Summary
Nevronale plastisitet er en stadig mer anerkjent, men ikke tilstrekkelig forstått funksjonen av mage (GI) tarmkanalen. Her, i eksempelet med menneskelige bukspyttkjertelen lidelser, presenterer vi en in vitro nevroplastisitet analysen for studiet av nevronale plastisitet i mage-tarmkanalen på både morfologisk og funksjonelt nivå.
Abstract
Neuroplasticity er et iboende trekk ved den enteriske nervesystem og gastrointestinal (GI) innervasjon i henhold til patologiske tilstander. Men den patofysiologiske rolle nevroplastisitet i GI lidelser er fortsatt ukjent. Nye eksperimentelle modeller som tillater simulering og modulering av GI nevroplastisitet kan muliggjøre økt forståelse av bidraget av nevroplastisitet særlig GI sykdommer som kreft i bukspyttkjertelen (PCA) og kronisk pankreatitt (CP). Her presenterer vi en protokoll for simulering av bukspyttkjertelen nevroplastisitet under in vitro forhold og med nyfødt rotte dorsal root ganglia (DRG) og myenteric plexus (MP) nevroner. Denne dual-nevron tilnærming ikke bare tillater overvåking av både orgel-egenverdi og-ytre nevroplastisitet, men også representerer et verdifullt verktøy for å vurdere neuronal og glial morfologi og elektrofysiologi. Dessuten blir funksjonell modulering av medfølgende microenviron innholdet for å studere deres IMPACt på nevroplastisitet. Når etablert, bærer den foreliggende neuroplasticity assay potensial til å være anvendbar i studiet av neuroplasticity i enhver GI organ.
Introduction
Endringer i gastrointestinal (GI) nerve morfologi og tetthet har fanget oppmerksomheten til gastroenterologer og patologer i lang tid, men deres relevans for patofysiologien av GI sykdommer forblir ukjent 1-3. Faktisk er flere svært vanlige GI lidelser som gastritt, reflux øsofagitt, kolitt, divertikulitt, og blindtarmbetennelse assosiert med økt innervasjon tetthet i betent vev områdene en. Imidlertid har ingen ekte oppmerksomhet så langt blitt betalt til de mekanismer og betydningen av nevroplastisitet i mage-tarmkanalen. Må morfologisk endrede GI nerver skiller seg fra vanlige GI nerver, dvs. normal tilstand av det enteriske nervesystemet, i form av sin funksjon? Hva er konsekvensene av endrede neuropeptide / nevrotransmitter innhold i plast enteriske nerver? Har perifer nevroplastisitet alltid innebære endret signale til sentralnervesystemet? Og hvor er de sentrale projeksjoner av plast extrinsic GI nervebaner? En lang rekke slike viktige spørsmål kan lett bli generert når man ser på det sparsommelige vår kunnskap om de funksjonelle aspektene av GI nevroplastisitet.
Studiet av GI nevroplastisitet på funksjonelt nivå krever gyldige, reproduserbare og fortsatt lett gjeldende eksperimentelle modeller. I en tid med økende popularitet og aksept av genmodifisert betingede musemodeller (GECoMM), som for in vivo innstillinger bære potensial til å belyse tidligere ukjente fasetter av GI nevroplastisitet på en realistisk måte en. Men, utforming og produksjon av GECoMM koster fortsatt, arbeidskrevende og spesielt tidkrevende. Videre krever de a priori valg av målet for å bli betinget modulert i genetisk manipulert mus (f.eks transgen overekspresjon av nervevekstfaktor / NGF i enteriske epitelceller). Derfor, for desIGN av en vellykket GECoMM, forskere trenger noen indikatorer (f.eks tidligere eksperimentelle data) av et verdig mål, det vil si at molekylet av interesse (her NGF) kan i det minste forventes å utøve noen biologisk relevante effekter på GI nerver.
Slike indikatorer kan lett bli avledet fra tilfredsstillende in vitro-modeller hvor isolerte celle-subtyper fra komplekset mikromiljøet av en in vivo-system kan selektivt cocultured i en heterotypic måte 4-7. Modulering av molekylære mål i en slik heterotypic kultur innstillingen er på gjennomsnittlig teknisk mindre tungvint, raskere, og kan derfor hjelpe til prefiltering mot verdige mål for verifisering i in vivo studier.
