Summary
Microscopia de lapso de tempo permite a visualização de processos de desenvolvimento. Crescimento ou deriva de amostras durante a aquisição de imagem reduz a capacidade de acompanhar e medir movimentos celulares durante o desenvolvimento de forma precisa. Descreve-se o uso de open source software de processamento de imagem para corrigir desvio tridimensional da amostra ao longo do tempo.
Abstract
A geração de quatro dimensões (4D) de conjuntos de dados confocal; consistindo de sequências de imagens em 3D ao longo do tempo; proporciona um excelente método para capturar comportamentos celulares envolvidos em processos de desenvolvimento. A capacidade de controlar e seguir os movimentos de células é limitado pelos movimentos das amostras que ocorrem devido à deriva da amostra ou, em alguns casos, o crescimento durante a aquisição de imagem. Células de rastreamento em conjuntos de dados afetados pelo desvio e / ou crescimento irá incorporar esses movimentos em qualquer análise da posição da célula. Isto pode resultar no movimento aparente de estruturas estáticas dentro da amostra. Portanto antes de rastreamento de celular, qualquer amostra de desvio deve ser corrigido. Usando o open source Fiji distribuição 1 de ImageJ 2,3 e as ferramentas loci incorporados 4, desenvolvemos o correto 3D deriva plug-in para remover movimento amostra errônea em conjuntos de dados confocal. Este protocolo compensa efetivamente para a tradução da amostra ou alterações no po focalção, utilizando correlação de fase para registrar cada ponto de tempo de um de quatro conjuntos de dados dimensionais confocal, mantendo a capacidade de visualizar e medir movimentos celulares sobre as experiências de lapso de tempo prolongados.
Introduction
Imagiologia confocal é amplamente usado em biologia celular e de desenvolvimento para seguir os movimentos da célula e alterações na morfologia. Capturar uma série de secções ópticas em diferentes planos focais permite a geração de um modelo tridimensional (3D) de uma amostra, que pode ser estendido em quatro dimensões (4D), criando uma série de lapso de tempo de conjuntos de dados 3D. A geração de conjuntos de dados 4D permite a medição detalhada de movimentos e comportamentos celulares. Em experimentos de lapso de tempo de longo prazo, é comum observar o movimento da amostra. Isto pode ser causado por pequenas imprecisões no controlo da fase de hardware e de posições focais. Enquanto em outros casos, a deriva é um resultado de movimentos induzidos pelo crescimento da amostra ou flexibilidade dentro da mídia de montagem da amostra. Existem métodos para compensar ou limitar esses movimentos, incluindo melhorias nos sistemas com foco de hardware e aumento da rigidez do meio de montagem. No entanto, estas abordagens não pode ser aplicado em muitos casos devido à imagiologia set-se obrigados a fornecer as condições adequadas para a manutenção de amostras e crescimento. Soluções de software de código aberto que existem para a correção de movimento em 2D ao longo do tempo, através do uso das StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins no ImageJ ou Fiji, mas estes não podem ser aplicada a conjuntos de dados 4D.
Para corrigir o desvio da amostra, temos desenvolvido um plug-in (Correto deriva 3D) para utilizar a plataforma de processamento de imagens de código aberto, Fiji 1. Nosso plug-in é capaz de realizar o registro de correlação de fase para corrigir movimento que ocorre como resultado da deriva amostra em experimentos de time-lapse tridimensionais. Correlação de fase 6 é um método computacional para determinar a tradução eficiente entre as imagens. O plug-in descrito aqui utiliza a biblioteca fase de correlação desenvolvido por Preibisch et al. 7. Em experiências de multi-canal, o plug-in utiliza um canal para determinaçãone a correção requerida. Esta correcção é aplicada então a quaisquer canais adicionais resultantes, o conjunto de dados de registo do 4D.
No sistema modelo de peixe-zebra é possível realizar imagiologia de lapso de tempo ao longo de um período de várias horas ou mesmo vários dias 8. Um método comum para a montagem do peixe-zebra é para incorporar o embrião vivo anestesiados em baixo agarose ponto de fusão (0,8-1,5%), restringindo seu movimento 9-11. Enquanto o movimento é restringido o crescimento da amostra continua a ocorrer, o que resulta em que as células dentro do campo de vista da posição de deslocamento. A fim de seguir o movimento das células dentro do embrião, é necessário em primeiro lugar para corrigir o movimento de toda a amostra. Este protocolo foi desenvolvido com espécimes de peixe-zebra, e tem sido utilizado para o desenvolvimento de imagem somito 12, mas pode ser aplicada a qualquer conjunto de dados confocal 4D.
