Summary
Time-lapse microscopie kan de visualisatie van ontwikkelingsprocessen. Groei of drift van monsters tijdens beeldacquisitie vermindert het vermogen om nauwkeurig te volgen en te meten cel bewegingen tijdens de ontwikkeling. We beschrijven het gebruik van open source software voor beeldverwerking om te corrigeren voor driedimensionale sample drift in de tijd.
Abstract
Het genereren van vierdimensionale (4D) confocale datasets; bestaande uit 3D-beeld reeksen in de tijd; biedt een uitstekende methode om cellulaire gedrag betrokken zijn bij ontwikkelingsprocessen te vangen. Het vermogen om te volgen en volgt celbewegingen wordt beperkt door monster bewegingen die door drift van het monster of, in sommige gevallen, groei in beeldacquisitie optreden. Tracking cellen in datasets die door drift en / of groei zal deze bewegingen op te nemen in de analyse van de cel positie. Hierdoor kan de schijnbare beweging van statische structuren in het monster. Derhalve vóór cell tracking, moet een monster drift worden gecorrigeerd. Met behulp van de open source Fiji verdeling 1 van ImageJ 2,3 en de opgenomen LOCI hulpmiddelen 4 hebben we de juiste 3D drift plug-in ontwikkeld om foutieve monster verkeer weg in confocale datasets. Dit protocol effectief compenseert proefvertaling of wijzigingen in focale poling door gebruik te maken van fase correlatie met elke keer-punt van een vier-dimensionale confocale datasets registreren met behoud van de mogelijkheid om te visualiseren en meten celbewegingen over langere time-lapse experimenten.
Introduction
Confocale beeldvorming wordt veel gebruikt in de cel-en ontwikkelingsbiologie naar cel bewegingen en veranderingen in morfologie volgen. Vastleggen van een reeks optische secties verschillende beeldvlakken maakt het genereren van een driedimensionaal (3D) model van een monster, dat vervolgens in vier dimensies (4D) kan worden verlengd door een time-lapse reeks 3D datasets. De generatie van 4D datasets maakt gedetailleerde meting van cel bewegingen en gedragingen. In lange-termijn time-lapse experimenten is het gebruikelijk om monster beweging waarnemen. Dit kan worden veroorzaakt door kleine onnauwkeurigheden in de hardware controle podium en focale posities. Terwijl in andere gevallen drift is een gevolg van veranderingen geïnduceerd door groei monster of flexibiliteit in het monster fixeermiddelen. Methoden bestaan om te compenseren of te beperken deze bewegingen, waaronder verbeteringen aan de hardware focussen systemen en verhoogde stijfheid van de montage medium. Echter, deze benadering kan niet worden vaak toegepast vanwege de beeldvormende set up nodig om geschikte omstandigheden voor de monsters onderhoud en groei. Open source software oplossingen bestaan voor de correctie van de beweging in 2D in de tijd, door het gebruik van de StackReg en TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins in ImageJ of Fiji, maar deze kan niet worden toegepast 4D datasets.
Om te corrigeren voor de steekproef drift hebben we een plug-in (Correct 3D drift) om de open-source imaging-processing platform, Fiji 1 voort te brengen. De plug-in kan fase correlatie registratie uit te voeren beweging die optreedt als gevolg van drift monster in driedimensionale time-lapse experimenten corrigeren. Fase correlatie 6 is een computationeel efficiënte methode om de vertaling tussen de beelden te bepalen. De plug-in beschreven gebruikt de fase-correlatie bibliotheek ontwikkeld door Preibisch et al.. 7. In multi-channel experimenten, de plug-in maakt gebruik van het ene kanaal naar determinantenne de benodigde correctie. Deze correctie wordt dan toegepast om extra kanalen waardoor registratie van de 4D dataset.
In de zebravis modelsysteem is mogelijk tot time-lapse imaging gedurende vele uren of zelfs meerdere dagen 8. Een veelgebruikte methode voor het monteren van de zebravis is om de narcose levend embryo te bedden in laag smeltpunt agarose (0,8-1,5%), het beperken van de beweging 9-11. Terwijl beweging beperkt groei van het monster blijft voordoen, waardoor de cellen in het gezichtsveld verschuiven positie. Om beweging van de cellen te volgen binnen het embryo moet eerst corrigeren voor beweging van het gehele monster. Dit protocol werd ontwikkeld met zebravissen specimens, en is gebruikt om het somite ontwikkeling 12 maar kan worden toegepast op elk 4D confocale dataset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 4D time-lapse imaging Experimenten
De instellingen die worden gebruikt voor het overname zal verschillen afhankelijk van de gebruikte apparatuur. Het vermogen van confocale microscopie optisch gedeelte een monster hangt af van een aantal factoren: de golflengte van excitatie, pinhole grootte numerieke apertuur van het objektief, de brekingsindex van het monster en het medium waarin het monster is ingebed. De grootte van de confocale pinhole geselecteerde dikte van het optische gedeelte verzameld bepalen. Een kleinere pinhole een dunnere optische gedeelte vergroten van de z-as resolutie, maar verminderen de hoeveelheid licht opgevangen produceren. Een grotere pinhole zal de dikte van de optische sectie te verhogen, waardoor z-as resolutie, maar verhogen van de hoeveelheid licht opgevangen.