Nylig presenterte vi en in vitro nevroplastisitet analysen som er designet for å simulere økt nevral tetthet og hypertrofi av intrapancreatic nerves i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen (PCA) og kronisk pankreatitt (CP) vev. Her ble nevroner avledet fra nyfødt rotte dorsal root ganglia (DRG) eller myenteric plexus (MP) som utsettes for vevsekstrakter fra kirurgisk reseksjon PCA eller CP vev prøver og sammenlignet med de som dyrkes i normal menneskelig bukspyttkjertelen (NP) vevsekstrakter fem. I stedet for vevsekstrakter, kan man også bruke cellelinje supernatants å studere virkningen av utvalgte celletyper på nevroplastisitet. Når den kombineres med et standardisert morfometrisk måling, tillater frem neuroplasticity analysen gyldig, og reproduserbar evaluering av neuronal plastisitet i respons til forskjellige pancreatic microenvironments. Spesielt, gjør det simulering av en) morfologisk nevroplastisitet, dvs. endringer i neurite utvekst, forgrening mønster og nevronale størrelse, og 2) funksjonell nevroplastisitet, dvs. endringer i oppstemthet av perifere nerveceller. Videre har ikke bare perifert (dvs. (f.eks DRG eller andre ordens spinal) nevroner kan inkluderes i foreliggende analyse for å vurdere deres morfologisk og funksjonell reaksjon på forskjellige GI vev innhold. I den aktuelle videoen opplæringen, vi demonstrere den tekniske protokollen for utførelsen av denne analysen og diskutere sine fordeler og svakheter. Videre vil vi presisere anvendelsen av den grunnleggende begrep i denne analysen til studiet av neuroplasticity i enhver GI organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr eksperimentelle prosedyrer i protokollen følge retningslinjene i Technische Universität München, Tyskland dyr omsorg.
En. Media / Extract Forberedelse
- Tissue homogenisering
Kvaliteten av vev homogenisering er kritisk for den etterfølgende påvisning av neuroplastic forandringer i dyrkede nerveceller. Her blir en homogenisator anbefales som muliggjør dissosiasjon vevet uten vesentlig økning av temperaturen på vevet.- Overføring 5 mm x 5 mm x 5 mm terninger av pankreatisk vev direkte fra -80 ° C til flytende nitrogen, og plasser i en fast fase i vevet homogenator. Den ideelle homogenator ville distansere vevet raskt nok, uten å tillate det å defreeze.
- Umiddelbart etter dissosiasjon, resuspendere det faste, pulveraktige homogenat i 300-500 pl av 0,1 x fosfat-bufret saltvann (PBS). Her bør du ikke bruke noen lysis buffer (som RIPA) siden dette kan lyse den nevroner.
- Sentrifuger homogenates i minst 15 minutter ved den maksimale hastigheten på din benk sentrifuge (f.eks 21130 xg). Samle den klare supernatant som representerer vevekstrakt.
- Cellelinje supernatanter
- La cellene av interesse å nå minst 70 - 80% sammenløp i normalt dyrkningsmedium.
- Vanligvis er disse mediene inneholder serumkomponenter og kan utøve ukontrollerbare effekter på nevronale vekst. Derfor, etter å ha nådd den ønskede celletetthet, vaske cellene minst 3x med celle-kultur grade PBS og plassere dem i serumfritt medium (SFM) i inntil 48 timer.
Merk: Her, mener at noen celler (som bukspyttkjertelen stellate celler) kan trenge serum i sin vekstmedier for å opprettholde sin normale tilstand og struktur. I slike tilfeller kan utføre serielle serum-fortynninger i mediet av cellen av interesse for å finne den laveste mulige serum-innhold som er nødvendig for intakt celle function. - Mål proteinkonsentrasjonen av vev homogenat eller celle-supernatanter via Bradford proteinanalyse. Selv om disse verdier varierer avhengig av vev-og celletype, for pankreatiske vevsekstrakter, vil man forvente en konsentrasjon som varierer mellom 5 til 12 pg / mL, og for cellelinje supernatanter mellom 3-8 pg / mL.
2. Delmengde Ekstrakter og Cell Supernatanter
Avhengig av konsentrasjonen som skal anvendes i analysen, bør den endelige konsentrering av ekstraktet eller supernatanten i neuronal medium være 100 pg / ml 5,8.
