Summary
Time-lapse mikroskopi tillader visualisering af udviklingsprocesser. Vækst eller afdrift af prøver under billedet erhvervelse reducerer evnen til præcist at følge og måle celle bevægelser under udvikling. Vi beskriver brugen af open source billedbehandling software til at korrigere for tredimensionelle prøve afdrift over tid.
Abstract
Den generation af fire-dimensionelle (4D) konfokal datasæt; bestående af 3D billedsekvenser over tid; giver en fremragende metode til at indfange cellulære adfærd involveret i udviklingsprocesser. Evnen til at spore og følge celle bevægelser er begrænset af prøve bevægelser, der opstår på grund af udflytningen af prøven eller, i nogle tilfælde, vækst i løbet billede erhvervelse. Sporing af celler i datasæt ramt af afdrift og / eller vækst vil indarbejde disse bevægelser i enhver analyse af celle position. Dette kan resultere i den tilsyneladende bevægelse af statiske strukturer inden prøven. Derfor forud for celle tracking, bør enhver prøve afdrift rettes. Brug af open source Fiji fordeling 1 ImageJ 2,3 og monterede loci værktøjer 4, har vi udviklet den rigtige 3D afdrift plug-in for at fjerne fejlagtige prøve bevægelse i konfokal datasæt. Denne protokol effektivt kompenserer for prøve oversættelse eller ændringer i fokal position ved at udnytte fase korrelation til at registrere hver gang-punkt i en fire-dimensional konfokale datasæt samtidig bevare evnen til at visualisere og måle celle bevægelser over længere tid-lapse eksperimenter.
Introduction
Konfokal billeddannelse er almindeligt anvendt i celle-og udviklingsmæssige biologi til at følge celle bevægelser og ændringer i morfologi. Optagelse af en række af optiske sektioner ved forskellige fokale planer muliggør generering af en tredimensional (3D) model af en prøve, som derefter kan udvides i fire dimensioner (4D) ved at skabe en tidsforskudt serie af 3D datasæt. Den generation af 4D datasæt muliggør detaljeret måling af celle bevægelser og adfærd. I langsigtede tidsforskudte eksperimenter er det almindeligt at observere prøve bevægelse. Dette kan være forårsaget af mindre unøjagtigheder i hardware kontrollerende scenen og fokuspositioner. Mens der i andre tilfælde afdrift er et resultat af bevægelser induceret ved vækst prøve eller fleksibilitet i prøven monteringsmedium. Metoder eksisterer for at kompensere eller begrænse disse bevægelser, herunder forbedringer af hardware fokus systemer og øget stivhed i montage medium. Dog kan ikke anvendes disse tilgange i mange tilfælde på grund af billedbehandling set op forpligtet til at give gunstige betingelser for prøver vedligeholdelse og vækst. Findes open source softwareløsninger til korrektion af bevægelse i 2D over tid, gennem brug af StackReg og TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins i ImageJ eller Fiji, men disse kan ikke påføres 4D datasæt.
For at korrigere for prøven afdrift har vi udviklet et plug-in (Korrekt 3D afdrift) for at udnytte open source-imaging-behandling platform, Fiji 1. Vores plug-in er i stand til at udføre fase korrelation registrering til at korrigere bevægelse, der opstår som følge af en prøve afdrift i tredimensionelle tidsforskudte eksperimenter. Fase korrelation 6 er en beregningsmæssige effektiv metode til at bestemme oversættelse mellem billederne. Den plug-in her beskrevne udnytter fase korrelation bibliotek er udviklet af Preibisch et al. 7.. I multi-kanal eksperimenter, plug-in anvender en kanal til beslutsomhedne den nødvendige korrektion. Denne korrektion er derefter anvendt til yderligere kanaler, der resulterer i registreringen af 4D datasættet.
I zebrafisk modelsystem er det muligt at udføre time-lapse billeddannelse over en periode på mange timer eller endda adskillige dage 8. En almindelig metode til montering af zebrafisk er at indlejre bedøvet levende foster i agarose med lavt smeltepunkt (0,8-1,5%), der begrænser dens bevægelse 9-11. Mens bevægelse er begrænset vækst af prøven stadig forekommer, hvilket resulterer i celler i synsfeltet skiftende position. For at følge bevægelsen af celler i embryonet er det nødvendigt først at korrigere bevægelse af hele prøven for. Denne protokol blev udviklet med zebrafisk prøver, og er blevet anvendt til billedet somite udvikling 12, men kan anvendes på enhver 4D konfokal datasæt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. 4D Time-lapse Imaging Eksperimenter
De indstillinger, der bruges til billedbehandling Købet vil variere afhængigt af det anvendte udstyr. Evne konfokal mikroskopi til optisk sektion en prøve afhænger af en række faktorer: bølgelængden af excitation, pinhole størrelse, numeriske åbning af målet, brydningsindeks af prøven og det medium, hvori prøven er indlejret. Størrelsen af konfokal hul valgte bestemme tykkelsen af den optiske sektion opsamlet. En mindre pinhole vil producere en tyndere optisk del øge z-aksen opløsning, men at reducere mængden af lys fanget. En større pinhole vil forøge tykkelsen af den optiske sektion, reducere z-aksen opløsning, men forøgelse af mængden af lys fanget.