Bijkomende factoren om te overwegen tijdens het verzamelen van 4D gegevens voor correctie zijn:
- Optimaliseer scansnelheid te verwijderen, of te beperken, drift dijdens de vangst van een enkele keer-punt. Daarom is de tijd die de foto collectie zou een kleine fractie van het interval tussen tijdstippen zijn.
- Perfect herhalende structuren of roosters, zijn niet geschikt als structuren te vullen omdat het niet mogelijk is om de vereiste correctie te bepalen. Willekeurig verdeeld kralen of ongelijke structuren zullen eenduidige registratie mogelijk te maken.
- Als drift wordt verwacht, verhoogt het scangebied en de bovenste en onderste limieten aandacht om ervoor te zorgen het gebied van belang blijft in het beeld stapel.
- Naast de zorg voor de nodige ruimtelijke resolutie om de structuren van belang op te lossen, stelt de sampling rate naar temporele resolutie zorgen voor de dynamische gebeurtenissen wordt bestudeerd.
Opmerking: De tijd tussen het tijd-punten moet daarom ten minste de helft van de tijd-interval tussen regelmatige herhalende gebeurtenissen en neemt als gevolg van onregelmatige gebeurtenissen.
2. Openen van de confocale Dataset
Het open source pakket Fiji is een verdeling van de ImageJ programma, dat vooraf geïnstalleerde plug-ins om talrijke processen uitvoeren op gegevens verzameld uit microscopie experimenten bevat. De software biedt eenvoudig plug-in-update architectuur en bevat een kopie van de juiste 3D drift plug-in gebruikt voor dit protocol. De software ondersteunt de import van een breed scala van eigen afbeelding microscopie formaten door het gebruik van de Open Microscopie Milieu Bio-indelingen importeren plug-in.
- Installeer de Fiji-programma (http://fiji.sc/Downloads).
- Laad de verkregen dataset met behulp van de LOCI Bio-indelingen Importeur plugin.
- Als de dataset is groter dan het geheugen aan het programma toegewezen, selecteert u de "Use virtuele stack optie" in de sectie Geheugen management.
3. Corrigeren Drift van een 3D-object in de nabewerking
In de loop van een langere time-lapseexperimenteren een monster kan bewegen, zelfs wanneer ingesloten. Om beweging te corrigeren en om de migratie gebeurtenissen afgebeeld te analyseren, kan de nabewerking van de beelden worden uitgevoerd. Alle beeldverwerking gewerkt moet duidelijk worden beschreven in de methodologie van de analyse zijn afgeleid van dit werk.
- Zodra de dataset is geladen, voert u de juiste 3D-drift plugin.
- Als er meerdere kanalen van de afbeelding, selecteert u het kanaal dat moet worden gebruikt om de beelden te registreren. Dit zou idealiter vertegenwoordigen een statische structuur binnen de steekproef in plaats van dat een trekkende of mobiele elementen. Indien dit niet mogelijk het kanaal met de minste beweging moet worden gekozen.
- Als de beschikbare RAM-geheugen op de voor deze analyse systeem is minder dan twee keer de grootte van de originele dataset, selecteert u het gebruik virtuele stack optie. Dit zal de geregistreerde HyperStack te slaan als een sequentie van beelden, in plaats van het opslaan van het bestand naar RAM.
- Selecteer een map voor de plug-in om de productie individueel gecorrigeerd imaGES-bestanden. Een aparte image-bestand gemaakt voor elk kanaal bij elke z positie.
- De plug wordt dan een paarsgewijze fase correlatieanalyse tussen elk tijdpunt voeren om de gewenste correctie die vervolgens wordt aangebracht op de dataset te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de ontwikkeling van de zebravis, snel spiercellen smelten tot meerkernige vezels vanaf 19 uur na de bevruchting (20 - somiet fase) 13. Om de beweging van kernen en fusie spiercellen we uitgevoerd confocale 4D time-lapse beeldvorming met behulp van een transgene stam die groen fluorescent proteïne (GFP) tot expressie brengt onder controle van het skelet α-actine promoter om alle spier label visualiseren cellen 14 en geïnjecteerd RNA dat codeert voor het rood fluorescerend eiwit mCherry gelabeld met een nucleaire lokalisatie sequentie, om kernen te labelen. Geïnjecteerde transgene embryo's werden in een laag smeltpunt agarose en een sequentie van beelden, bestaande uit 71 optische secties vastgelegd op 2,0 micrometer tussenpozen elke 20 minuten op een 2 uurs-periode gemonteerd. Voorbeeld drift van ongeveer 7 urn werd waargenomen in de loop van de time-lapse experiment, waardoor vervaging van de overlappende beelden (figuur 1A) en de schijnbare beweging van de nuclei in de tijd (Figuur 1B). Toepassing van de plugin kan worden gezien om te resulteren in een geregistreerd beeldsequentie (figuren 1C en 1D).
