formar.
  6. Lavar as células HeLa a partir de um balão de cultura de células confluentes ou sub-confluentes, uma vez com 10 ml de 37 ° C pré-aquecido PBS.
  7. Separar as células HeLa pela adição de 1 ml 37 ° C pré-aquecido de tripsina para o frasco de cultura de células e incubar durante 3 a 5 min a 37 ° C.
  8. Re-suspender as células em 10 ml de 37 ° C pré-aquecido DMEM suplementado com 16% de FBS.
  9. Contagem de células e preparar uma suspensão de células de 12.000 células por ml em DMEM suplementado com16% de FBS.
  10. Adicionar 50 ul de suspensão celular a cada poço da placa de 384 poços.
  11. Mova a placa rapidamente para trás e para distribuir as células e deixar as células se acalmar por 10 minutos em temperatura ambiente.
  12. Selar a placa com Parafilm e mantê-la durante 72 horas numa atmosfera húmida de 5% de CO 2 contendo atmosfera a 37 ° C.

3. Infecção Celular e Coloração

  1. O dia antes da infecção, tomar uma única colônia de L. monocytogenes da placa de agar BHI e ressuspender o em 5 mL de meio BHI líquido em um tubo de poliestireno de 15 ml.
  2. Incubar durante a noite a 37 ° C num dispositivo Shacking para permitir o crescimento bacteriano.
  3. No dia da infecção, lave 1 ml durante a noite de L. monocytogenes cultura por centrifugação 2 min a 10.600 rcf em uma centrífuga de mesa.
  4. Descartar o sobrenadante (que contém a citotoxina segregada listeriolisina O) e re-suspender o sedimento em 1 ml de PBS (REPEAt a etapa de lavagem mais 3 vezes).
  5. Ler a densidade óptica a 600 nm bacteriana e estimar o número de bactérias (OD = 1 é equivalente a 1E9 bactérias / ml).
  6. Prepare o adequado L. monocytogenes diluição em DMEM suplementado com FBS a 1%: usando estirpes altamente invasivos como EGDe.PrfA *, sugere-se a utilização de bactérias 5E4 em 30 ul de meio por poço (a multiplicidade da infecção foi calculado como 25 por 2.000 células).
  7. Remover o meio de cultura de células em cada cavidade (80 ul) e substituí-lo por adição de 30 ul do L. monocytogenes contendo meio.
  8. Centrifugar a placa a 200 rcf durante 5 min à temperatura ambiente, para sincronizar o processo de infecção.
  9. Incubar a placa durante 1 hora numa atmosfera húmida de 5% de CO 2 contendo atmosfera a 37 ° C sobre um bloco de alumínio pré-aquecido.
  10. Remover o L. monocytogenes contendo meio de cada poço e adicionar 30 ul de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% FBS e40 ug / ml de gentamicina para matar L. extracelular monocytogenes.
  11. Incubar durante 4 horas em 5% de CO 2 contendo atmosfera a 37 ° C num bloco de metal pré-aquecido.
  12. Prepara-se uma solução de PBS suplementado com 8% de formaldeído (esta solução deve ser preparada de modo a que os monómeros de formaldeído, em vez de os polímeros de paraformaldeído, são utilizados).
  13. Sem descartar o meio de cultura celular, adicionar 30 ul de PBS suplementado com 8% de formaldeído (concentração final: 4%) e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
  14. Retirar o fixador e lava-se as células três vezes com 80 ul de PBS por poço (manter as células num volume final de 80 ul de PBS por poço).
  15. Prepara-se uma diluição de 1:250 de anticorpo de coelho anti-inLC soro em PBS suplementado com 0,2% de saponina.
  16. Adicionar 10 ml da solução de anticorpo primário em cada poço após remoção do PBS e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
  17. Descarte o primárioA solução de anticorpo e lavar quatro vezes com 40 ul de PBS por poço.
  18. Dilui-se a Alexa Fluor 546 acoplado anticorpo secundário anti-coelho (1:250), a solução DAPI (1:1.500) e faloidina-Dy647 (1:150) em PBS suplementado com 0,2% de saponina.
  19. Adicionar 10 ul desta solução de coloração secundária a cada poço e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
  20. Descartar a solução de coloração secundário e lava-se quatro vezes com 40 ul de PBS por poço (deixar um volume final de 40 ul de cada poço e selar a placa).
  21. A placa pode ser fotografada imediatamente ou pode ser armazenada a 4 ° C, protegida da luz (cobrir com folha de alumínio) para análise posterior.