Yderligere faktorer at overveje, under indsamlingen af 4D data før korrektion omfatter:
- Optimer scanningshastighed til at fjerne eller begrænse afdrift dnder erobringen af en enkelt gang-point. Derfor den tid, det tager for billedsamling bør være en lille brøkdel af intervallet mellem tidspunkter.
- Perfekt gentagne strukturer, eller gitre, er ikke egnede som strukturer til registrering som det ikke er muligt at bestemme den nødvendige korrektion. Tilfældigt fordelte perler eller ujævne strukturer tillader utvetydig registrering.
- Hvis der forventes afdrift, øge scanningsområdet og øvre og nedre fokus grænser med henblik på at sikre det område af interesse forbliver inden for billedstak.
- Ud over at sikre, at der er passende rumlig opløsning til at løse strukturer af interesse, skal du indstille samplingfrekvens for at give tidsmæssig opløsning for de dynamiske begivenheder bliver undersøgt.
Bemærk: Tiden mellem billed tidspunkter bør derfor være mindst halvdelen af tidsintervallet mellem almindelige tilbagevendende begivenheder og falde for uregelmæssige begivenheder.
2.. Åbning af Confocal Dataset
Den open source-pakken Fiji er en fordeling af ImageJ programmet, som indeholder præ-installerede plug-ins til at udføre en lang række processer på data indsamlet fra mikroskopi eksperimenter. Den software giver lettere plug-in update arkitektur og indeholder en kopi af det rigtige 3D afdrift plug-in bruges til denne protokol. Softwaren understøtter import af en bred vifte af beskyttede mikroskopi billedformater gennem brug af Open Microscopy Miljøs Bio-formater import plug-in.
- Installer Fiji-programmet (http://fiji.sc/Downloads).
- Læg den erhvervede datasæt ved hjælp af loci Bio-formater Importør plugin.
- Hvis datasættet er større end hukommelsen er afsat til programmet, skal du vælge "Use virtuel stak option" i Memory management sektion.
3.. Korrektion Drift af et 3D-objekt i Post Processing
I løbet af en forlænget time-lapseeksperimentere en prøve kan bevæge sig, selv når indlejret. For at rette enhver bevægelse og tillade migrationshændelser afbildet der skal analyseres, kan efterbehandling af billederne skal udføres. Alle billede efterbehandling skal være klart beskrevet i metoden til enhver analyse stammer fra dette arbejde.
- Når datasættet er indlæst, skal du køre den korrekte 3D afdrift plugin.
- Hvis der er flere billedfiler kanaler, skal du vælge den kanal, der skal bruges til at registrere billederne. Dette bør ideelt udgøre en statisk struktur i prøven snarere end nogen migrerende eller mobile elementer. Men hvis dette ikke er muligt, bør vælges, kanal med mindst bevægelse.
- Hvis den tilgængelige RAM på systemet, der anvendes til denne analyse er mindre end to gange størrelsen af det oprindelige datasæt, vælg brug virtuel stak mulighed. Dette vil gemme den registrerede hyperstack som en billedsekvens, snarere end at gemme filen til RAM.
- Vælg en mappe til plug-in til output individ korrigeret imaGES filer. En separat billedfil vil blive oprettet for hver kanal i hver z position.
- Dette plugin vil derefter foretage en parvise fase korrelationsanalyse mellem hver gang-point til at bestemme den nødvendige korrektion, som derefter anvendes på datasættet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I udviklingslandene zebrafisk, sammensmelte hurtige muskelceller i flerkernede fibre fra 19 timer efter befrugtning (20 - somite etape) 13.. For at visualisere bevægelsen af kerner og fusion af muskelceller vi udført 4D konfokal time-lapse billeddannelse under anvendelse af en transgen stamme, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af skelettets α-actin promotor for at mærke hele musklen celler 14 og injiceret RNA, som koder for den røde fluorescerende protein mCherry markeret med en sekvens kernelokaliseringssekvens at mærke kernerne. Injicerede transgene embryoner blev monteret i agarose med lavt smeltepunkt og et billede sekvens bestående af 71 optiske sektioner taget med 2,0 um mellemrum hver 20 minutter over en 2 timers tidsrum. Prøve afdrift på ca 7 um blev observeret i løbet af den time-lapse eksperiment, hvilket resulterer i sløring af overlappende billeder (figur 1A) og tilsyneladende bevægelse af nukleotiderei over tid (figur 1B). Anvendelse af plugin kan ses at resultere i et registreret billede sekvens (figur 1C og 1D).