Merk: I en analyse med nevroner vokser i 500 ul medium i hver brønn av en 24-brønns plate, må man 50 pg protein fra hvert ekstrakt eller supernatant per brønn. Ved en typisk ekstrakt konsentrasjon på omkring 10 mikrogram / mikroliter, ville man trenge 5 pl ekstrakt / supernatant for hver brønn. I hvert setting utført som et tre eksemplarer, ville dette tilsvare 15 mL av ekstrakt / supernatant. For forskjellige vevs-eller celletyper, utføre serielle fortynninger av den endelige ekstrakt eller supernatant konsentrasjon og sammenligne de observerte neurotrofiske effekter mellom forskjellige ekstrakt / supernatant konsentrasjoner.
Tre. Isolering av nerveceller
Når ekstrakt / supernatanten samlingen er ferdig, fortsette med isolering av nerveceller.
- For DRG nevroner, samle cervical å lumbar DRG av nyfødte rotter mellom postnatal dag (P) 2-12 etter halshogging og stereomicroscopic disseksjon av DRG (figur 1A). For å ha tilstrekkelig DRG nevroner for en 24-brønns plate, samle all livmorhals å lumbar DRG av en nyfødt rotte (tilsvarer 52 DRG) per plate.
- Skjær bort den perifere (nevrale) og sentrale anslag (røtter) av DRG ved hjelp av microscissors.
Leaving anslagene på plass hindrer trituration og øker than forurensning risiko for kultur av fibroblaster.
- Skjær bort den perifere (nevrale) og sentrale anslag (røtter) av DRG ved hjelp av microscissors.
- For MP nevroner, klippe bort mesenteriet fra tynntarmen og manuelt og nøye kle av seromuskulære laget av tynntarmen (for en detaljert protokoll på MP isolasjon, se Schäfer et al. 9, Figur 1B). For MP, samle plexus fra to rotter per 24-godt-plate.
Merk: Forsøk å være så skånsom som mulig for å unngå rifter i seromuskulære lag siden de hindrer sin vellykkede separasjon fra tynntarmen. - Samle DRG og seromuskulære sjikt i iskaldt minimalt essensielt medium (MEM) forsynes med gentamicin (20 mg i 500 ml medium) og metronidazol (2.5 mg i 500 ml medium).
- Etter samling av DRG, inkubere dem i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) forsynes med kollagenase type II i 20-30 min. For MP isolasjon, inkuberes i collagetypen mellom 1-3 timer, avhengig av alderav dyret (figur 1C).
- For MP, samle netto-lignende MP Deler under stereomikroskop og overføre til iskald MEM.
- Deretter Triturer DRG og MP gjennom sprøyter med avtagende diameter.
Merk: Overdreven trituration kan ødelegge nervecellene, men mindre de gliaceller celler. - Når mediet som inneholder den DRG-eller MP er blitt uklar, sentrifuger suspensjonen på 93.9 x g i 5 min, kast medium og resuspender i Neurobasal medium (supplert med 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 0,5 mM L-glutamin og 2% B-27).
- Telle det totale antall celler (dvs. nevroner og gliaceller) ved hjelp av en hemocytometer.
Merk: Antallet av nødvendige celler er avhengig av måleparameteren. For kvantifisering av neurite tetthet, man trenger tettere kulturer og dermed et større antall celler enn for måling av neurite utvekst, perikaryonal størrelseog forgrening mønster av individuelle nerveceller. For neurite tetthetsmålinger, bruke f.eks 10 000 celler (nervecellen + gliaceller) / brønn eller 1500 nevroner / brønn. For morfometri på enkelte nerveceller, kort (1 minutt lange) trypsination av celler og såing av 2500 celler / brønn eller 400 nevroner / godt anbefales. Den typiske utbytte av celler oppnådd fra en rotte er rundt 300,000-500,000 celler. - Seed cellene på 13 mm dekkglass som er blitt belagt natten før og toppen av brønnene med Neurobasal medium (supplert med 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 0,5 mM L-glutamin og 2% B-27) (figur 1D).
Bemerk: Bruk poly-D-lysin (40 mg / m 2) eller ornitin-og laminin-belagte (1 mg / ml hver) belagt dekkglass. Cellene fester seg til poly-D-lysin ekstremt raskt, noe som gjør den egnet for eksperimenter hvor mange celler er nødvendig (dvs. neurite tetthetsmålinger). Vedlegg til laminin er generelt litthva svakere, men laminin er en sterk formidler av neurite utvekst. Derfor, for måling på nevronale forgrening og neurite lengde, foretrekker ornitin / laminin-belegg. - La cellene feste til brønnene over natten. På den neste dag, fremstille de ekstrakt-supplert medium (ved en sluttekstrakt / supernatant konsentrasjon på 100 ug / ml).
