Summary

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

Published: October 03, 2014
doi:

Summary

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Abstract

이러한 성인의 마음으로 많은 조직은 적절하게 손상 후 재생 할 수 없습니다. 조직 공학에서 2,3 전략 복구 및 수리에 몸을 지원하기 위해 혁신을 제안한다. 예를 들어, TE 방식은 심근 경색 (MI) 후 심장 리모델링을 약화 가능성이 거의 정상 사전 MI 수준으로 전체 심장 기능을 향상시킬 수 있습니다. 4, 심장 조직을 성공적으로 재생이의 적절한 전달이 포함 기능적 조직과 마찬가지로 이식 된 세포 / 조직 이식의 통합과 생존에 유리한 환경 단서 여러 세포 유형. 배달 차량, 세포 생존에 미치는 영향, 재료 강도 및 세포 간 조직의 조직의 촉진으로 평가 용해 신호, 세포 간 상호 작용 및 매트릭스 재료 : 엔지니어링 조직은 다음과 같은 여러 매개 변수를 해결해야합니다. 그래프트 세포의 직접 분사 만이 필수 요소를 무시를 이용하는 연구. 2,5,6이 성분을 결합 조직 설계는 아직 개발되어야한다. 여기서, 우리는 "조직"에서 새로운 혈관의 형성을 향상시키기위한 표적 장기 세포 유형 및 내피 세포를 포함하는 생물학적 유래 물질의 두 가지 유형의 패턴 화 된 세포 시트의 레이어를 이용하여 통합 된 디자인의 예를 제시한다. 이러한 연구는 심장과 같은 조직의 생성에 집중하더라도,이 조직 설계는 최소한의 디자인 및 재질 변경 심장 이외의 여러 장기에 적용 할 수 있고, 회생 치료를위한 상용 제품이 될 것을 의미한다. 이 프로토콜은 다섯 자세한 단계가 포함되어 있습니다. 온도에 민감한 폴리 (N의 -isopropylacrylamide) (pNIPAAM은) 코트 조직 문화 요리에 사용됩니다. 이어서, 조직 특이 세포는 강한 횡 유착 세포 시트를 형성하기 위해 코팅 된 플레이트 / 미세 패턴 표면의 표면 상에 배양한다. 셋째, 기본 매트릭스는 신생 혈관 permissi 다공성 매트릭스와 결합하여 조직을 위해 생성 된하이드로 겔과 내피 세포를했습니다. 마지막으로, 세포 시트 pNIPAAM 코팅 접시로부터 해제되어 완전한 구조를 만드는 기본 요소로 전송.

Introduction

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel22 for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocol

pNIPAAM 코팅 된 플레이트의 1 창조 60 % 톨루엔 / 40 % 헥산 용액 2 ㎖에 pNIPAAM의 2.6 g을 녹인다. pNIPAAM이 용해 될 때까지 교반 10 분 동안 60 ° C로 가열하여 혼합합니다. 뷰 흐너 깔때기에 60mm 직경의 원과 장소 종이에 종이 필터를 잘라. 미리 칭량 유리 비이커 흐너 깔때기를 통해 용액 (헥산 플라스틱을 용융하는 바와 같이, 플라스틱을 사용하지 않음) 필터. 벨 진공…

Representative Results

흐름도 (도 1)는 다층 패치를 제조하는 전체적인 방법을 도시한다. 세포 시트를 32 ° C 이하의 온도를 떨어 뜨려 pNIPAAM 처리 플레이트에서 분리된다. 이어서 세포 시트는 기본 섬유 매트릭스 (도 1)로 파종 혈관 내피 세포를 포함하는 가교 된 하이드로 겔의 상단에 배치된다. 전처리 감열 플레이트는 또한 세포 시트를 만드는 데 사용할 수있다. 특별 위상 표면은 특별히 패턴…

Discussion

프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다 thermoresponsive 폴리머 플레이트 표면을 코팅하고 판을 냉각 한 후 세포 시트를 조작. 상이한 셀들이 서로 다른 물리적 특성을 보일 수 있기 때문에, 점착성 같이, 승강 시간은 서로 다른 세포 유형에 대해 최적화되어야한다. 이 프로토콜의 제 2 및 가장 현저 도전 성분은, 세포 시트, 티슈 조립 방법의 중요한 양태의 조작을 중심. 세포 시트의 단일 셀 층은 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by a New Faculty Award II from the California Institute of Regenerative Medicine (CIRM; RN2-00921-1), NIH-funded National Research Award (F32-HL104924), and CIRM Training Grant (TG21163). Materials were provided by: Glycosan Biosystems Inc / BioTime and Dr. Stephen Badylak (University of Pittsburgh)

Materials

Table of Reagents:
Reagent Company Catalogue number Comments
Calcein-AM Invitrogen C3099 Cell tracker / live dye
Lysotracker Red Invitrogen L7528 Cell tracker
Neutral Red Sigma N7005 Visible Cell dye
pNIPAAM Sigma Aldrich 412780250 Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene Sigma Aldrich 244511-1L
Hexane Sigma Aldrich 296090-1L
RAOSMC Lonza R-ASM-580 Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2 Lonza CC-4149 Smooth Muscle Media
HUVEC Invitrogen C-003-5C Human Venous Endothelial Cells
HyStem Glycosan/Biotime ————
Isopropyl alcohol VWR International BDH1133-4LP
Trypsin Corning Cellgro 25-053-C1
PBS Gibco 14287-072
FBS Gibco 16140-071
Table of Specific Equipment:
 Equipment   Company   Catalogue number   Comments (optional) 
 Filter paper   Ahlstrom   6310-0900 
 Buchner Funnel   Sigma Aldrich   Z247308 
 UpCell Plates   Nunc   2014-11 
 UV light.   Jelight Company   UVO Cleaner Model No.42 

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Cite This Article
Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. J. Vis. Exp. (92), e51044, doi:10.3791/51044 (2014).

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