Figur 1: Protokollen afhjælper prøve bevægelse under billedet erhvervelse i tre-dimensionelle rum Gennemsnitlig projektion image maksimale projektioner fra hvert tidspunkt af den ikke-korrigerede datasæt viser muskel specifik GFP udtryk (A) og sekvens kernelokalisering fusioneret til mCherry (B).. Omfanget af denne bevægelse reducerer evnen til at spore muskel kerner og fusion, og sløring af GFP-billedet, er indlysende. De resulterende korrigerede billeder er vist i (C) og (D), hvilket viser registreringen af datasættet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores evne til at bruge post-processing software til at korrigere prøve afdrift af datasæt stammer fra udvidede time-lapse mikroskopi eksperimenter er begrænset af en række faktorer. Evnen til at skelne afdrift versus vandrende bevægelse af en prøve er afhængig af de cellulære markører, der anvendes. Cellular markører, der enten almindeligt udtryk i en prøve eller ikke er involveret i vandrende begivenheder i billedet købet give den bedste kilde til afdrift korrektion. Dette plugin bruger en enkelt kanal til at registrere bevægelse mellem tidspunkter og derefter anvender denne registrering til alle de kanaler i billedet opsamlet. Derfor kan det være fordelagtigt at anvende to fluorescerende markører i prøver af interesse. En markør for celler eller strukturer, der vil blive sporet, og en anden markør, at mærke strukturer, der ikke forventes at migrere bortset fra afdrift under eksperimentet. Tilmelding kan foregå på datasæt med en enkelt kanal, men i så fald de fleste af the data bør være stationær i billedet med kun en lille andel forventes at bevæge sig. Hvis en stor del af billedet bevæger sig mellem tidspunkter at bevægelsen vil blive korrigeret for ud over enhver tendens, hvilket resulterer i en reduktion i bevægelsen måles.
Protokollen er etableret i dette manuskript forudsætter, at der ikke er nogen bevægelse mellem den første og sidste optisk afsnit af hver enkelt gang-point. Det er ikke muligt at korrigere for afdrift, der kan forekomme inden for en enkelt gang punkt uden at antagelser med hensyn til formen af det objekt, der scannes. Ideelt set ville de eksperimentelle parametre, der anvendes til billedsamling begrænse mulighederne for bevægelse for at forekomme inden for hver gang-point fanget. Således tid at tage billedet sekvens bør være så kort som muligt. Den samlede tid for en enkelt gang-point erhvervelse bør være en lille brøkdel af intervallet mellem tidspunkter.
Fasen korrelation metode, somdanner grundlag for den procedure, bestemmer oversættelse påkrævet for at justere én gang-punkt med den næste. Vigtigere kun translationelle bevægelser er korrigeret for, og derfor rotation omkring nogen af aksen (x, y, z) vil ikke blive korrigeret. For mange af de mulige årsager til afdrift, såsom brændvidde afdrift, scene position variation, vil en oversættelse perfekt beskrive bevægelsen. Men hvis prøven bevægelighed omfatter rotation en oversættelse ikke vil være i stand til at beskrive den nødvendige korrektion. Den fase-sammenhæng vil stadig give de mest lignende stillinger, der skal bestemmes, og udnytte den bedste oversættelse, hvilket resulterer i en vis forbedring i registreringen, men hvis der var betydelige rotation alternative metoder tillader anvendelse af landemærker i billedet, ville være mere passende.
Den plug-in er designet til at arbejde med virtuelle stakke tillader visning og registrering af filer, der er større end den tilgængelige hukommelse. Filer er read fra disken som kræves til analyse, og resultaterne af registreringen gemmes på disken som en billedsekvens, snarere end en enkelt billedfil. Dette tillader brug af en computer med mindre RAM end den samlede størrelse af datasættet, den maksimale størrelse på datasættet i stedet at være begrænset af den plads på harddisken til rådighed. Som hver gang-point er på linje med den efterfølgende tid-point computeren skal have nok hukommelse til at åbne to tidspunkter og fuldføre fase korrelationsanalyse. Evnen til at udføre avanceret registrering og prøve korrektion analyse ved hjælp af frit tilgængelig software, på systemer med begrænsede ressourcer, åbner mulighed for avancerede efterbehandling til en meget bredere videnskabelig publikum.
Vi har beskrevet brugen af protokollen at korrigere afdrift i zebrafisk konfokal datasæt, men denne metode kan anvendes på resultater opnået ved hjælp af enhver form for prøve eller 3D-billedbehandling system. Som et resultat i fremtiden denne teknik også kunne være enpplied til datasæt opnået ved hjælp af magnetisk resonans, optisk projektion tomografi, røntgen computer tomografi, og lys ark mikroskopi, og andre nye billeddannende teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Gaby Martins og arrangørerne af EMBO2010 3D Developmental Imaging workshop, hvor dette arbejde begyndte, og alle bidragyderne til Fiji og ImageJ projekter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
