Ingénierie tissulaire: Construction d'un échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

Summary

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Abstract

Beaucoup de tissus, comme les adultes cœurs humains, sont incapables de se régénérer correctement après dommages. ^2,3 Stratégies en ingénierie tissulaire proposent des innovations pour aider le corps dans la récupération et la réparation. Par exemple, les approches TE peuvent être en mesure d'atténuer le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde (IM) et peut-être augmenter la fonction cardiaque totale à un niveau MI pré proche de la normale. ⁴ Comme avec n'importe quel tissu fonctionnel, réussite de la régénération du tissu cardiaque implique la bonne exécution de plusieurs types de cellules avec des signaux environnementaux qui favorisent l'intégration et la survie de la greffe de cellules / tissus implantés. Tissus d'ingénierie devraient aborder plusieurs paramètres dont: signaux solubles, les interactions cellule-cellule et matériaux de matrice évalués comme les véhicules de livraison, de leurs effets sur la survie de la cellule, la résistance des matériaux, et la facilitation de l'organisation de cellule à tissu. Des études utilisant l'injection directe de cellules du greffon seulement ignorer ces éléments essentiels. ^2,5,6Une conception de tissu combinant ces ingrédients n'a pas encore été développé. Ici, nous présentons un exemple de superposition à l'aide des dessins intégrés de feuilles de cellules à motifs avec deux types de matières biologiques contenant des dérivés du type cellulaire organes cibles et des cellules endothéliales pour l'amélioration de la formation de nouveaux vaisseaux dans le "tissu". Bien que ces études se concentrent sur la production de tissu cardiaque comme, cette conception de tissu peut être appliquée à de nombreux autres organes que le coeur de la conception et matérielles des changements minimes, et est censé être un produit hors-the-shelf pour les thérapies régénératrices. Le protocole contient cinq étapes détaillées. Une température Poly sensible (N de -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) est utilisé pour des boîtes de culture de tissus de la robe. Ensuite, les cellules sont mises en culture tissulaire spécifique sur la surface des plaques revêtues de motif fin / des surfaces pour former des feuilles de cellules avec de fortes adhérences latérales. En troisième lieu, une matrice de base est créé pour le tissu en combinant la matrice poreuse avec Permissi néovasculaireve hydrogels et les cellules endothéliales. Finalement, les feuilles de cellules sont soulevées à partir des boîtes revêtues PNIPAAm et transférées à l'élément de base, ce qui rend l'assemblage complet.

Introduction

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocol

1 Création de plaques PNIPAAm revêtues Dissoudre 2,6 g de PNIPAAm dans 2 ml d'une solution / 40% d'hexane à 60% dans le toluène. Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 10 min sous agitation, jusqu'à ce que l'on dissout PNIPAAm. Couper le papier filtre dans un cercle de 60 mm de diamètre et placez le papier dans l'entonnoir de Büchner. Filtrer la solution à travers un entonnoir de Büchner dans le bécher pré-pesée verre (ne pas utiliser des matière…

Representative Results

Le diagramme de flux (figure 1) illustre le procédé global de fabrication de la plaque à couches multiples. les feuilles de cellules sont détachées de la plaque traitée PNIPAAm en laissant tomber la température en dessous de 32 ° C. Ensuite, la feuille de cellules est placée au-dessus de l'hydrogel réticulé contenant des cellules endothéliales ensemencées sur la matrice fibreuse sous-jacente (figure 1). Les plaques thermo-sensible prétraitées peuvent également être …

Discussion

Les étapes critiques du protocole comprennent: le revêtement des surfaces de la plaque avec le polymère thermosensible et la manipulation des feuilles de cellules après refroidissement des plaques. Parce que les cellules présentent différentes propriétés physiques différentes, comme l'adhésivité, le temps de levée doit être optimisée pour chaque type de cellule différent. La seconde, et la plus significative difficile composante de ce protocole, se concentre sur la manipulation de la feuille de cellul…

Materials

Table of Reagents:
Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime	————
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Table of Specific Equipment:
Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light.	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42