4. Aquisição de Imagem e Análise

  1. Adquirir imagens em três canais diferentes (350 nm, 546 nm e 647 nm) utilizando uma objetiva de 10X montado em um microscópio automatizado (adquirir preferencialmente 9 imagens por bem).
  2. O sinal inLC pode ser medido usando a imagemO software de análise como CellProfiler que permite a segmentação automatizada dos núcleos e corpos celulares utilizando o DAPI e a coloração faloidina, respectivamente.

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Representative Results

Marcação fluorescente de citoplasmática inLC fornece uma leitura robusta para a infecção de células por L. monocytogenes, como ilustrado na Figura 1: a célula central na micrografia é altamente infectados pela estirpe P14.PrfA * 23, uma vez que pode ser observada na imagem de contraste de fase (setas, Figura 1A) e confirma-se por o sinal de DAPI onde bactérias individuais podem ser claramente distinguidos (Figura 1B). A coloração inLC (sobreposta à coloração DAPI na Figura 1C) descreve como esta proteína secretada densamente acumula no citoplasma de células infectadas e que permite a detecção sem ambiguidades da morfologia da célula hospedeira infectada. A coloração do citoesqueleto de actina com faloidina fluorescente (Figura 1D) fornece informação sobre a morfologia da monocamada celular inoculada completa e ilustra ainda como vizinhas não infectadas células (núcleos de células marcadas com um asterisco) do não exibir qualquer rotulagem inLC. Vale a pena mencionar que, uma vez que os níveis de inLC citosólicas são dependentes do número de bactérias citoplasmáticos, notámos uma correlação entre o sinal inLC detectado por imunofluorescência e do número de L. monocytogenes por célula: como observado na Figura 1, as células vizinhas infectadas com baixos números de bactérias exibem uma reduzida coloração inLC qual pode ser quantificada. Interessantemente, é também possível observar que inLC é facilmente detectado nas saliências formadas por bactérias capturadas no processo de disseminação célula-a-célula (Figura 1C) tal como observado também com a coloração de actina (Figura 1D). Digno de nota, as bactérias não são directamente corado no nosso protocolo, mas uma vez que o canal de 488 nm não é usado, L. monocytogenes podem ser marcados utilizando um soro anti-bacteriana específica, caso contrário, as bactérias que expressam GFP podem ser usados ​​alternativamente.

Usando ferramentas de análise de imagem, tais como tCellProfiler ele software público (Broad Institute, www.cellprofiler.org ), é possível para as células do segmento e para medir o sinal inLC em células infectadas individuais, o que pode ser usado para estimar um índice de infecção para uma condição experimental específica. Como mostrado na Figura 2, a marcação dos núcleos com DAPI (Figura 2A) e o citoesqueleto de actina com faloidina (Figura 2C) fornecer a informação necessária para a segmentação celular: os núcleos são utilizados como objectos de referência para a identificação de células individuais (Figura 2B) eo citoplasma é posteriormente identificados usando uma função de propagação dos núcleos que leva em conta o sinal do citoesqueleto (Figura 2D). Finalmente, a intensidade do sinal inLC pode ser quantificada para cada objecto celular identificado (figuras 2E e 2F) para estimar o número deAs células infectadas pelo estabelecimento de um limiar para a intensidade inLC que consideramos como negativo. O índice de infecção é calculado como o número de células infectadas, dividido pelo número total de células na população.

O protocolo pode ser acoplado a telas de siRNA para investigar a função de grandes painéis de moléculas alvo na infecção de células hospedeiras por L. monocytogenes. Controles são necessários para validar a eficiência de transfecção: por exemplo, o siRNA alvejando Kif11 é um controlo vulgarmente utilizado para a transfecção, que leva à morte da célula, e, portanto, a ausência de células no final do ensaio é uma indicação de que a transfecção procedeu eficientemente. Para abordar especificamente a L. monocytogenes processo de invasão, siRNA inactivação do receptor celular Met em células HeLa conduz a uma maior inibição de entrada bacteriana em células hospedeiras e conduz a níveis muito baixos de células inLC-positivos em uma monocamada celular inoculada (Figura3A), em comparação com as células tratadas com um siRNA de controlo scrambled (Figura 3B). A função de moléculas candidatas desconhecidos pode ser investigada com o nosso ensaio utilizando esta molécula celular conhecidos como padrão.