- Aspirer seeding medium, og utføre en valgfri, veldig skånsom vask med PBS, og deretter sakte pipette ekstrakt / supernatanten-supplert media (figur 1E).
- La cellene vokse i 48 timer. Aspirer media og fikse i 4% paraformaldehyde for farging (figur 1F).
- Utfør dobbelt immunfluorescens flekker ved hjelp av nevron-spesifikke (f.eks beta III-tubulin) og gliaceller spesifikke (f.eks glial fibriallary sure protein / GFAP) markører (figur 1G).
- For morfometri, bruker en invertert lys mikroskop utstyrt med en CCD-kamera i kombinasjon with automatisert programvare som lar deg måle neurite tetthet (se tabell).
- Den neurite tetthet av nevrale kulturer blir målt på 4-5 representative photomicrographs på 200x forstørrelse fra fire forskjellige regioner i tetteste veksten på hver dekkglass ved å legge over en 50 mikrometer x 50 mikrometer rutenett og telle fibertetthet per kvadratmeter målt i de kryssende fibre. Neurite utvekst, mener antall grener pr nervecellen, kan det bety grenen lengde og perikaryonal størrelse måles fra tilfeldig utvalgte 30 ensomme nevroner fra hver dekkglass ved å markere neurites og perikarya (Figur 1H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Morfologisk nevroplastisitet
I den angitte aldersspredningen av nyfødte rotter (P2-12) og seeding tettheter, MP og DRG nevroner allerede bygge tette nevrale nettverk etter 48 timer (Figur 2A). Sammenligning av neurite tetthet mellom nevroner dyrket i PCA, CP, og NP ekstrakter avslører større neurite tetthet av DRG nevroner i PCA eller CP ekstrakter enn i NP ekstrakter (Figur 2A) 5. Vi foretrekker spesielt MP nevroner for målinger på enkelte nerveceller, siden MP nevroner tendens til å lettere ta avstand fra omkringliggende gliaceller celler enn DRG nevroner. Her, MP nevroner dyrket i PCA eller CP ekstrakter også bygge lengre neurites og viser et mer komplekst forgrening mønster enn MP nevroner vokser i NP-ekstrakt som inneholder medium (figur 2B) 5. Fraværet av denne forskjellen i neuronal morfologi indusert av NP, CP, og PCA ekstrakter indikerer et teknisk problem i enssay. I de fleste tilfeller kan dette være på grunn av en) dårlig kvalitet på forberedt ekstrakt på grunn av lang saksbehandlingstid eller 2) på grunn av skade på nervecellene som oppstod under isolasjon prosessen.
Funksjonelle studier
Den neuroplasticity assay bærer høy nok følsomhet for å detektere endringer indusert ved tilstedeværelse eller fravær av visse mål-molekyler av interesse i supplert ekstrakter eller supernatanter. For eksempel blokade av neurotrophic factor Artemin eller nervevekstfaktor fra PCA-celle (PCC) supernatantene ved tilsetning av bestemte blokkerende antistoffer mot NGF eller ved dynabead-indusert nedbrytning av Artemin resulterer i dempning av neuronal nettverksdannelse (figur 2C) 10. I en fersk studie, kan vi vise en svært lik effekt for bidraget fra neurotrophic factor Neurturin til nevroplastisitet i CP i samtidig sammenligning med andre neurotrofiske faktorer som NGF, glial-celle-line-derived neurotrofisk faktor (GDNF) eller transformerende vekstfaktor-beta (TGF-beta) 11.
Gliaceller
Den samme metode kan også anvendes for å vurdere reaksjonen av DRG-assosiert satellitt gliaceller celler eller enterisk gliaceller til de pankreatiske micro innholdet. Faktisk er en av de mest potente effekter av PCA vevsekstrakter ved DRG-eller MP-forbundet gliaceller fremtredende økning i veksten av gliaceller (figur 3) 5. Videre er denne effekten mer uttalt i PCA enn i CP. Her bør man vurdere at spredning av gliaceller bør ikke dømmes basert på absolutte gliaceller teller, men heller på den relative andelen av gliaceller celler til nerveceller (gliaceller-nevron-indeks) 5. Dette er særlig viktig å ta hensyn siden antallet gliaceller celler i disse kulturene er mer vanskelig å kontrollere på grunn av spredning styrken av gliaceller i motsetning til nerveceller.
