Summary
Time-lapse mikroskopi möjliggör visualisering av utvecklingsprocesser. Tillväxt eller avdrift av prover under bilden förvärvet minskar förmågan att noggrant följa och mäta cellrörelser under utvecklingen. Vi beskriver användningen av öppen källkod bildbehandlingsprogram för att korrigera för tredimensionell prov glida över tiden.
Abstract
Alstringen av fyrdimensionell (4D) konfokala datamängder; bestående av 3D-bildsekvenser över tiden; ger en utmärkt metod för att fånga cellulära beteenden involverade i utvecklingsprocesser. Möjligheten att spåra och följa cellrörelser begränsas av prov rörelser som uppstår på grund av att glida av provet eller, i vissa fall, tillväxt under bildtagning. Spårnings celler i datamängder som drabbats av drift och / eller tillväxt kommer att införliva dessa rörelser i någon analys av cellposition. Detta kan resultera i den skenbara rörligheten av statiska strukturer inom provet. Därför före spårning cell bör alla prov drift korrigeras. Med hjälp av öppen källkod Fiji fördelning 1 av ImageJ 2,3 och de ingående loci verktygen 4, vi utvecklat Rätt 3D drift plug-in för att ta bort felaktiga provrörelse i konfokala datamängder. Detta protokoll effektivt kompenserar för provöversättning eller förändringar i fokus ponings genom utnyttjande fas korrelation för att registrera varje tidpunkt av en fyra-dimension konfokala datauppsättningar under bibehållande av förmågan att visualisera och mäta cellrörelser över utsträckta tidsförlopp experiment.
Introduction
Confocal avbildning används ofta i cell-och utvecklingsbiologi för att följa cellrörelser och förändringar i morfologi. Fånga en serie optiska sektioner vid olika fokalplan tillåter alstring av en tredimensionell (3D) modell av ett prov, som sedan kan förlängas i fyra dimensioner (4D) genom att skapa en tidsförlopp serie 3D-datamängder. Den generation av 4D dataset möjliggör detaljerad mätning av cellrörelser och beteenden. I långtidstidsförlopp experiment är det vanligt att observera provrörelse. Detta kan orsakas av mindre fel i hårdvaran kontrollerar scenen och fokala positioner. Även i andra fall, är drift till följd av rörelser som induceras av prov tillväxt eller flexibilitet i provet montering media. Metoder finns för att kompensera eller begränsa dessa rörelser däribland förbättringar av hårdvara med fokus system och ökad styvhet i monteringsmedel. Dock kan dessa metoder inte tillämpas i många fall på grund av bild set upp krävs för att ge goda förutsättningar för att prover underhåll och tillväxt. Öppen källkod-lösningar existerar för korrigering av rörelsen i 2D med tiden, med hjälp av de StackReg och TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins i ImageJ eller Fiji, men dessa kan inte tillämpas på 4D-datamängder.
För att korrigera för provet drift har vi utvecklat en plug-in (Rätt 3D-drift) för att utnyttja öppen källkod imaging-bearbetning plattform, Fiji 1. Vår plug-in kan utföra faskorrelation registreringen att korrigera rörelser som uppstår till följd av provglidning tredimensionella tidsförlopp experiment. Fas korrelation 6 är ett beräkningseffektiv metod för att bestämma översättningen mellan bilderna. Plugin-programmet som beskrivs här utnyttjar fas-korrelationsbiblioteket utvecklats av Preibisch et al. 7. I flerkanaliga experiment utnyttjar Stick en kanal för att bestämne den korrigering som krävs. Denna korrigering tillämpas sedan på ytterligare kanaler som leder till registrering av 4D dataset.
I zebrafisk modellsystem är det möjligt att utföra tidsförlopp avbildning under en period av flera timmar eller till och med flera dagar 8. En vanlig metod för montering av den zebrafisk är att bädda in den bedövades levande embryo i lågsmältande agaros (0,8 till 1,5%), som begränsar dess rörelse 9-11. Även om rörelsen är begränsad tillväxt av provet fortfarande sker, vilket resulterar i de celler inom synfältet skiftande position. För att följa rörelsen av cellerna inuti embryot är det nödvändigt att först korrigera för förflyttning av hela provet. Detta protokoll har utvecklats med zebrafisk exemplar, och har använts för att bild somit utveckling 12 men kan tillämpas på alla 4D konfokal dataset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 4D Time-lapse avbildning Experiment
De inställningar som används för bildtagning kommer att variera beroende på vilken utrustning som används. Förmågan av konfokalmikroskopi att optiskt sektionen ett prov beror på ett antal faktorer: våglängden för excitation, pinhole storlek, numerisk apertur av målet, brytningsindex av provet och det medium i vilket provet är inbäddad. Storleken på den konfokala hål vald kommer att bestämma tjockleken av det optiska avsnittet uppsamlades. Ett mindre hål kommer att producera en tunnare optisk sektion ökande z-axeln upplösning utan att minska mängden ljus fångas. En större por kommer att öka tjockleken av det optiska avsnittet, vilket minskar z-axeln upplösning men ökar mängden ljus som fångas.