Figura 1
Figura 1. A detecção da marcação inLC em células HeLa infectadas com L. monocytogenes estirpe P14.PrfA *. células HeLa CCL2 foram infectados, tal como descrito em nosso protocolo, processados ​​por imunofluorescência e fotografada usando uma objetiva 63X. (A) imagem de contraste de fase, diversos P14.PrfA * bactérias são indicadas por pontas de seta. (B) coloração DAPI (azul), as mesmas bactérias individuais como em (A) são marcadas por setas. (C) Superposição de coloração DAPI (azul) e doColoração inLC (vermelho), os núcleos das células não infectadas são rotulados por um asterisco. (D) A superposição do inLC (vermelho) e os sinais de actina (verde). Bar:. 5 m Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. Análise de segmentação de células HeLa infectadas com L. monocytogenes estirpe EGDe.PrfA *. células HeLa CCL2 foram infectados, tal como descrito em nosso protocolo, processados ​​por imunofluorescência e fotografada usando uma objetiva de 10X. (A) sinal DAPI. (B) A sobreposição do sinal de DAPI (azul) mostrado em (A) e o sinal de actina (vermelho) apresentada em (C) que mostra a segmentação dos núcleos (view inserção ampliada). (C) sinal de actina. (D) A mesma imagem como (B) mostrando a segmentação das células. (E) sinal inLC. (F) da mesma imagem, como (D), com sobreposição da coloração inLC (amarelo). Bar:. 50 mm Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3
Figura 3. . Variação da rotulagem inLC entre as células inativadas para Met e células controle células HeLa CCL2 foram inicialmente reverter-transfectadas com um pool de quatro siRNAs visando o receptor da célula hospedeira Met; 72 horas após a transfecção, as células foram infectadas como descrito, processadas para imunofluorescência e fotografada usando um objeto 10xIve. (A) Sobreposição do DAPI (azul), actina (vermelho) e inLC (amarelo) em células inativadas por Met. (B) Os mesmos canais como em (a) em matéria de células tratadas com um controle de siRNA mexidos. Bar:. 50 mm Clique aqui para ver maior figura .

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Discussion

Vários parâmetros são fundamentais para o sucesso do nosso protocolo de detecção inLC, incluindo o uso de linhas de células saudáveis ​​que apresentam um número suficiente de citoplasma para permitir uma detecção inequívoca do sinal inLC. No ensaio que apresentamos neste artigo, propomos o uso de células HeLa CCL2, que são particularmente adequados para o nosso ensaio, devido à extensão de seu espaço citosólico; outros clones HeLa como as células HeLa Kyoto exibir um citoplasma menor, mas pode ser usado com nosso protocolo de infecção (células HeLa de Quioto são particularmente bem adaptado para análise de segmentação vez que as células não se sobrepõem com as células vizinhas, o que é frequentemente o caso para as células HeLa CCL2). As células que apresentam uma pequena citoplasma como polimorfonucleares ou macrófagos não são recomendados para uso em combinação com nosso protocolo.

Uma limitação de um protocolo de imagem como a que apresentamos aqui é o facto de que uma quantidade mínima de células deve ser infeCTED, num determinado monocamada em condições de controle, a fim de fornecer o sistema com poder resolutivo bastante: de outro modo, se algumas células são infectadas, torna-se difícil determinar as mudanças nas taxas de infecção, especialmente quando se investiga a função de potenciais candidatos moleculares que são Espera-se reduzir a infecção. Esta limitação representa um verdadeiro problema quando usando células HeLa que expressam Met como o único receptor de superfície para o L. monocytogenes proteína inlB e são, portanto, mal invadida por mais L. monocytogenes cepas. Uma alternativa é a utilização de uma elevada multiplicidade de infecção (MOI> 100), que podem aumentar o número de bactérias invasoras, mas também aumenta o risco de danos nas células devido a níveis mais elevados no meio de cultura de células da poro toxina bacteriana formando listeriolisina O ( LLO), que exibe uma actividade citotóxica muito potente. Outra alternativa é a utilização de estirpes super-invasivos tais como a estirpe EGDe.PrfA * apresentado no nosso protocolo, O que permite a utilização de uma MOI baixo (<25) e reduz a quantidade de efeitos citotóxicos dependentes do LLO; resultados obtidos com um L. monocytogenes estirpe super-invasiva pode ser posteriormente validada utilizando outras estirpes bacterianas menos virulentos em outros tipos de ensaios (ver abaixo). Uma terceira alternativa é a utilização de uma linha de células que expressa tanto diferente de E-caderina e Met: é o caso de linhas de células, tais como as Jeg3 ou BeWo trofoblastos semelhante, ou as células de carcinoma de cólon LoVo, que podem ser invadidos por tanto o das vias de entrada inlB dependentes inla-e; nestas linhas celulares, as taxas mais altas de infecção celular pode ser alcançado usando L. monocytogenes estirpes tais como EGDE, a estirpe parental de EGDe.PrfA *. Deve ser tido em conta, no entanto, que a redundância de funções em ambos os percursos podem levar a efeitos de compensação de um caminho quando um efector é inactivado no outro percurso, tornando a análise de resultados difícil. Também é importante mencionar thaAs células T não deverá ser sobre-infectada, a fim de fornecer o sistema com uma boa gama dinâmica que permite a detecção de eventos que aumentam a infecção: no nosso protocolo particular, a MOI conduz a uma taxa de infecção óptimo de 30%.