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Protocol
1. 4D Time-lapse experimentos com imagens
As definições utilizadas para aquisição de imagem será diferente, dependendo do equipamento utilizado. A capacidade de microscopia confocal para a secção opticamente uma amostra depende de uma série de factores: o comprimento de onda de excitação, o tamanho do furo de pino, abertura numérica da objectiva, o índice de refracção da amostra e do meio no qual a amostra é incorporado. O tamanho do orifício confocal seleccionado irá determinar a espessura da secção óptica recolhido. Um orifício menor produzirá uma secção óptica mais fina aumentando a resolução do eixo z, mas reduzindo a quantidade de luz captada. Um orifício maior irá aumentar a espessura da secção óptica, reduzindo resolução eixo-z, mas aumentando a quantidade de luz captada.
Outros fatores a serem considerados durante a coleta de dados 4D antes de correção incluem:
- Otimizar velocidade de digitalização de remover, ou limite, deriva durante a captura de um único ponto de tempo. Portanto, o tempo necessário para a recolha de imagens deve ser uma pequena fração do intervalo entre os pontos temporais.
- Perfeitamente estruturas repetitivas, ou grelhas, não são adequados como estruturas de registo, uma vez que não é possível determinar a correcção necessária. Contas aleatoriamente distribuídos ou estruturas irregulares permitirá registro inequívoco.
- Se o arrastamento da esperada, aumentar a área de leitura e os limites superiores e inferiores de focagem, a fim de garantir que a área de interesse permanece no interior da pilha de imagens.
- Além de garantir que haja resolução espacial adequada para resolver as estruturas de interesse, definir a taxa de amostragem para fornecer resolução temporal para os eventos dinâmicos em estudo.
Nota: O tempo entre a imagem pontos temporais devem, portanto, ser pelo menos metade do-intervalo de tempo entre eventos repetidos regulares e diminuir para eventos irregulares.
2. Abrindo o confocal Dataset
O pacote de código aberto Fiji é uma distribuição do programa ImageJ, que contém os plug-ins pré-instalados para realizar inúmeros processos em dados coletados a partir de experimentos de microscopia. O software fornece fácil atualização arquitetura plug-in e inclui uma cópia do correto 3D deriva plug-in usado para esse protocolo. O software suporta a importação de uma vasta gama de formatos de imagem de microscopia de propriedade através da utilização de Bio-Formatos de importação plug-in do Aberto da Microscopia Ambiente.
- Instale o programa Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
- Carregue o conjunto de dados adquiridos usando o plugin do Importador LOCI Bio-Formatos.
- Se o conjunto de dados é maior do que a memória alocada para o programa, selecione a opção "Use pilha virtual" dentro da seção de gerenciamento de memória.
3. Correção de Deriva de um objeto 3D em Pós-Processamento
Durante o curso de um lapso de tempo prolongadoexperimentar uma amostra pode mover-se, mesmo quando incorporado. Para corrigir qualquer movimento e para permitir que os eventos de migração fotografada a ser analisada, de pós-processamento de imagens pode ser executada. Todo o processamento pós imagem deve ser claramente descrito na metodologia de qualquer análise derivado deste trabalho.
- Uma vez que o conjunto de dados foi carregado, execute o plug-in correto deriva 3D.
- Se houver vários canais de imagem, selecione o canal a ser usado para registrar as imagens. Este deve, idealmente, representam uma estrutura estática dentro da amostra, em vez de quaisquer elementos migratórias ou móveis. No entanto, se isso não for possível o canal com o mínimo de movimento deve ser escolhido.
- Se a memória RAM disponível no sistema utilizado para esta análise é inferior ao dobro do tamanho do conjunto de dados original, seleccionar a opção de pilha virtual utilização. Isto irá armazenar o hyperstack registrada como uma seqüência de imagens, em vez de salvar o arquivo para a memória RAM.
- Selecione uma pasta para o plug-in de saída individual corrigido imaarquivos Ges. Um arquivo de imagem separado será criado para cada canal em cada posição z.
- O plug-in, em seguida, conduzir uma análise de correlação de fase de pares entre cada ponto de tempo para determinar a necessária correcção que é então aplicada ao conjunto de dados.
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Representative Results
No peixe-zebra em desenvolvimento, as células musculares rápidas fundir em fibras multinucleadas das 19 horas após a fertilização (20 - palco somite) 13. A fim de visualizar o movimento de núcleos e de fusão das células do músculo que efectuados 4D confocal imaging com lapso de tempo utilizando uma estirpe transgénica que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor de actina-α esquelético etiquetar todas músculo As células 14 e injectado ARN que codifica para a proteína fluorescente vermelha mCherry etiquetado com uma sequência de localização nuclear, para etiquetar núcleos. Embriões transgênicos injetados foram montadas em baixo ponto de fusão agarose e uma seqüência de imagens que consiste de 71 seções ópticas capturadas em 2,0 mM intervalos a cada 20 minutos ao longo de um período de tempo de 2 horas. Amostra deriva de cerca de 7 mM foi observada ao longo do curso do experimento lapso de tempo, o que resulta em desfoque das imagens sobrepostas (Figura 1A) e o movimento aparente do nuclei ao longo do tempo (Figura 1B). Aplicação do encaixe pode ser visto para resultar numa sequência de imagem registada (Figuras 1C e 1D).
