Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Summary

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Abstract

Vielen Geweben, wie die erwachsenen menschlichen Herzen, sind nicht in der Lage nach der Beschädigung ausreichend zu regenerieren. ^2,3 Strategies in Tissue Engineering vorschlagen Innovationen, um den Körper bei der Wiederherstellung und Reparatur zu unterstützen. Zum Beispiel kann TE Ansätze in der Lage, Herz Remodeling nach Myokardinfarkt (MI) zu dämpfen und möglicherweise erhöhen insgesamt die Herzfunktion zu einer fast normalen Pre-MI Ebene. ⁴ Wie bei jedem Funktionsgewebe, eine erfolgreiche Regeneration von Herzgewebe umfasst die ordnungsgemäße Lieferung von mehrere Zelltypen mit Umweltreize Begünstigung Integration und das Überleben der implantierten Zellen / Gewebetransplantat. Löslichen Signale Zell-Zell-Wechselwirkungen und Matrixmaterialien als Lieferfahrzeuge, deren Auswirkungen auf das Überleben der Zelle, der Materialfestigkeit, und Erleichterung der Zell-Gewebeorganisation ausgewertet: mehrere Parameter einschließlich sollte konstruiert Gewebe richten. Studien mit direkten Einspritzen von Transplantat-Zellen nur diese wesentlichen Elemente ignorieren. ^2,5,6Eine Gewebe Design kombiniert diese Zutaten noch entwickelt werden. Hier präsentieren wir ein Beispiel von integrierten Designs mit Schichtung von gemusterten Zellschichten mit zwei verschiedenen Arten von biologischen Materialien, die abgeleitete das Zielorgan Zelltyp und Endothelzellen für die Verbesserung neuer Schiffe Bildung in der "Gewebe". Obwohl diese Studien konzentrieren sich auf die Erzeugung von Herz-ähnliches Gewebe, kann dieses Gewebe Design zu vielen anderen als Herz mit minimalen Design-und Materialwechsel Organe angelegt werden und soll ein Off-the-shelf-Produkt für regenerative Therapien sein. Das Protokoll enthält fünf detaillierte Schritte. Ein temperaturempfindlichen Poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) wird zur Beschichtung Gewebekulturschalen verwendet. Dann werden gewebespezifische Zellen auf der Oberfläche der beschichteten Platten / Mikroflächen kultiviert, um die Zellplatten mit starken seitlichen Adhäsionen bilden. Drittens wird eine Basismatrix für das Gewebe durch Kombination von porösen Matrix mit neovaskulärer Permissi geschaffenve Hydrogele und Endothelzellen. Schließlich werden die Zellschichten von den PNIPAAm beschichteten Schalen angehoben und übertragen zu dem Basiselement, so dass die gesamte Konstruktion.

Introduction

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocol

1. Schaffung PNIPAAm-beschichteten Platten Man löst 2,6 g PNIPAAm in 2 ml einer 60% Toluol / Hexan-Lösung 40%. Das Gemisch wird auf 60 ° C für 10 min gerührt, bis die PNIPAAm gelöst. Cut Filterpapier in ein 60 mm Durchmesser-Kreis und Ort Papier in der Büchner-Trichter. Die Lösung wird über Büchner-Trichter in die vorgewogen Becherglas (keine Kunststoffe, wie Hexan wird Kunststoffschmelze). Das Becherglas und den Inhalt in eine Vakuumglocke (24 psi) O / N (16 …

Representative Results

Das Flussdiagramm (Figur 1) zeigt das gesamte Verfahren zur Herstellung des mehrschichtigen Patch. Zellschichten werden aus dem PNIPAAm behandelte Platte durch Senken der Temperatur unter 32 ° C abgelöst. Dann wird die Zellschicht auf der Oberseite des vernetzten Hydrogels der Endothelzellen in die darunterliegende faserige Matrix (Figur 1) enthält, beimpft platziert. Die vorbehandelten wärmeempfindlichen Platten können auch zur Erzeugung der Zellschichten eingesetzt werden. Sonder…

Discussion

Die kritischen Schritte im Protokoll enthalten: die Beschichtung der Plattenoberflächen mit dem Polymer und thermoresponsiven Manipulation der Zellschichten nach dem Abkühlen der Platten. Da verschiedene Zellen weisen unterschiedliche physikalische Eigenschaften, wie Haftfähigkeit, die Hebezeit sollte für jeden anderen Zelltyp optimiert werden. Die zweite und am meisten deutlich anspruchs Komponente dieses Protokoll, konzentriert sich auf die Manipulation der Zellschicht, ein kritischer Aspekt der Verfahren zur Gewe…

Materials

Table of Reagents:
Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime	————
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Table of Specific Equipment:
Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light.	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42