Métodos alternativos para estudar a invasão das células hospedeiras por L. monocytogenes incluem o ensaio de invasão gentamicina clássico 26, o qual se baseia na morte de bactérias extracelulares pela adição de gentamicina ao meio de cultura de células, após um período inicial de infecção bacteriana (semelhante ao processo apresentado na primeira parte do nosso protocolo de infecção) e invasão é marcado por plaqueamento das bactérias intracelulares sobreviventes em placas de agar e a contagem do número de unidades formadoras de colónias (CFU), que crescem sobre estas placas. Este método apresenta a vantagem de utilizar a leitura mais directa para a infecção, o que é precisamente o número de bactérias invasivas que, na verdade, estão protegidos contra o tratam gentamicinant no espaço citoplasmático de células hospedeiras, no entanto, este método apresenta uma única leitura para a infecção e uma vez que as células hospedeiras são lisadas para libertar as UFC intracelulares, já não existe um registo para obter informações sobre o estado actual de células no ponto final da experiência. O protocolo baseia-se em um método indirecto, a detecção da proteína inLC segregada, mas como mencionado anteriormente, os níveis de citoplasmática inLC correlacionam-se com o número de citosólica L. monocytogenes (Figura 1). Além disso, a natureza intrínseca do nosso ensaio de microscopia permite estabelecer claramente o estado exacto das células no final da infecção: que pode, por conseguinte, extrair a informação relativa à morfologia celular global, a distribuição do citoesqueleto de actina, a fase do ciclo celular, etc, e executar alto teor A análise da infecção. Uma característica importante que pode ser extraído a partir deste tipo de análise é o contexto da população e a sua influência sobre a infecção: De facto, o trabalho recente de Pelkmans e colaboradores 27 demonstraram que o contexto população particular de uma dada célula (por exemplo, a sua posição a partir da periferia de um grupo de células de uma ilhota) afecta diversas funções celulares, incluindo a endocitose e a susceptibilidade a infecção por vírus. Nosso ensaio apresenta, portanto, o potencial para a extração de informações.

Nosso método apresenta uma vantagem adicional: desde inLC é uma leitura tardia de infecção devido à sua secreção por bactérias citoplasmáticos, sinalizando as vias de acolhimento que afetam os níveis de acumulação inLC em células hospedeiras pode potencialmente afetar não só a entrada de bactérias, mas também escapar vacuolar, a proliferação citosólica e eventualmente célula a difusão celular. Por isso, o nosso processo pode ser usada como uma leitura para a infecção primária global e pode ser acoplado a ensaios secundários para dissecar o passo infecção específica que foi perturbada pela batida primário identificado através de telas de siRNA. Finalmente, é importante referir que o método pode ser totalmente automatizado e upscaled usando dispositivos de lavagem de placas, aumentando, portanto, o número de amostras analisadas em uma única experiência enquanto que a diminuição do nível de variação dos resultados, quando comparados com as experiências realizadas manualmente.

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Disclosures

Não temos nada a divulgar.

Acknowledgments

Pesquisa em P. Cossart laboratório é apoiado pelo Instituto Pasteur, o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, o Institut National de la Recherche Agronomique, ERC avançada Grant (233348), a Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), a Fundação Louis-Jeantet ea Fondation Le Roch Les Mosqueteiros. AK é um beneficiário de uma bolsa de estudos do Pasteur-Paris International University Doutorado Programa / Institut Carnot Maladies Infecciosas. Agradecemos a Jason Mercer para otimizar o protocolo de transfecção celular.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Imunologia Edição 79 HeLa Listeria monocytogenes Gram-positivas Infecções Bacterianas fluorescência de alto rendimento testes de rastreio a interferência de RNA Listeria monocytogenes Infecção microscopia pequeno RNA de interferência

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em
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Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

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