Figura 1: O protocolo retifica movimento amostra durante a aquisição da imagem no espaço tridimensional imagem de projecção média das projeções máximas de cada momento do conjunto de dados sem correção mostrando músculo específico expressão GFP (A) e seqüência de localização nuclear fundido a mCherry (B).. A extensão desse movimento reduz a capacidade de controlar os núcleos musculares e fusão, e embaçamento da imagem GFP é evidente. As imagens corrigidos resultantes são mostradas em (C) e (D), o que demonstra o registo do conjunto de dados.
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Discussion
A nossa capacidade de usar o software de pós-processamento para corrigir desvio da amostra de conjuntos de dados obtidos a partir de experimentos de microscopia de lapso de tempo prolongados é limitado por uma série de fatores. A capacidade para discernir deriva contra movimento migratório de uma amostra é dependente dos marcadores celulares utilizados. Marcadores celulares que são ou amplamente expressas dentro de uma amostra ou não estão envolvidos em eventos migratórios durante a aquisição de imagem proporcionam a melhor fonte para correção de drift. O plug-in usa um único canal para registrar o movimento entre pontos de tempo e, em seguida, aplica-se esse registro a todos os canais da imagem coletada. Por isso, pode ser vantajoso utilizar dois marcadores fluorescentes em amostras de interesse. Um marcador para as células ou estruturas que serão rastreadas e um segundo marcador, a estruturas de etiquetas que não se espera que migrar para além de deriva durante o experimento. As inscrições podem ser realizadas em conjuntos de dados com um único canal, mas se assim que a maioria dos the os dados devem ser estacionária na imagem com apenas uma pequena proporção esperada de se mover. Se uma grande proporção da imagem se move entre pontos de tempo que o movimento vai ser corrigidos para, em adição a qualquer desvio, o que resulta em uma redução do movimento medido.
O protocolo estabelecido neste manuscrito presume que não existe qualquer movimento entre a primeira e a última secção óptica de cada ponto de tempo individuais. Não é possível corrigir o desvio que pode ocorrer dentro de um único ponto de tempo sem fazer suposições quanto à forma do objeto que está sendo digitalizado. Idealmente os parâmetros experimentais utilizados para a coleta de imagem seria limitar o potencial de movimento para ocorrer dentro de cada ponto de tempo capturado. Assim o tempo tomado para capturar a sequência de imagens devem ser tão curtos quanto possível. O tempo total de uma única aquisição tempo de ponto deve ser uma pequena fração do intervalo entre os pontos temporais.
O método de correlação de fase, queconstitui a base do processo, determina a tradução é necessária para alinhar um ponto de tempo com o seguinte. Importante apenas movimentos de translação são corrigidos e, portanto, para a rotação em torno de qualquer dos eixos (x, y, z) não irá ser corrigido. Para muitas das possíveis causas do desvio, como deriva focal, variação de posição palco, uma tradução vai perfeitamente descrever o movimento. No entanto, se o movimento de rotação da amostra inclui uma tradução não será capaz de descrever a correcção necessária. A correlação de fase continuará a permitir as posições mais semelhantes a determinar e utilizar o melhor tradução, o que resulta em alguma melhoria no registo, mas se havia metodologias alternativas rotação significativas que permitem a utilização de pontos de referência na imagem, seria mais adequado.
O plug-in foi projetado para funcionar com pilhas virtuais, permitindo a visualização e registro de arquivos maior que a memória disponível. Os arquivos são read do disco, conforme necessário para a análise e os resultados do registro salvos no disco como uma seqüência de imagens, em vez de um único arquivo de imagem. Isto permite a utilização de um computador com menos memória RAM do que o tamanho total do conjunto de dados, o tamanho máximo do conjunto de dados, em vez de ser limitado pelo espaço disponível no disco rígido. Como cada ponto de tempo está alinhado com o tempo subseqüente ponto o computador deve ter memória suficiente para abrir dois pontos de tempo e completar a análise de correlação de fase. A capacidade de realizar o registro avançado e análise de correção de amostra usando o software disponível gratuitamente, em sistemas com recursos limitados, abre-se a possibilidade de pós-processamento sofisticado para um público científico mais amplo.
Nós descrevemos o uso do protocolo para corrigir desvio em conjuntos de dados confocal peixe-zebra, mas a abordagem pode ser aplicada aos resultados obtidos usando qualquer tipo de amostra ou sistema de imagem 3D. Como resultado, no futuro, esta técnica também pode ser umpplied para conjuntos de dados obtidos por meio de imagens de ressonância magnética, tomografia projeção ótica, tomografia computadorizada de raios-X e microscopia folha de luz, e outras técnicas de imagem emergentes.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Gaby Martins e os organizadores do workshop EMBO2010 3D Desenvolvimento de imagem onde este trabalho começou e todos os contribuintes para os projetos de Fiji e ImageJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
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