Figur 1. Skjematisk protokoll av in vitro nevroplastisitet analysen. Den nåværende analysen gjør bruk av nyfødt rotte dorsal root ganglia (DRG) og myenteric plexus (MP) nerveceller for å studere virkningen av pankreas vevsekstrakter eller celle supernatants på neuronal og glial morfologi. DRG oppsamles etter at fremre laminektomi og MP-holdige seromuskulære lag etter reseksjon og mekanisk stripping av tynntarmen (A, B). Etter collagenase type II fordøyelsen, er neuronene sådd i den nødvendige tetthet (se tekst for detaljer) ad dyrket i 24 timer (C, D). Deretter blir den nylagde bukspyttkjertelen (eller fra en hvilken som helst GI organ av interesse) og celleekstrakter supernatanter tilsatt i vekstmediet av neuroner i det tidligere definerte konsentrasjoner (E).Etter 48 timer, er kulturene fiksert i 4% paraformaldehyde og dobbelt immunostained mot nevronale og gliaceller markører (F, G). Den neuronal morfologi, inkludert neurite tetthet, nevrale forgrening mønster og perikaryonal størrelse er målt ved hjelp av en standardisert programvareprotokoll (H). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bukspyttkjertel nevroplastisitet indusert av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen (PCA) og kronisk pankreatitt (CP). Menneske bukspyttkjertelen vevsekstrakter kirurgisk avledet fra normal bukspyttkjertelen (NP), CP eller PCA vev indusere fremtredende forskjeller i neurite tetthet av DRG ne urons (A) og i nevronale forgrening mønster av MP nevroner (b). Her, PCA og CP vevsekstrakter utøve en fremtredende neurotrophic effekt på DRG og MP nevroner. I likhet med vevsekstrakter, også supernatantene av enkelte celletyper (her kreft i bukspyttkjertelen celler / PCC) også bemerkelsesverdig øke neurite tettheten av DRG nevroner (C). Denne økning er imidlertid reversibel når utvalgte neurotrofiske faktorer som artemin (Artn) eller nervevekstfaktor (NGF) er oppbrukt eller blokkert med disse supernatanter. Alle nevroner immunostained mot beta-III-tubulin. Alle bildene på 100X forstørrelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
51049fig3.jpg "/>
Figur 3. Glial reaksjon på bukspyttkjertelen microenviron innholdet. Bukspyttkjertelen vev utdrag fra PCA eller CP vev ikke bare ha en neurotrophic effekt, men også forbedre glial vekst og glial celletall i DRG eller MP kulturer. Gliaceller celler immunostained mot gliaceller markør glial fibrillary surt protein (GFAP). Alle bildene på 200X forstørrelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen er ment å illustrere metodikken bak in vitro bukspyttkjertelen nevroplastisitet analysen som nylig ble utviklet av vår gruppe for å studere mekanismene for nevroplastisitet i PCA og CP fem. Protokollen innebærer en tre-dagers prosedyre som enkelt kan påføres etter at utøveren har fått tilstrekkelig erfaring i isolasjon og kultur av DRG og MP nevroner. Videre representerer det et verdifullt verktøy for å studere samtidig reaksjon av ente og DRG-assosiert gliaceller til bukspyttkjertelen microenviron komponenter.
Etter vår mening, en av de mest interessante funksjonene i denne analysen er dens evne til å oppdage og simulere endringer som oppstår under PCA og CP (dvs. nevrale spirende og hypertrofi) i en forenklet in vitro-innstillingen. Faktisk anvendelse av vevsekstrakter eller celle Supernatanter resultater i endringer i neuronal morfologi which kan detekteres med tilstrekkelig følsomhet ved hjelp av systematisk morfometrisk analyse. Nylig har vi også kunne vise at denne analysen er også følsom for å detektere forskjeller i den neurotrophic potensial av flere cancer enheter i samtidig sammenligning: Når de neurotrofiske attributter av PCA-cellelinjer ble sammenlignet med cellelinjer fra kolorektal kreft, PCA-cellelinjer induserte signifikant større neurite tettheter blant DRG nevroner enn kolorektal kreft linjer åtte. Selv i sammenligningen av endetarms vs tykktarmskreft cellelinjer, tykktarmskreft cellelinjer var dårligere enn endetarmskreftceller i form av deres neuroplastic potensial åtte.
En av de viktigste fordelene med denne analysen er dens lett tilgjengelighet for ikke bare morfometrisk, men også elektrofysiologiske analyser. I motsetning til i situ nevroner i slice forberedelser, opptak fra nevroner i vår analyse innenfor definerte medier eller i enbsence / over-tilstedeværelse av definerte faktorer er teknisk sett ikke krevende, og kan levere verdifull informasjon om rollen av utvalgte molekyler i disse microenvironments på neuronal aktivitet.