Ytterligare faktorer att beakta vid insamling av 4D-data före korrigering inkluderar:
- Optimera skanningshastighet för att ta bort eller begränsa, glida dnder att fånga en enda tidspunkten. Därför den tid det tar för bildsamling bör vara en liten del av intervallet mellan tidpunkter.
- Perfekt upprepande strukturer, eller galler, är inte lämpliga som strukturer för registrering eftersom det inte är möjligt att bestämma den korrigering som krävs. Slumpmässigt fördelade pärlor eller ojämna strukturer tillåter entydig registrering.
- Om drift förväntas öka skanningsområdet och övre och nedre fokusgränser för att se till det intressanta området förblir i bildstacken.
- Förutom att se till att det finns lämplig rumslig upplösning för att lösa strukturer av intresse, ställa in samplingsfrekvens för att ge tidsupplösning för de dynamiska händelser som studeras.
Notera: Tiden mellan bild tidpunkter bör därför vara minst hälften av tidsintervall mellan regelbundna upprepade händelser och minskar för onormala händelser.
2. Öppna Confocal Dataset
Det öppna källkodspaket Fiji är en fördelning av ImageJ programmet, som innehåller förinstallerade insticksprogram för att utföra ett stort antal processer på data som samlats in från mikroskopi experiment. Programvaran ger lättare Stick uppdatering arkitektur och inkluderar en kopia av Rätt 3D avdrift Stick användas för detta protokoll. Programvaran stöder import av ett brett spektrum av proprietära mikroskopi bildformat med hjälp av Open Mikroskopi Miljös Bio-format import plug-in.
- Installera Fiji programmet (http://fiji.sc/Downloads).
- Ladda förvärvade dataset med hjälp av LOCI Bio-format Importör plugin.
- Om datamängden är större än minnet allokeras till programmet väljer du "Använd virtuell stack alternativet" inom Minneshantering sektionen.
3. Korrigera Drift av ett 3D-objekt i Post Processing
Under en längre tidsförloppexperimentera prov kan röra sig även när inbäddad. För att korrigera varje rörelse och att låta migrationshändelser avbildas som ska analyseras, kan utföras efterbearbetning av bilderna. Alla bild efterbearbetning ska tydligt beskrivas i metodiken för någon analys som härrör från detta arbete.
- När datamaterialet har laddats, kör Rätt 3D drift plugin.
- Om det finns flera bild kanaler, välja den kanal som ska användas för att registrera bilderna. Detta bör helst utgöra en statisk struktur i provet snarare än eventuella flyttande eller rörliga element. Men om detta inte är möjligt kanalen med minsta rörelse bör väljas.
- Om det tillgängliga RAM-minnet om det system som används för denna analys är mindre än dubbelt så stor som den ursprungliga datasetet, väljer att använda virtuell stack alternativet. Detta kommer att lagra den registrerade Hypers som en bildsekvens, snarare än att spara filen till RAM.
- Välj en mapp för plug-in för att mata enskilda korrigerade imaGES filer. En separat bildfil skapas för varje kanal vid varje z läge.
- Insticksprogrammet kommer då att göra en parvis fas korrelationsanalys mellan varje tidspunkt för att bestämma den nödvändiga korrigeringen som sedan appliceras på datamängden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I utvecklingszebrafisk, snabba muskelcellerna smälter in i flerkärniga fibrer från 19 timmar efter befruktning (20 - somit scenen) 13. I syfte att åskådliggöra rörelsen hos kärnor och fusion av muskelceller vi utförts 4D konfokalt tidsförlopp avbildning med användning av en transgen stam som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av skelett α-aktin promotor för att märka alla av muskel celler 14 och injiceras RNA som kodar för det röda fluorescerande proteinet mCherry taggade med en nukleär lokaliseringssekvens, för att märka kärnor. Injicerade transgena embryon monterades i lågsmältande agaros och en bildsekvens som består av 71 optiska sektioner tagna vid 2,0 | im mellanrum var 20 minuter över en 2 timmars-period. Prov drift om cirka 7 nm observerades under loppet av tidsförlopp experiment, vilket resulterar i suddiga de överlappande bilderna (Figur 1A) och skenbar rörelse Nuclei över tid (Figur 1B). Tillämpning av insticksprogrammet kan ses leda till en registrerad bildsekvens (figur 1C och 1D).