Figuur 1: Het protocol rectificeert monster beweging tijdens Gemiddeld projectie beeld van maximale projecties van elk tijdstip van de niet-gecorrigeerde dataset toont spier specifieke GFP expressie (A) en nucleaire lokalisatie gefuseerd tot mCherry (B) beeld acquisitie in de driedimensionale ruimte.. De mate van deze beweging vermindert het vermogen om de spier kernen en fusie volgen en vervaging van het beeld GFP blijkt. De resulterende gecorrigeerde beelden worden getoond in (C) en (D), waaruit de registratie van de dataset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ons vermogen om post-processing software gebruiken om monster drift van datasets afkomstig van langere time-lapse microscopie experimenten corrigeren wordt beperkt door een aantal factoren. De mogelijkheid om drift onderscheiden versus migratiestroom van een monster is afhankelijk van de cellulaire merkers gebruikt. Cellulaire merkers die ofwel op grote schaal worden uitgedrukt in een monster of zijn niet betrokken in het vreemdelingenrecht gebeurtenissen tijdens beeldacquisitie bieden de beste bron voor drift correctie. De plugin gebruikt een enkel kanaal op het verkeer tussen tijdstippen registreren en past deze registratie voor alle kanalen van de verzamelde beeld. Daarom kan het voordelig zijn om twee fluorescente markers in monsters van belang. Een marker voor de cellen of structuren die worden bijgehouden en een tweede markering, etiket structuren die niet verwacht wordt afgezien van drift migreren tijdens het experiment. Registratie kan worden uitgevoerd op datasets met een enkel kanaal, maar als dus de meerderheid van the gegevens moeten stationair in het beeld met slechts een klein deel waarschijnlijk beweegt. Wanneer een groot deel van het beeld beweegt tussen tijdstippen die beweging zal worden gecorrigeerd voor, naast eventuele drift, waardoor een vermindering van de beweging gemeten.
De in dit manuscript vastgesteld protocol veronderstelt dat er geen beweging tussen de eerste en de laatste optische gedeelte van elk tijdpunt. Het is niet mogelijk om drift corrigeren die optreden binnen een tijdpunt zonder veronderstellingen betreffende de vorm van het object dat wordt gescand. Idealiter zou de experimentele parameters die worden gebruikt voor het verzamelen zou de kans op verplaatsing kunnen optreden binnen elke keer-punt veroverd te beperken. Dus de tijd die de afbeeldingen vastleggen moet zo kort mogelijk zijn. De totale tijd van een tijdpunt acquisitie moet een klein deel van het interval tussen tijdstippen zijn.
De fase correlatie methode,vormt de basis van de procedure bepaalt het benodigde een tijdpunt brengen met de volgende vertaling. Belangrijk is alleen translaties zijn gecorrigeerd voor en dus rotatie rond een van de assen (x, y, z) worden niet gecorrigeerd. Voor veel van de mogelijke oorzaken van drift, zoals focale drift, podium positie variatie, zal een vertaling perfect beschrijven de beweging. Indien het monster beweging bevat rotatie een vertaling niet in staat zijn de noodzakelijke correctie beschrijven. De fase-correlatie nog steeds mogelijk de meest vergelijkbare functies te bepalen en de beste vertaling, waardoor enige verbetering in de registratie, maar als er aanzienlijke rotatie alternatieve methoden die het gebruik van mijlpalen in het beeld, zou meer geschikt.
De plug-in is ontworpen om te werken met virtuele stapels waardoor de weergave en registratie van bestanden die groter zijn dan het beschikbare geheugen. Files zijn read vanaf schijf als voor de analyse en de resultaten van de registratie schijf opgeslagen als een sequentie van beelden, in plaats van een beeldbestand. Dit maakt het gebruik van een computer met minder RAM dan de totale grootte van de gegevensverzameling, de maximale grootte van de dataset plaats beperkt door de schijfruimte beschikbaar. Aangezien elk tijdpunt is uitgelijnd met de volgende keer-punt moet de computer voldoende geheugen beschikbaar is om twee tijdstippen openen en vullen de fase correlatieanalyse hebben. De mogelijkheid om geavanceerde registratie-en steekproefcorrectie analyses uit te voeren met behulp van vrij beschikbare software, op systemen met beperkte middelen, opent de mogelijkheid van geavanceerde post-processing om een veel breder wetenschappelijk publiek.
We hebben het gebruik van het protocol beschreven om drift te corrigeren in de zebravis confocale datasets, maar de aanpak kan worden toegepast op de resultaten verkregen met behulp van een soort monster of 3D imaging systeem. Door in de toekomst deze techniek ook kan eenpplied datasets verkregen met behulp van magnetische resonantie imaging, optische projectie tomografie, x-ray computertomografie, en licht blad microscopie, en andere opkomende beeldvormende technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij willen Gaby Martins en de organisatoren van de EMBO2010 3D Developmental Imaging werkplaats waar dit werk begonnen en alle medewerkers aan de Fiji en ImageJ projecten bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