Riktignok skal det presenteres analysen ikke anses å være utelukkende begrenset til studiet av spørsmål knyttet til bukspyttkjertelen nevroplastisitet. Neuroplasticity er et fremtredende trekk ved hele mage-tarmkanalen etter patologiske tilstander, som for eksempel inflammatorisk tarm neuropathies 1-3. Alle disse forholdene ble rapportert å være assosiert med endringer i innervation morfologi og endret neuronal aktivitet 1-3. Derfor er det tenkelig å erstatte pancreatic vevsekstrakter eller cellelinjer av de som er avledet fra de tilsvarende vev, og studere deres spesifikke virkning på nerveceller og tilhørende gliaceller. Våre siste analyser på sammenligning av bukspyttkjertelen og kolorektal kreft vev støtter denne oppfatningen åtte. Men det er også sannsynlig å assume at komponenter i ulike vev microenvironments ikke kan indusere så sensitive og representative endringer som vi rutinemessig observerer i bukspyttkjertelen vev komponenter. Derfor anbefaler vi den forrige omfattende vurdering av neuronal morfologi indusert av "positive" kontroll vev (dvs. vev med f.eks histologisk påvist nevrale hypertrofi) versus "negative" kontroll vev (dvs. uten histologiske bevis for nevrale hypertrofi).
Våre tidligere analyser for reaksjonen av gliaceller i denne analysen var begrenset til bestemmelse av glial celletall i forskjellige pankreatiske microenvironments. Gliaceller celler besitter voksende betydning i nevrobiologi siden anerkjennelsen av deres nevrogen potensial og økt interesse for kalsium strømmer langs glial membran 12. Derfor gliaceller celler i denne analysen, er også lett tilgjengelige for ytterligere funksjonelle analyserav nye tilnærminger. Men slike ekstra innovative tilnærminger trenger forrige omfattende validering før deres søknad om videre studier.
Som alle andre eksperimentelle analysen, også present nevroplastisitet analysen bærer noe begrenset sammenlignbarhet av menneskelige vevsprøver innhentet fra forskjellige pasienter som gjennomgår kirurgi. Det er viktig for disse vev å være avledet fra samme vev regioner (f.eks bukspyttkjertelen hodet, fra hovedtumormasse) for pålitelige analyser en. Videre, selv når denne forutsetning oppfylles, ytterligere forskjeller i vev eller tumorbiologi kan ikke utelukkes i betraktning den store variasjon i det biologiske respons-mønster av forskjellige individer 1. For å omgå disse individuelle vev forskjeller, anbefaler vi resultatene av analysen med vev hentet fra så mange pasienter som mulig, det vil si med minst 5 - 10 forskjellige pasienter per enhet.
Som en viktig teknisk aspekt, ønsker vi å trekke oppmerksomhet til rollen som belegg stoffer på nevronale vekst. Som også nevnt ovenfor, vi foretrekker poly-D-lysin for målinger på neurite tetthet, og ornitin / laminin belegg for dem på individuell nevronale forgrening / utvekst mønster. I våre hender, mens måling av neuronal utvekst kan også utføres på poly-D-lysin-belagte overflater, finner vi at denne metode har en tendens til å redusere følsomheten av analysen for de faktiske forskjeller. Derfor bør forskere søker denne analysen sikrer bruken av den optimale beleggmateriale for deres spørsmål av interesse.
Oppsummert mener vi at den present nevroplastisitet analysen representerer et verdifullt verktøy for å oppnå rask og reproduserbar informasjon om nevro-morfologi og nevro-funksjon i ulike vev microenvironments, som demonstrert i eksempelet medpankreas vev. Den følsomme påvisning av forskjeller i neuro-morfologi som induseres av forskjellige pankreatiske vev innholdet understreker in vitro reproduserbarheten av pankreatisk neuroplasticity i human PCA og CP. Fremtidig arbeid skal ta sikte på optimalisert preassay screening av anvendt Supernatantene og ekstrakter for å oppnå best definert media for studier av GI-sykdom-assosiert nevroplastisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser og ingen økonomiske avsløringer.
Acknowledgments
Alle forfattere bidratt til etablering og validering av det fremlagte analysen og til utkastet til manus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13 mm Coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life Sciences | 21103-049 | |
| B-27 Supplement | Gibco/Life Sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life Sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200 U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco/Life Sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