Figur 1: Protokollet rättar prov rörelse under bildtagning i det tredimensionella rummet Genomsnittlig projektionsbild av maximala prognoser från varje tidpunkt av den okorrigerade dataset visar muskler specifikt GFP uttryck (A) och nukleär lokaliseringssekvens smält till mCherry (B).. Omfattningen av denna rörelse minskar möjligheten att spåra muskel kärnor och fusion, och sammanblandning av GFP-bilden är uppenbar. De resulterande korrigerade bilder visas i (C) och (D), som visar registreringen av dataset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår förmåga att använda efterbearbetning programvara för att rätta prov drift av datamängder som härrör från längre tidsförlopp mikroskopi experiment begränsas av ett antal faktorer. Förmågan att urskilja drift kontra migrations av ett prov är beroende av de cellulära markörer som används. Cellulära markörer som antingen är allmänt uttryckta i ett prov eller inte inblandade i flytt händelser under bildtagning ger den bästa källan för driftkorrigering. Insticksprogrammet använder en enda kanal för att registrera rörelsen mellan tidpunkter och sedan tillämpar denna registrering för alla kanaler i bilden samlas. Därför kan det vara fördelaktigt att använda två fluorescerande markörer i prover av intresse. En markör för de celler eller strukturer som kommer att spåras och en andra markör, till etikettstrukturer som inte förväntas migrera förutom drift under experimentet. Anmälan kan göras på dataset med en enda kanal, men om så de flesta av thuppgifter för ska stå stilla i bilden med endast en liten andel förväntas flytta. Om en stor andel av bilden rör sig mellan tidpunkter att rörelsen kommer att korrigeras för, förutom att varje förändring, vilket leder till en reduktion i rörelse mäts.
Det protokoll som är etablerad i detta manuskript förutsätter att det inte finns någon rörelse mellan den första och sista optisk sektion av varje enskild tid-punkt. Det är inte möjligt att korrigera för avdrift som kan ske inom en enda tidpunkt, utan att göra antaganden om formen på objektet som skannas. Helst de experimentella parametrar som används för bildsamling skulle begränsa potentialen i rörelse inom varje tidpunkt fångas. Sålunda bör den tid det tar för att fånga bilden sekvensen vara så kort som möjligt. Den totala tiden för en tidspunkt förvärv bör vara en liten del av intervallet mellan tidpunkter.
Fasen korrelationsmetoden, vilketligger till grund för förfarandet, bestämmer översättning erfordras för att justera en tid-punkt med nästa. Viktigt bara translationsrörelser korrigeras för och därmed rotation runt någon av axel (x, y, z) inte kommer att korrigeras. För många av de möjliga orsakerna till drift, såsom fokal drift, scen läge variation, kommer en översättning perfekt beskriva rörelsen. Om provet rörelsen inkluderar rotation en översättning inte kommer att kunna beskriva nödvändiga korrigeringen. Fas-korrelationen tillåter fortfarande den mest liknande positioner som skall fastställas och utnyttja den bästa översättningen, vilket resulterar i en viss förbättring av registreringen, men om det fanns betydande rotation alternativa metoder som medger användning av landmärken i bilden, skulle vara mer passande.
Plugin-programmet har utformats för att arbeta med virtuella stackar som medger visning och registrering av filer större än det tillgängliga minnet. Filer är read från disk som erfordras för analys och resultaten av registreringen sparas till disk som en bildsekvens, snarare än en enda bildfil. Detta möjliggör användning av en dator med mindre RAM än den totala storleken på datamängden, den maximala storleken på datamängden i stället begränsas av hårddiskutrymme. Eftersom varje tidpunkt är i linje med den efterföljande tidspunkt datorn måste ha tillräckligt med minne för att öppna två tidpunkter och slutföra fas korrelationsanalysen. Förmågan att utföra avancerad registrering och provkorrigering analys med hjälp av fritt tillgänglig programvara på system med begränsade resurser, öppnar upp möjligheten för avancerad efterbearbetning till en mycket bredare vetenskaplig publik.
Vi har beskrivit användning av protokollet för att korrigera drift i zebrafisk konfokala dataset men metoden kan tillämpas på resultat som erhållits med hjälp av någon typ av prov-eller 3D-bildsystem. Som ett resultat i framtiden denna teknik även skulle kunna vara enpplied till datamängder som erhållits med hjälp av magnetisk resonanstomografi, optisk projektion tomografi, röntgen datortomografi, och lätt blad mikroskopi, och andra nya avbildningstekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Gaby Martins och arrangörerna av EMBO2010 3D Develop Imaging workshop där arbetet påbörjades och alla bidragsgivare till Fiji och ImageJ projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
