Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

Summary

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Abstract

Muchos tejidos, tales como los corazones humanos adultos, no son capaces de regenerarse adecuadamente después de un daño. ^2,3 Estrategias en la ingeniería de tejidos proponen innovaciones para ayudar al cuerpo en la recuperación y reparación. Por ejemplo, los enfoques de TE pueden ser capaces de atenuar la remodelación cardiaca después de infarto de miocardio (MI) y, posiblemente, aumentar la función total del corazón a un nivel casi normal pre-MI. ⁴ Como con cualquier tejido funcional, regeneración exitosa del tejido cardíaco implica la correcta entrega de los múltiples tipos de células con señales ambientales que favorecen la integración y la supervivencia del injerto de células / tejido implantado. Tejidos reconstituidos deben abordar varios parámetros, entre ellos: señales solubles, interacciones célula a célula, y materiales de matriz evaluados como vehículos de administración, sus efectos sobre la supervivencia celular, la resistencia del material, y la facilitación de la organización de la célula a los tejidos. Los estudios que emplean la inyección directa de células del injerto sólo ignorar estos elementos esenciales. ^2,5,6Un diseño tejido combinando estos ingredientes todavía no se ha desarrollado. A continuación, presentamos un ejemplo de diseños integrados que utilizan capas de láminas de células estampadas con dos tipos distintos de materiales de origen biológico que contenga el tipo de células de órganos diana y las células endoteliales para la mejora de la formación de nuevos vasos en el "tejido". Aunque estos estudios se centran en la generación de tejido de corazón-como, este diseño de tejido se puede aplicar a muchos otros órganos además de corazón con diseño y el material cambios mínimos, y está destinado a ser un producto fuera de la plataforma para las terapias regenerativas. El protocolo contiene cinco pasos detallados. Una temperatura de poli sensible (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) se utiliza para platos de cultivo de tejidos abrigo. Luego, las células específicas de tejidos se cultivan en la superficie de las placas recubiertas / superficies micropatrón para formar láminas de células con fuertes adherencias laterales. En tercer lugar, se crea una matriz de base para el tejido mediante la combinación de matriz porosa con admisible que neovascularhe hidrogeles y células endoteliales. Finalmente, las láminas de células se levantan de los platos recubiertos PNIPAAm y se transfieren al elemento de base, por lo que la construcción completa.

Introduction

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocol

1. Creación de placas recubiertas con PNIPAAm Disolver el 2,6 g de PNIPAAm en 2 ml de una solución de hexano 60% de tolueno / 40%. Se calienta la mezcla a 60 ° C durante 10 min con agitación, hasta que se disuelva el PNIPAAm. Cortar el papel de filtro en un círculo de diámetro 60 mm y coloque el papel en el embudo Buchner. Se filtra la solución a través de un embudo Buchner en el vaso de vidrio previamente pesado (no utilice plásticos, como el hexano se derretirá plást…

Representative Results

El diagrama de flujo (Figura 1) muestra el método general de hacer que el parche de varias capas. Láminas de células se separan de la placa tratada PNIPAAm dejando caer la temperatura por debajo de 32 ° C. A continuación, la lámina de células se coloca en la parte superior del hidrogel reticulado que contiene las células endoteliales sembradas en la matriz fibrosa subyacente (Figura 1). Las placas termo-sensible pretratados también se pueden utilizar para crear las láminas de …

Discussion

Los pasos críticos en el protocolo incluyen: el revestimiento de las superficies de la placa con el polímero termosensible y la manipulación de las láminas de células después de enfriar las placas. Debido a que diferentes células exhiben diferentes propiedades físicas, como la adhesividad, el tiempo de elevación debe ser optimizada para cada tipo celular diferente. El segundo, y más desafiante significativamente componente de este protocolo, se centra en la manipulación de la capa celular, un aspecto crítico…

Materials

Table of Reagents:
Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime	————
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Table of Specific Equipment:
Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light.	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42